Nghiên cứu biểu hiện enzyme AA10 trong E. coli

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐÈ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN Bộ - GIẢNG VIÊN 2020 Tên đề tài: Nghiên cứu biểu enzyme AA10 E colỉ Số hợp đồng: 2020.01.004/HĐ-KHCN Chủ nhiệm đề tài: Ngô Thị cẩm Nhung Đơn vị công tác: Viện Kỹ thuật Công nghệ cao NTT Thời gian thục hiện: 09 tháng TP Hồ Chí Minh, ngày 01 tháng 11 năm 2020 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .4 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, sơ ĐỒ, HÌNH ẢNH TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung Vibrio 1.1.1 Lịch sử 1.1.2 Đặc điểm 1.1.3 Cơ chế gây bệnh 1.2 Protein GbpA 11 1.3 Polysaccharide monooxygenase (PMO) 12 1.3.1 Giới thiệu PMO 12 1.3.2 Phân loại chế hoạt động 13 1.3.3 Tình hình nghiên cứu 14 1.4 Biểu protein tái tổ họp E.coỉi BL21 (DE3) 14 1.4.1 Tế bào chủ E coỉỉ 14 1.4.2 Hệ thống vector pET22b biểu protein tái tổ họp E coli BL21 (DE3) 15 VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 17 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 17 2.2 Vật liệu phương pháp nghiên cứu 17 2.3 Vật liệu phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1 Đối tượng nghiên cứu 17 2.3.2 Hóa chất 17 2.3.3 Thiết bị .18 2.4 Phương pháp nghiên cứu 18 2.4.1 Tạo dịng vector tái tơ họp biểu E colỉ BL21 (DE3) 18 2.4.2 tái tổ họp 2.4.3 Phương pháp tạo dòng chủng E coli BL21 (DE3) mang vector 21 Biểu protein VvPMOlO E coli BL21 (DE3) 21 KỂT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Tạo dòng vector tái tổ họp biểu E co li BL21 (DE3) 24 3.1.1 Thu nhận gene VvPMOl plasmid pET22b mở vòng 24 3.1.2 Phản ứng nối gen VvPMOlO với plasmid pET22b biến nạp vào E coli DH5a 26 3.1.3 Chọn lọc thể biến nạp E coli DH5a mang vector tái tổ họp pET22b-VvPMO10 27 3.2 Tạo dòng chủng E coli BL21 (DE3) mang vector tái tổ họp 29 KỂT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 PHỤ LỤC 3: DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CỒNG BỐ 40 PHỤ LỤC (họp đồng, thuyết minh đề cương) 41 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIÉT TẮT -PMO Polysaccharide Monooxygenase -LB Luria Bertani medium -AA Auxiliary Activities -IM Induction Medium -AS Acetosyringone -PCR Polymerase Chain Reaction -NCBI National Center for Biotechnology Information -Fw Forward primer -Rv Reverse primer -TAE Tris-Acetate-EDTA -DNA Deoxyribonucleic acid PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, sơ ĐỊ, HÌNH ẢNH Hình 2.1 Cấu trúc vector tái tổ họp pET22b-VvPMO10-6xHis 19 Hình 2.2 Chu trình nhiệt phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen 20 Hình 3.1 Tinh chế sản phẩm PCR thu nhận gen VvPMOlO plasmid pET22b mở vòng 25 Hình 3.2 Kết sàng lọc sản phẩm nối tế bào E coli