Nghiên cứu phát hiện đồng thời 3 GEN VRRA, CAPA,PAGA của vi khuẩn than (bacillus anthracis) bằng phản ứng multiplex PCR

VIỆN DẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI GEN VRRA, CAPA, PAGA CỦA VI KHUẨN THAN (BACILLVS ANTHRACIS) BẰNG PHẢN ỨNG MULTIPLEX - PCR Người hưóng dẫn : PGS TS NGHIÊM NGỌC MINH Sinh viên thực : ĐINH THỊ HIÈN Lớp : 11 - 02 HÀ NÔI - 2015 Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội LỜI CẢM ƠN! Trước hết, tơi xin bày tó lịng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nghiêm Ngọc Minh, người thầy tâm huyết tạo điều kiện cho tơi thực tập phịng Cơng nghệ sinh học Môi trường thuộc Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa Học Công Nghệ Việt Nam Thầy ln tận tình hướng dan, dành thời gian trao đoi, định hướng động viện, nhác nhở dìu dal tơi q trình nghiên cứu, học tập hồn thành khóa luận Tơi xin gửi lời cảm on chân thành đen toàn thê anh chị phịng Cơng nghệ sinh học Mơi trường, đặc biệt ThS Nguyễn Thị Hoài Thu KS Phạm Thùy Linh giúp đỡ, chi báo tận tình cho tơi suất q trình học tập nghiên cứu hồn thành khóa luận Bên cạnh đó, tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội với Ban lãnh đạo viện Công nghệ sinh hục, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo diều kiện giúp đỡ suốt thời gian học tập, nghiên cứu trường viện Cuối cùng, xin gửi tời căm ơn chân thành sâu sac tới gia đình bạn bè động viên, giúp đỡ vật chất lẫn tinh thần đê tơi có thê hồn thành tot khóa luận Một lần xin chân thành cám ơn! Hà Nội, ngày tháng Sinh viên Đinh Thị Hiền năm 2015 Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẤT i DANH MỤC HÌNH ii DANH MỤC BẢNG iii ĐẶT VÁN ĐÊ PHẦN I: TÓNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh than 1.1.1 Sơ lược bệnh than 1.1.2 Các dạng bệnh than ỉ ỉ.2.1 Bệnh than thể da 1.1.2.2 Bệnh than the tiêu hóa họng - quản 1.1.2.3 Bệnh than hô hấp 1.1.2.4 1.2 Bệnh than màng não Bệnh than chiến tranh sinh học 1.1.3 Trực khuẩn thẸ|w.íf4ện y.jện {>ạị.^ạe M4-H-à-Nệl' 1.2.1 Lịch sử phát 1.2.2 Đặc điểm cùa B anthracis 1.2.2.1 Hình 1.2.2.2 Đặc điểm nuôi cay .10 1.2.2.3 Sức đề kháng 12 1.2.2.4 Kháng nguyên 12 1.2.2.5 Độc lực 13 1.2.2.6 Khá gây bệnh cho người độngvật 14 1.2.3 1.2.3 Đặc điểm hệ gen cùa B anthracis .15 Ỉ.Gen chromosome 15 1.2.3.2 Gen plasmid 16 1.3 Các phưomg pháp chẩn đoán B anthracis 17 1.3.1 Phương pháp trực tiếp 17 1.3.2 Phương pháp nuôi cấy 18 1.3.3 Các phương pháp chẩn đoán nhanh 18 1.3.4 Phương pháp PCR - Multiplex PCR 19 PHÀN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 22 2.1 2.2 Vật liệu, trang thiết bị dụng cụ nghiên cứu 22 2.1.1 Vật liệu 22 2.1.2 Hóa chất, máy móc thiết bị 22 Các phưong pháp nghiên cứu 26 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 26 2.2.2 Các phương pháp nghiên cứu 26 2.2.2.1 Thiết kế mồi cho phân ứng PCR 26 2.2.2.2 Tách chiết DNA tông so cùa vi khuân than 27 2.2.23 Kỹ thuật PCR đon moi (Polymerase Chain Reaction) 28 2.2.2.4 Kỹ thuật PCR đa mồi (Multiplex PCR) 30 2.2.2.5 Phương pháp điện di DNA gel agarose 32 2.2.2.Ó Phương pháp tinh DNA từ gel agarose 33 2.2.2.7 Phương pháp giải trình tự .34 PHÀN III: KÉT ịVÀ Í^ẲpiệỊỉ^ạị.Ịìẹe.MỚ-Hà-NệÌ' 35 3.1 Kết thiết kế cặp mồi 35 3.2 Tách chiết DNA tổng số từ mẩu vi khuẩn than (Bacillus anthracis) 35 3.3 Kết khuếch đại gen vrrA, capA, pagA B anthracis kỹ thuật PCR 36 3.3.1 Gen VrrA .37 3.3.2 Gen pagA 37 3.3.3 Gen CapA 38 3.4 Tinh sản phẩm PCR 39 3.5 Xác định trình tự so sánh ngân hàng gen 39 3.6 Multiplex PCR phát đồng thòi gen vrrA, capA, pagA 42 PHÀN IV: KÉT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ 44 KÉT LUẬN 44 KIẾN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHŨ VIẾT TẮT pl, ml, Microliter, milliliter, liter B anthracis Bacillus anthracis Bp dH2O Deion water DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid EF Edema Factor Epp kDa Eppendorf LF LethalFactor mg,g Milligram, gram NCBI Base pair (cặp base) Kilo Dalton Thư viện Viện E National Center.forBiotechnology Information PA Protective Antigen PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic Acid TAE Tris - Acetate - EDTA Taq DNA polymerase Thermus aquaticus DNA polymerase iii DANH MỤC HÌNH Tên hình Trang Hình 1.1: Biếu bệnh than thể da người Hình 1.2: Trung thất dãn hít phải bào tứ than Hình 1.3: Não người bị nhiễm bệnh than Hình 1.4: B anthracis bào tử .10 Hình 1.5: Bào tứ cùa B anthracis 10 Hình 1.6: Khuẩn lạc B anthracis môi trường thạch máu cừu 11 Hình 1.7: Khuẩn lạc B anthracis môi trường Sodium bicarbonat agar 12 Hình 1.8 VỊ trí gen pagA plasmid pOX 17 Hình 2.1: Sơ đồ bước thực trình nghiên cứu 26 Hình 3.1: Điện di kiểm tra sàn phẩm tách DNA tổng số cùa vi khuẩn than 36 Hình 3.2: Điện di đồ sán phấm PCR gen vrrA từ vi khuần than 37 Hình 3.3: Điện di đồ sàn pham PCR gen pagA từ vi khuẩn than 38 Hình 3.4: Điện di đồ^sẩA phầrh PCRgtìi cởpA kptì khuẩn tỉtẳnù.ọ 38 Hình 3.5: Sàn phàm PCR sau tinh 39 Hình 3.6: Trình tự gen PagA.POXIcùữ vi khuẩn than 40 Hình 3.7: Trình tự gen CapA.POX2 vi khuẩn than .41 Hình 3.8: Trình tự gen VrrA vi khuẩn than 42 Hình 3.9: Điện di dồ sản phấm khuếch đại đồng thời gen từ vi khuân than bang phàn ứng Multiplex PCR 43 iv DANH MỤC BẢNG Tên bảng Trang Báng 2.1: Danh mục hóa chất sử dụng 22 Bảng 2.2: Các dung dịch đệm sử dụng phịng thí nghiệm 23 Bảng 2.3: Danh mục máy móc thiết bị sử dụng 24 Bảng 2.4 Thành phần phản ửng PCR đơn mồi 29 Báng 2.5 Chu trình nhiệt phán ứng PCR đơn mồi 30 Bàng 2.6 Thành phần phàn ứng Multiplex - PCR 31 Bàng 3.1: Trình tự cặp mồi thiết kế để khuếch đại gen vi khuẩn than ' : 35 Báng 3.2: Báng so sánh độ tương đồng gen pagA.POXl B anthracis nghiên cứu với số chùng B anthracis ngân hàng gen giới (NCBI) 40 Bàng 3.3: Bảng so sánh độ tương đồng gen CapA.POX2 B anthracis nghiên cứu với số chúng B anthracis ngân hàng gen giới (NCBI) 41 Bảng 3.4: Bảng so sánh độ tương đồng gen VrrA B anthracisnghiêncứu với số chùng B