DH5a 26 Hình 3.3 Sàng lọc thể biến nạp mang vector mục tiêu PCR khuẩn lạc 27 Hình 3.4 Ket kiểm tra plasmid tái tổ họp gel agarose 1,2% 28 Hình 3.5 Kết biến nạp E colỉ BL21 (DE3) 30 Hình 3.6 Kết kiểm tra E coli BL21 (DE3) chuyển gen PCR khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu cho gen mục tiêu 30 Hình 3.7 Kết kiểm tra biểu VvPMOlO tái tổ họp 31 TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN cứu Kết đạt Ket đăng kí Dạng II: Dạng II: - Trình tự DNA thu nhận từ chủng Vibrio Ket thực nghiệm Vulnificus ATCC 27562 - Plasmid pET22b chứa gen - Plasmid pET22b chứa gen VvPMOlO VvPMOlO chủng E co li DH5a chủng E co li DH5a chứa plasmid chứa plasmid - Biến nạp thành công E coli DH5a - Bảng kết thử nghiệm biến nạp - Tạo dịng thành cơng E coll BL21 (DE3) E coli DH5a mang gen mục tiêu - Bảng kết thử nghiệm biến nạp - Biểu protein tái tổ họp VvPMOlO E coli BL21 (DE3) Dạng III: 01 báo đăng tạp chí - Bảng kết biểu protein mục Khoa học Công nghệ NTTU tiêu Dạng III: 01 báo theo định dạng tạp chí Khoa học Cơng nghệ NTTU Thời gian đăng ký: từ 03/2020 đến 11/2020 Thời gian nộp báo cáo: 10/11/2020 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giói thiệu chung Vibrio 1.1.1 Lịch sử Năm 1854, chủng Vibrio lần phát gây bệnh dịch tả thầy thuốc Filippo Pacini (1812 - 1883) diễn Florence, Ý Bản ghi chép triệu chứng bệnh dịch tả bắt nguồn từ thời Hippocrates (460 đến 377 sau công nguyên) Pacini kiểm tra niêm mạc ruột mẫu bệnh phẩm kính hiển vi tìm thấy V cholerae tất mẫu Ba mươi năm sau, Robert Koch (1843 - 1910) cấy chủng Vibrio cholerae chết đĩa gelatin Tháng năm 1883, Koch cộng kiểm nghiệm ca nguy kịch Ai Cập - nơi dịch bệnh nổ làm 100.000 người chết Kết cho thấy diện loại vi khuẩn đặc trưng mô ruột họ không nuôi cấy chủng Sau đó, nhóm nghiên cứu Koch đến Àn Độ đến cuối năm 1883, chủng V cholerae nuôi cấy làm V cholerae mô tả với hình dạng dấu phẩy hình xoắn, chúng có khả di động tụ lại thành đám đĩa gelatin Năm 1893, dịch tả xảy Hamburg, Germany với 800.000 ca tử vong Koch yêu cầu nghiên cứu phương tiện cung cấp cải thiện vệ sinh khu vực Hệ thống cung cấp nước cần lọc để loại bỏ vi khuẩn đề xuất Trong thời gian này, nhóm nghiên cứu phân lập dịng Vibrios có mặt khắp nơi hệ thủy sinh nhiều dạng không gây bệnh Những dịng khơng gây bệnh V fischeri, V spỉendỉdus, photobacterium phosphoreum phân lập môi trường nước phát nhà sinh thái học Martinus Beijerinck (1851 - 1931) khoảng cuối năm 1880 J Ngoài V cholera, Vibrio gây bệnh khác gây người V vulnificus, V parahaemolyticus phát sau 1.1.2 Đặc điểm phân loại, Vibrio spp thuộc nhóm vi khuẩn họ Vibrionaceae bao gồm chi Aeromonas, Plesiomonas, and Photobacterium Có 30 chủng chi Vibrio có khoảng 13 số gây bệnh cho người V cholerae, V mỉmỉcus, V fluvialis, V parahaemolytỉcus, V paraheamolyticus, V algỉnolyticus, V cincinnatỉensỉs, V hollỉsae, V vulnificus, V furnissii, V damela, V metshnỉkovii, V carcharỉae Trong đó, V cholerae, V vulnificus, V parahaemolyticus dòng gây bệnh nghiêm trọng người Đây trực khuẩn Gram âm với roi phân cực nhất, có khả lên men, hơ hấp kị khí Hầu hết chủng có phản ứng oxidase catalase, lên men glucose mà khơng sinh khí Ngoại trừ V choleras V mỉmỉcus, tất Vibrio khác chủng ưa mặn (môi trường bổ sung muối cần thiết)2,3 Vibrio spp phân bố phổ biến vùng biển cửa sơng, có khả chống chịu khoảng biến động nhiệt độ, độ mặn Một số dòng Vibrio tích tụ loại tơm, sị biển gây mối đe dọa đáng kể kinh tế sức khỏe người Các vi khuẩn gây bệnh thuộc họ Vibrio gây thiệt hại nặng ngành ni trồng thủy hải sản, ví dụ hội chứng tôm chết sớm với tỉ lệ từ 40 đến 100%, làm giảm sản lượng tôm cung cấp cho giới lên đến 20% Người bị nhiễm V cholerae gây bệnh tả thường có nguồn nước khơng chữa kịp thời dẫn đến tử vong Các V spp gây bệnh khác V parahaemolyticus, V alginolyticus V vulnificus gây bệnh tiếp xúc với nước biển tiêu thụ hải sản bị nhiễm khuẩn5 Theo quan kiểm soát dịch bệnh CDC Mỹ từ năm 1996 đến 2006 ghi nhận tăng lên đáng kể ca nhiễm khuẩn V vulnificus lên tới 78% Các bệnh nhân ăn phải V vulnificus gây nhiễm trùng toàn thân gồm biểu sốt, ón lạnh, buồn nơn, sốc nhiễm trùng hạ huyết áp, hình thành tổn thương thứ cấp tứ chi Bệnh nhiễm trùng máu nguyên phát V vulnificus có tỉ lệ tử vong cao mức 50% 1.1.3 Cơ chế gây bệnh Tính đến nay, chế gây bệnh Vibrio gây bệnh nghiêm trọng người bao gồm V cholera, V vulnificus, V parahemolyticus tiếp tục nghiên cứu làm rõ chế xâm nhập, yếu tố gây bệnh chế kháng thuốc Một số chế gây bệnh điển hình chủng kể đến sau: Các Vibrio mang yếu tố độc lực bao gồm loại độc tố đặc trưng cho dòng vi khuẩn gây bệnh Đối với V cholerae, độc tố tả (ctx) gồm hai tiểu phần 1A 5B Độc tố tả hoạt hóa hệ thống adenylate cyclase-cAMP màng đáy tế bào biểu mô ruột Sự tăng lên AMP dạng vòng làm cân q trình vận chuyển điện giải biểu mơ giảm hấp thu Na+ gia tăng cr Sự thiếu hụt Na+ làm tế bào ruột nước lượng nước bị tiết từ ruột lên tới 500 - 1000 ml/h ca nghiêm trọng, lượng nước lên tới 30 - 40L mồi ngày 7’8 Ngoại độc tố gây tán huyết/ly giải tế bào độc lực V parahemolyticus sản xuất có tên gọi độc tố chịu nhiệt (TDH) TDH gây tán huyết khơng phụ thuộc mảng lipid cách liên kết trực tiếp với màng tế bào máu tạo lồ bề mặt màng dẫn đến thẩm thấu hệ keo tế bào máu Ngoài ra, TDH gây độc tế bào, tạo thành kênh màng tế bào làm tăng nồng độ Ca2+ ngoại bào tiết cv Khi áp suất thẩm thấu tế bào vượt giới hạn để tự điều chỉnh, tế bào xảy thay đổi bệnh lý, hình thái dẫn đến tế bào giãn nở gây chết9 