antlưacis ngân hàng gẹn thếgiới (NCBI) 42 V PHÀN III: KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết thiết kế cặp mồi Dựa trình tự gen cần phát vi khuan than ngân hàng gen NCBI kết hợp với công cụ thiết kế mồi NCBI Chúng lôi lựa chọn cặp mồi phù hợp, đảm băo gen VrrA, capA, pagA có kích thước khác nhận biết rõ ràng ban điện di gel agarose Các cặp mồi dược chọn có chiều dài, nhiệt độ nóng chảy mồi tương tự nhau, khơng có tượng kẹp tóc, tự bắt cặp mồi khơng có tượng bất cặp bố sung mồi xuôi với mồi ngược (băng 3.1) Báng 3.1: Trình tự cặp mồi thiết kế để khuếch đại gen cùa vi khuân than Gen Kích Tổng số Trình tự(5‘-3‘) base Tm AG hairpin thước Thư viện Viện Đại học M( (Hà N )i CTGTAAGCCCTGTCGTCGAA-F 59.76 20 VrrA CCTCGCGCACTTCTTTTTCT-R AGCCTGTATCCACCCTCACT-R >0 751 0 59.13 AAATGGAGCACGGCTTCTGA-F PagA (bp) 59.26 3.2 Tách chiết DNA tổng số từ mẫu vi khuẩn than (Bacillus anthracis) Với mẫu vi khuẩn than cung cấp bới Học Viện Quân Y, tiến hành tách chiết DNA tong so theo nguyên tắc: 35 Phá vỡ màng tế bào màng nhân cúa vi khuẩn Loại bỏ thành phần không mong muốn mầu protein, polysaccharide Tủa DNA làm DNA Quy trình tách chiết thực mục 2.2.2.1 Sàn phẩm DNA tồng số thu sau tách chiết điện di kiềm tra gel agarose 1% Kết trình bày hình 3.1 sau: Hình 3.1: Điện di đồ sán phẩm DNA tống số cùa vi khuấn than 1,2,3: DNA tổng số chủng vi khuẩn than Ba 1.4, Ba 1.2, Ba 1.1 Ket điện di hình 3.1 cho thấy, DNA tống số vi khuấn than cá giếng sáng, rõ đủ điều kiện để làm khuôn nhân gen cho kĩ thuật PCR Multiplex PCR Chúng sử dụng chùng vi khuấn than Nên chọn DNA tống số mẫu Bal cho nghiên cứu 3.3 Kết khuếch đại gen vrrA, capA, pagA B anthracis kỹ thuật PCR Chúng thực phản ứng PCR đơn mồi khuếch đại gen vrrA, capA, pagA đê kiềm tra có mặt gen quan tâm độ đặc hiệu cặp mồi cho việc nhân gcn đơn lè Phàn ứng PCR đơn mồi giúp tìm nồng độ thành phan 36 chu kỳ nhiệt cho phàn ứng khuếch đại gen, từ phục vụ cho việc đưa quy trình Multiplex PCR thích hợp để phát đồng thời gen Thành phần phàn ứng PCR chu kì nhiệt trình bày mục 2.2.2.3 Khi có sán phẩm PCR chúng tơi tiến hành kiểm tra sản phấm PCR phương pháp điện di gel agarose 2% Ket quâ the hình 3.2, hình 3.3 hình 3.4 3.3.1 Gen VrrA Gcn VrrA (222bp) nằm chromosome cùa B anthracis mã hóa cho protein có tên glutamine, trọng lượng phân từ khoảng 30kDa Chúng sứ dụng cặp mồi bảng 2.4 dế nhân gen VrrA với thành phần phàn ứng bàng 2.5 Sán phẩm PCR đoạn DNA rõ nét, đặc hiệu, có kích thước khoảng 222 bp thể điện di đồ hình 3.2 Thư \ iện Viện DạiB M Hà Nội -222bp - Hình 3.2: Điện di đồ sàn phấm PCR gen vrrA từ vi khuẩn than M: Thang DNA chuẩn lOObp.l: Đối chứng âm, 2: Sản phẩm PCR khuếch đại gcn vrrA 3.3.2 Gen pagA Sử dụng cặp mồi tương ứng cho gen pagA bâng 3.1 tính tốn nồng độ thích hợp cho thành phần phán ứng PCR Ket khuếch đại gcn pagA thê hình 3.3 sau: 37 -751bp Hình 3.3: Điện di đồ sàn phẩm PCR gcn pagA từ vi khuấn than M: Thang DNA chuấn 100 bp.l: Đối