Các gen mã hóa cho độc tố TDH tìm thấy nhiều chủng Vibrios khác gen chung nguồn gốc tổ tiên, gen điều hòa toxRS kiểm sốt biểu hiện, đồng thời chuyển vị nhiễm sắc thể 10,1 k Tương tự với V vulnificus, gen mã hóa độc tố ly giải (mã hóa whÃ) có trình tự amino acid tương đồng khoảng 60 - 65 % so với trình tự độc tố V choleraen - Lóp Lipo polysaccharide (LPS) vi khuẩn Vibrio nội độc tổ gây sốc nhiễm trùng thơng qua q trình cảm ứng phản ứng thể vật chủ LPS hoạt hóa đại thực bào tế bào B tăng cường phản ứng viêm sản xuất cytokine dẫn đến giãn tĩnh mạch, tăng tính thấm mao mạch, kích hoạt bổ thể đường đông máu 13’14 Tạo lớp vỏ biofilm sinh vật khác cung cấp lợi sinh tồn đáng kể chủng khuẩn nhu Vibrio Các vi sinh vật phát triển màng sinh học giúp cho chúng có tăng khả chống môi trường acid ruột, chống chịu lại hệ thống miễn dịch vật chủ kháng sinh hay nhiều chế trình khởi phát bệnh15 Quá trình hình thành màng bao bọc, tương tác bề mặt Vibrio phụ thuộc vào gen cấu trúc sinh tổng họp roi, khuẩn mao, exopolysaccharide gen điều hòa hai yếu to (quorum sensing tín hiệu c-di-GMP)16 Sự bám dính vi khuẩn lên bề mặt bước thiết yếu cho tồn chúng điểm môi trường khác Bám dính vào bề mặt niêm mạc sau xâm nhập mơ niêm mạc coi tạo thành giai đoạn q trình lây nhiễm Do đó, đột biến vi khuẩn gây bệnh đường ruột bị gây đột biến khó bám dính vào lóp nhầy ruột già, dẫn đến độc lực giảm dần Sự bám dính thực số số chế đặc trưng: + Polysaccharide thành phần chủ yếu Vibrio biofilm Đe sản xuất màng, thành phần ngoại bào phải giữ tế bào lại với giữ màng gắn vào bề mặt Các loci polysarccharide vỏ (CPS), exopolysaccharide (EPS VPS) liên quan đến hình thành màng sinh học ảnh hưởng tới hình dáng khuẩn lạc trịn, nhăn 16 + Điều hòa liên lạc tế bào vi khuẩn với tế bào vi khuẩn khác (quorom sensing regulators) Quá trình cảm biến diễn nhằm đảm bảo số lượng vi khuẩn diện để điều phối độc lực đủ để áp đảo hệ thống phòng thủ vật chủ Hệ thống cảm biến sử dụng dạng tương tự LuxL-LuxR V fischeri, tổng họp phân tử tín hiệu khuếch tán N-acylho-moserine lacton (AHL) làm vật chất truyền thông tin Nồng độ AHL tăng lên mật độ tế bào tăng lên Khi đạt nồng độ tới hạn, LuxR liên kết với phân tử tính hiệu điều chỉnh biểu gen17 10 KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tạo dòng vector tái tổ hợp biểu E coll BL21 (DE3) 3.1.1 Thu nhận gene VvPMOlO plasmid pET22b mở vòng Đe tạo dòng vector biểu hiện, tiến hành thiết kế đặt tổng họp mồi thu nhận gen mã hóa VvPMOlO từ genome vi khuẩn Vibrio vulnificus ATCC 27562 mang trình tự enzyme cắt giới hạn Ncoĩ ATzoI hai đầu đoạn gen Genome vi khuẩn tách chiết theo phương pháp CTAB Genome thu nhận sử dụng làm mẫu cho phản ứng PCR thu nhận gen mục tiêu với cặp mồi đặc hiệu plasmid pET22b mở vòng thu nhận phương pháp PCR Các mẫu thu nhận tinh xác định nồng độ máy đo Nanodrop Kết đo cho thấy sản phẩm PCR plasmid pET22b mở vòng VvPMOlO sau tinh chế có nồng độ 152,6ng/gl 189,2ng/pl (bảng 3.1) Độ tinh sản phẩm thu nhận nằm khoảng 1,8 < OD260/280 < 2,0 Bảng 3.1 Kết đo nồng độ plasmid pET22b mở vòng gen thu nhận Mầu Nồng độ (ng/pl) Độ tinh (OD260/280) pET22b mở vòng 152,6 1,88 VvPMOlO 127,2 1,81 Đồng thời, kết chạy kiểm tra sản phẩm gen VvPMOlO plasmid mở vịng gel agarose hình 3.1 cho band Gen VvPMOlO có kích với kích thước theo lý thuyết xấp xỉ 0,538kb (giếng 1, hình 3.1) nằm vạch 0,6kb 0,4kb so với thang Tương tự, plasmid pET22b sau mở vịng có độ dài khoảng 5,4kb (giếng 3, hình 3.1) Do vậy, đoạn gen phù họp cho thí nghiệm 24 Hình 3.1 Tinh chế sản phẩm PCR thu nhận gen VvPMOlO plasmid pET22b mở vòng Giếng 1: Gen mục tiêu thu nhận Giếng 2: Thang hypperladder Ikb Giếng 3: Plasmid pET22b mở vòng Dựa thiết kế trình tự ban đầu, gen VvPMOlO tạo dịng theo phương pháp nối đầu dính cách gắn thêm trình tự nhận biết hai enzyme cắt giới hạn Ncoỉ Xh()\ nhằm đảm bảo gen nối đủng chiều, giảm trường họp plasmid tự nối Các sản phẩm PCR gen plasmid sau tinh xử lý đồng thời với hai enzyme cắt giới hạn tinh chế sản phẩm cắt phương pháp tinh chế gel Nồng độ gen VvPMOlO thu nhận đạt 48,2ng/pl với độ tinh (OD260/280) 1,82 Tương tự, mẫu plasmid mở vòng sau xử lý enzyme cắt giới hạn đạt độ tinh (OD26O/280) = 1,80 với nồng độ 49,8ng/pl Dựa kết thu được, thu nhận thành công nguyên liệu gen mục tiêu pET22b mở vòng mang hai enzyme Ncoỉ Xhoỉ cho chiến lược gen nối đầu dính 25 3.1.2 Phản ứng nối gen VvPMOlO với plasmid pET22b biến nạp vào E coli DH5a Gen mục tiêu plasmid pET22b mở vòng xử lý với hai enzyme đầu enzyme Ncoỉ Xhoỉ thí nghiệm trước đuợc sử dụng làm nguyên liệu cho phản ứng nối bang enzyme T4 ligase Hỗn họp sản phẩm nối đuợc chuyển vào tế bào E coỉi DH5a để sàng lọc so thể biến nạp mang vector tái tổ họp mơi trường chọn lọc LB-Agar có chứa kháng sinh ampicillin (lOOpg/ml) Dòng tế bào E co li DH5a nhận vector có gen thị mã hóa gen kháng kháng sinh ampicillin có khả sống sót mơi trường chọn lọc Ket thí nghiệm hóa biến nạp thể hình 3.2 Hình 3.2 Kết sàng lọc sản phẩm nối tế bào E coli DH5a A: Đĩa đối chứng với mẫu tế bào E coli DH5a bổ sung nước cất B: Mầu tế bào E coli DH5a bổ sung hồn họp sản phẩm nối Đối với mẫu đối chứng (hình 3.2, A), dịng E coỉỉ DH5a khơng cung cấp nguồn gen mã hóa cho protein kháng ampicillin, đĩa LB-Ampagar khơng có khuẩn lạc sinh trưởng Ngược lại, thể biến nạp nhận plasmid có mang gen kháng kháng sinh ampicillin tăng trưởng bình thường, tạo thành khuẩn lạc đon mang đặc trưng E co li DH5a đĩa hình B (hình 3.2) 26 3.1.3 Chọn lọc thể biến nạp E coli DH5ct