chứng âm,2: Sán phấm PCR khuếch đại gen pagA Kết hình 3.3 cho thấy, gen pagA (751 bp) xuất băng vạch đặc hiệu, rõ đẹp khơng có băng vạch phụ nào, có kích thước theo tính tốn lý thuyết thiết kế mồi 3.3.3 Gen CapA Với trình tự cặp mồi ttìi^Lbàỵ-lỊ-ong bảng 3.1, phàn ứng PCR có the giúp khuếch đại gen đích tương ứng tạo lý thuyết băng DNA có kích thước khoang 610 bp ~61Obp Hình 3.4: Điện di đồ sàn phàm PCR gen capA từ vi khuân than M: Thang DNA chuẩn 100 bp,l: Đối chứng âm, 2: Sán pham PCR khuếch đại gen CapA 38 Kết hình 3.4 cho thấy, gen CapA (610 bp) xuất băng vạch đặc hiệu, cặp mồi sử dụng đặc hiệu chu trình nhiệt mà chúng tơi đưa thích hợp 3.4 Tinh sản phẩm PCR Sau chạy PCR, mẫu thu bị lẫn tạp primer, dNTP dư Những chất lẫn tạp có khả ánh hưởng đến phán ứng giái trình tự Đế loại bỏ chất lẫn tạp, chúng tơi tiến hành tinh sản pham PCR kít tinh Bioneer Sau đó, sản phẩm thu kiểm tra gel agarose 2%, kết thể hình 3.5 sau: M: Thang DNA 100 bp; 1: gen vrM, 2: gen capA, 3: gen pagA 3.5 Xác định trình tự so sánh ngân hàng gen Sau tinh sản phấm PCR điện di kiềm tra, chúng tơi tiến hành xác định trình tự nucleotide cúa gen máy ABI PRISMK 3100 Avant Genetic Analvzer Sau có trình tự chúng tơi tiến hành so sánh mức độ tương đồng cùa gen vrrA, capA, pagA vi khuẩn than nghiên cứu với kết công bố ngân hàng gen 39 giới (NCBI) Kết đọc trình tự thể hình 3.6 (trình tự gen pagA), bàng 3.2, hình 3.7 (trình tự gen capA), bàng 3.3 hình 3.8 (trình tự gen vrrA), bàng 3.4 sau: > Gen pagA.POXl gtgatttcga aaaggttaca ggacggattg ataagaatgt atcaccagag gcaagacacc 61 cccttgtggc agcttatccg attgtacatg tagatatgga gaatattatt ctctcaaaaa 121 atgaggatca atccacacag aatactgata gtcaaacgag aacaataagt aaaaatactt 181 ctacaagtag gacacatact agtgaagtac atggaaatgc agaagtgcat gcgtcgttct 241 ttgatattgg tgggagtgta tctgcaggat ttagtaattc gaattcaagt acggtcgcaa 301 ttgatcattc actatctcta gcaggggaaa gaacttgggc tgaaacaatg ggtttaaata 361 ccgctgatac agcaagatta aatgccaata ttagatatgt aaatactggg acggctccaa 421 tctacaacgt gttaccaacg acttcgttag tgttaggaaa aaatcaaaca ctcgcgacaa 481 ttaaagctaa ggaaaaccaa ttaagtcaaa tacttgcacc taataattat tatccttcta 541 aaaacttggc gccaatcgca ttaaatgcac aa Hình 3.6: Trình tự gen pagA.POXIcùa vi khuẩn than Báng 3.2: Báng so sánh độ tương đồng cùa gen pagA.POXl cùa B anthracis nghiên cứu với sbUhừiì£B (NCBI) Tên trình tự gen tưong dồng vói gen Mã số Tỉ lệ tưomg pagA.POXl NCBI đồng (%) Bacillus antheads strain PAG220314plasmid KJ631748.1 99% plasmid CP006743.1 99% Bacillus anthracis strain 34F2 plasmid pXO JQ798178.1 99% plasmid CP00599.1 99% Bacillus anthracis isolate BA 1024 protective AF306782.1 99% STT pXOl protective antigen (pag) gene, partial cds Bacillus anthracis strain SVA11 pxoi complete sequence protective antigen (pag) gene, partial cds Bacillus anthracis strain A0248 pXO 1, complete sequence antigen (pag) gene, complete cds 40 Từ băng 3.2 trên, ta thấy trình tự gen pagA.POXl chùng B anthracis nghiên cứu có độ tương đong cao (99%) với số chúng B anthracis có trình tự gen công bố ngân hàng gen giới NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) Gen CapA.POX2 gattgttaat cgttacggta cagattatgt ttttcgtcat gtttcgccat atttaaaaaa 61 ctcagattac gtaagtggga atttcgaaca tcctgttttg ttagaagata aaaagaatta 121 tcaaaaagca gataagaata ttcacttaag tgcaaaagaa gaaacagtta aggcagtaaa 181 agaagccgga tttacagtat taaatttggc gaataaccat atgacggatt atggtgctaa 241 gggaactaaa gatacaataa aggcctttaa agaagctgat cttgactatg tgggtgctgg 301 tgaaaatttc aaagatgtaa aaaatattgt gtatcaaaat gtaaatggtg ttagggttgc 361 tactcttgga tttacagatg catttgtagc aggagctatt gcaacgaaag aacaaccagg 421 ttcgttaagt atgaacccag atgtattact taagcaaatt agtaaggcaa aggatcctaa 481 aaaaggtaat gctgatcttg tcgtagtaaa tacgcactgg ggggaagaat acgataataa 541 accgagtcct agacaggaag Hình 3.7: Trình tự gen CapA.POX2 vi khuẩn than Thự viện Viện Đai học Mở Hà Nội Báng 3.3: Bàng so sánh độ tương đông cua gen CapA.POX2 B anthracis nghiên cứu với số chúng B anthracis ngân hàng gen giới (NCBI) STT Tên trình tự gen tưong đồng vói Mã số genCapA.POX2 NCBI Tỉ lệ tương đồng (%) CP008848.1 100% CP006744.1 100% CPOO 1972.1 100% CPOO 1597.1 100% CP001214.1 100% Bacillus anthracis strain HYU01 plasmid pXO2, complete sequence Bacillus anthracis strain SVA11 plasmid pXO2, complete sequence Bacillus anthracis strain A16 plasmid pXO2 complete sequence Bacillus anthracis strain A0248 plasmid pXO2, complete sequence Bacillus anthracis strain CDC 684 plasmid pXO2, complete sequence 41 Gen VrrA ctgtaagccc tgtcgtcgaa cagtacggtc ccattatgcg taacctacca agcatcgtta 61 aaatcctcac ctctggaaaa agtacggaag aaaatccaac cgaagatcaa actgaagacc 121 taacagaaaa ggttgaagta gcaactccac ctcctccaca aaaaaaaaga aaaagaaaaa 181 aaatggtgat tgagccagtt atagaaaaag aagtgcgcga gg Hình 3.8: Trình tự gen VrrA vi khuẩn than Bàng 3.4: Báng so sánh độ tương đồng cứa gen VrrA cùa B anthracis nghiên cứu với số chủng B anthracis ngân hàng gen giới (NCBI) Tên trình tự gen tưoiĩg đồng vói Mã số Tỉ lệ tuong gen VrrA NCBI đồng (%) Bacillus anthracis strain A16R , complete CPOO 1974.1 100% L48554.1 100% STT genome Bacillus anthracis (strain Vollum) VrrA gene, QomqlW^ện viện Đại học N Hà Nội Bacillus anthracis (strain Sterne) VrrA L48553.1 100% L48552.1 99% gene, complete cds Bacillus anthracis (strain Ames) VrrA gene, complete cds Từ báng 3.2, báng 3.3 bàng 3.4 trên, nhận thấy ràng: Mức độ tương đồng gen VrrA, capA, vi khuẩn than (B anthracis) có mức tương đồng cao 100% gen pagA 99% so với số chúng công bố ngân hàng gcn giới NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) Như vậy, nghiên cứu chúng tơi hồn tồn thống với cơng bố ngồi nước 3.6 Multiplex PCR phát đồng thòi gen vrrA, capA, pagA Sau thực phản ứng PCR đơn mồi đế tìm nồng độ tối ưu thành phần, chu kỳ nhiệt cho phàn ứng khuếch đại gen, thực phản ứng Multiplex PCR nhằm phát đồng thời gcn vrrA, capA, pagA cùa vi khuân than 42 Phản ứng Multiplex PCR nghiên cứu phản ứng PCR sử dụng đồng thời cã cặp mồi gen VrrA, capA, pagA đế khuếch đại nhiều phân đoạn DNA khuôn ống PCR Phàn ứng cho kết quâ nhanh, xác, độ đặc hiệu cao, tiết kiệm thời gian, tiết kiệm công sức lao động đặc biệt giảm tiêu hao vật tư hóa chất Sàn phấm khuếch đại cùa phản ứng Multiplex PCR tiến hành kiếm tra gel agarose 2% Hình 3.9: Điện di đồ sân phẩm khuếch đại đồng thời gen từ vi khuẩn than phản ứng Multiplex PCR M: Thang DNA 100 bp 1: Đối chứng âm 2: Multiplex PCR gen vi khuẩn than Kết hình 3.9 cho thấy gen VrrA (222 bp), gen pagA (751 bp) capA (610 bp) xuất băng vạch đặc hiệu, rõ đẹp, băng vạch phụ nào, có kích thước theo tính tốn lý thuyết thiết kế mồi Như vậy, phàn ứng Multiplex PCR giúp phát đồng thời gen vrrA, capA, pagA vi khuân than ống phán ứng 43 PHÀN IV: KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ KÉT LUẬN Đã tách chiết thành công DNA tông so cùa vi khuẩn than Đã thiết kế thành công cặp moi phục vụ cho việc phát nhanh vi khuân than dựa vào gen vrrA, capA, pagA Đã nhân dòng xác định trình tự gen vrrA (222 bp), capA (610 bp), pagA (751 bp) cùa vi khuân than Đã phát đồng thời gen VrrA, capA, pagA cùa vi khuấn than bàng phàn ứng Multiplex PCR KIÉN NGHỊ Tạo kit Multiplex PCR phát đồng thời gen vrrA, capA, pagA vi khuẩn than phục vụ cho việc chẩn đoán điều trị vi khuấn than gây bệnh Thư viện Viện Đại học Mờ Hà Nội 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt l Ngơ Đình Bính, Nguyễn Xn Cánh, Nguyễn Thị Ánh Nguyệt, Hoàng Ngọc Hiến, Nguyền Thái Sơn, Lê Thu Hồng (2004) Phân lập phân loại vi khuấn Bacillus anthracis từ bệnh nhân mắc bệnh than Việt Nam Những vấn đề nghiên cứu bán khoa học sống NXB KHKT, tr 42 - 45 Ngơ Đình Bính, Nguyễn Ánh Nguyệt, Nguyễn Quang Huy, Nguyền Quỳnh Châu, Nguyễn Xuân Cành, Phạm Minh Hương, Nguyễn Thị Ngọc Dao, Trịnh Thị Ngọt, Hoàng Đạo Phấn, Đồ Ngọc Khuê (2003) Phát vi khuẩn gây bệnh than Bacillus anthracis bang phương pháp sinh học phân tử Báo cáo khoa học Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc năm 2003 NXB KHKT Hà Nội tr 150- 154 Hoàng Thị Thu Hà, Đặng Đức Anh, Phạm Thanh Hài, Nguyễn Phước My, Nguyền Thùy Trâm Nguyễn Trần Hièn(2012)-PCR chần đoán nhanh, , I hự Viên V ên Đại họồ Mớ Hà Nội xác vi khuân Bacillus anthracis trực tiêp từ bệnhphâm lâm sàng môi trường Y học dự phịng,8, tr 155-163 Nơng Văn Hãi, Quyền Đình Thi (2008) Phản ứng PCR ban.Những kỹ thuật PCR ứng dụng phân tích DNA 2, tr 15-250 Nguyền Thái Sơn cộng (2010) Nghiên cứu so biện pháp ứng phó tình bị công tác nhân sinh học trực khuấn than (Bacillus anthracis).Báo cáo tống kết nhiệm vụ cấp Bộ QP, dự án A037 Học viện Quân y (2011) Giáo trình Vi sinh Y học Nhà xuất Quân đội nhân dân, Hà Nội, tr 192-199 Tiếng Anh Batra R B a s (2001) Anthrax Toxin.Critical Reviews in Microbiology 27(3): 167-200 Batra s A., Krupanidhi s„ Tuteja u (2013) A sensitive & specific multiplex PCR assay for simultaneous detection of Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Burkholderia pseudomallei & Brucella species Indian Journalof Medical Research 138: 111-116 Brachman p s (2002) Bioterrorism: An Update with a Focus on Anthrax American Journal of Epidemiology 155(11): 981- 987 10 Brachman P.S Gold H., Plotkin S.A., Fekety F.R., Werrin M„ Ingraham N.R (1962) Field Evaluation of a Human Anthrax Vaccine American Journal of Public Health Nation 's Health 52 (4): 632-645 11 Brossier F., Levy M., Landier A Lafaye p., Mock M (2004) Functional analysis of Bacillus anthracis protective antigen by using neutralizing monoclonal antibodies Jnfddiortand immunity 72(i I)Nậ'l 3-6317 12 Burton J E Oshota o J., North E., Hudson M J., Polyanskaya N., Brehm J Lloyd G Silman N J (2005) Development of a multi-pathogen oligonucleotide microarray for detection of Bacillus anthracis Molecular and Cellular Probes 19(5): 349-357 13 Cheun H I Makino s I., Watarai M., Erdenebaatar J., Kawamoto K., Uchida I (2003) Rapid and effective detection of anthrax spores in soil by PCR Journal of Applied Microbiology 95(4): 728-733 14 Ezzell J w., Welkos s L (1999) The capsule of Bacillus anthracis, a review Journal of Applied Microbiology 87(2): 250 15 Fouct A., Mesnage s Tosi-Couture E., Gounon p Mock M (1999) Bacillus anthracis surface: capsule and S-layer Journal of Applied Microbiology 87(2): 251-255 16 Haines Bw., Klein F., Lincoln Re (1965) Quantitative assay for crude anthrax toxins Journal of Bacteriology 89: 74 - 83 ii 17 Hoffmaster A R Koehler T M (1999) Autogenous regulation of the Bacillus anthracis pag operon Journal of Bacteriology 181 (15): 4485 - 4492 18 Jackson p J Hugh-Jones M E„ Adair D M Green G., Hill K K Kuske c R„ Grinberg L M., Abramova F A., Keim p (1998) PCR analysis of tissue samples from the 1979 Sverdlovsk anthrax victims: the presence of multiple Bacillus anthracis strains in different victims Proceedings of the National Academy Sciences of the USA 95(3): 1224-1229 19 Jernigan J A., Stephens D S; Ashford D A .Omenaca c., Topiel M s Galbraith M Tapper M., Fisk T L., Zaki s., Popovic T., Meyer R F Quinn c p., Harper s A., Fridkin s K., Sejvar J J Shepard c w McConnell M., Guarner J.,Shieh w J Malecki J M.„ Gerberding J L Hughes J M„ Perkins B A., , Anthrax Bioterrorism Investigation Team (2001) Bioterrorism-related inhalational anthrax: the first 10 cases reported in the United States Emerging Infectious Diseases Journal 7(6):933-944 20 Kamal s., Rashid A M.( Bakar M; (2011) Anthrax: an update Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine 1(6): 496-501 2/ Keim p., Grucndikc J M., Klevytska A M., Schlipp J M„ Challacombc J., Okinaka R (2009) The genome and variation of Bacillus anthracis Molecular Aspects of Medicine 30(6): 397- 405 22 Keim p., Price L B., Klevytska A., M.Smith K L., Schupp J M., Okinaka R., Jackson p J., Hugh-Jones M E (2000) Multiple-locus variable-number tandem repeat analysis reveals genetic relationships within Bacillus anthracis.Journal Bacteriology 182(10): 2928-2936 23 Kim w Hong Y p„ Yoo J H„ Lee w B„ Choi c s„ Chung s I (2002) Genetic relationships of Bacillus anthracis and closely related species based on variable-number tandem repeat analysis and BOX-PCR fingerprinting FEMS Microbiology Letters 207(1): 21-27 iii genomic 24 Kumar s., Tuleja u., Sarika K., Kumar o (2012) A multiplex PCR assay for the simultaneous identification of virulent & avirulent Bacillus anthracis targeting genes of plasmids & chromosomal DNA Indian Journal of Medical Research 135(6): 917-919 25 Kurosaki Y., Sakuma T., Fukuma A Fujinami Y„ Kawamoto K., Kamo N Makino s I., Yasuda J (2009) A simple and sensitive method for detection of Bacillus anthracis by loop-mediated isothermal amplification Journal of Applied Microbiology 107(6): 1947-1956 26 Meynell E., Meyncll G G (1964) The Roles of Scrum and Carbon Dioxide in Capsule Formation by Bacillus anthracis Journal of General Microbiology 34: 153-164 27 Okinaka R T., Cloud K Hampton o., Hoffmaster A R Hill K K Keim p Koehler T M., Lamke G., Kumano s., Mahillon J„ Manter D., Martinez Y„ Rieke D., Svensson R„ Jackson p J (1999) Sequence and organization of pXOl the large Bacillus ạnthracội plasmid harboring the anthrax toxin genes Journal of Bacteriology 181(20): 6509-6515 28 Patra G., Vaissaire J., Weber-Levy M Le Doujet c., Mock M (1998) Molecular characterization of Bacillus strains involved in outbreaks of anthrax in France in 1997 Journal of Clinical Microbiology 36(11): 3412-3414 29 Read T D., Peterson s N., Tour (2003) The genome sequence of Bacillus anthracis Ames and comparison to closely related bacteria Nature 423(6935): 81-86 30 Safari Foroshani N., Karami A., Pourali F (2013) Simultaneous and Rapid Detection of Salmonella typhi Bacillus anthracis, and Yersinia pestis by Using Multiplex Polymerase Chain Reaction (PCR) Iranian Red Crescent Medical Journal 15(11): e9208 31 Skottman T, Piiparinen H„ Hyytiainen H., Myllys V., Skurnik M., Nikkari s (2007) Simultaneous real-time PCR detection of Bacillus anthracis, Francisella iv tularensis and Yersinia pestis European Journal of Clinical Microbiology Infecioust Diseases 26(3): 207-211 Internet 32 http://textbookofbacteriology.net/themicrobialworld/anthrax.html Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội ... (Bacillus anthracis) 35 3. 3 Kết khuếch đại gen vrrA, capA, pagA B anthracis kỹ thuật PCR 36 3. 3.1 Gen VrrA .37 3. 3.2 Gen pagA 37 3. 3 .3 Gen CapA 38 ... pagA vi khuấn than (Bacillus anthracis) phản ứng Multiplex PCR. ” Mục tiêu nghiên cứu : Phát đồng thời gen VrrA, capA, pagA cùa vi khuân than (Bacillus anthracis) đề phục vụ cho vi? ??c tạo Kít phát. .. số tử mẫu VI khuẩn than PCR đon mồi phát gen vrrA, ẽapA.pagA nư vi? ??n vi? ??u uại nọc Mơ Ha [Nọi Xác định trinh tự so sánh ngân hàng gen PCR đa mồi (Multiplex PCR) phát đồng thời gen vrrA, capA,pagA