mang vector tái tổ họp pET22b- VvPMOlO Các khuẩn lạc đơn mọc môi trường chọn LB-Amp-agar kiểm tra diện gen mục tiêu phương pháp PCR khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu cho gen mục tiêu Đồng thời, khuẩn lạc chọn tiến hành ria đĩa giữ chủng môi trường LB-Amp-agar Những dòng tế bào chuyển gen cho kết PCR khuẩn lạc có vạch sáng với kích thước xấp xỉ 0,54kb giếng số (hình 3.3) Những dịng cấy chuyền sang ống nghiệm LB lỏng thực tách plasmid chuẩn bị cho bước kiểm tra diện gen VvPMOlO, chiều gắn gen, đồng khung dịch mã trình tự gen nối 10,0kb l,Okb 0,54kb 0,6kb Hình 3.3 Sàng lọc thể biến nạp mang vector mục tiêu PCR khuẩn lạc 1- Thang hypper ladder Ikb 2- Chứng âm phản ứng PCR 3- Chứng dương mẫu gen VvPMOlO 4,5- Mầu PCR khuẩn lạc 27 Sự diện gen mục tiêu plasmid kiểm tra phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu Các vector thu nhận từ thể biến nạp dùng làm khuôn mẫu Ket thực nghiệm thu gel agarose 1,2% cho thấy giếng số (hình 3.4A) cho vạch DNA có kích thước khoảng 0,54kb tương ứng với kích thước dự đốn sản phẩm VvPMOlO Tiếp đến, tiến hành kiểm tra plasmid thu nhận có mang gen mục tiêu có chèn khung đọc mở phương pháp dùng hai enzyme cắt giới hạn Ncoỉ Xhoỉ Ket điện di agarose sản phẩm cắt plasmid tạo thành hai vạch (hình 3.4B, giếng 2) nhỏ so với kích thước vector ban đầu (Hình 3.4B, giếng 3), có kích thước khoảng 5,5kb 0,5kb tương ứng với kích thước plasmid pET22b mở vịng gen mục tiêu Do đó, gen VvPMOlO gắn vào vector chiều thiết kế Hình 3.4 Kết kiểm tra plasmid tái tổ họp gel agarose 1,2% A Kiêm tra băng phương pháp PCR B 1- Thang hypper ladder Ikb enzyme Acol AAơI 2- Chứng âm phản ứng PCR 1- Mầu plasmid sau cắt 3- Chứng dương gen mục tiêu 2- Mầu plasmid trước cắt 4, 5- Mầu plasmid kiểm tra 28 Kêt xử lý plasmid với Cuối cũng, để khẳng định độ đồng khung dịch mã với promoter plasmid trình tự so với trình tự sở liệu NCBI, chúng tơi tiến hành thu nhận plasmid có kết đạt thí nghiệm kiểm tra sơ tiến hành giải trình tự gen Ket giải trình tự cho thấy độ tuơng đồng 100% so với trình tự ngân hàng liệu đồng khung với thiết kế ban đầu Như vậy, gen VvPMOlO gắn thành công vào plasmid pET22b phương pháp nối đầu dính Vector tái tổ họp pET22b-VvPMO10 thu nhận sử dụng để chuẩn bị cho bước tạo dòng 3.2 Tạo dòng chủng E coli BL21 (DE3) mang vector tái tổ hợp Hệ thống pET dòng vector chuyên dụng để biểu protein tái tổ họp với đặc tính promoter mạnh T7, hệ thống điều hịa kiểm sốt lac operon, gen kháng kháng sinh cho trình sàng lọc sơ bộ, vùng MCS chứa nhiều enzyme cắt giới hạn Bên cạnh đó, chủng chủ E coll BL21 (DE3) cải tiến để biểu protein mục tiêu Lon protease vùng tế bào chất OmpT protease màng bị loại bỏ để tối ưu lượng protein thu Ngồi ra, dịng tế bào DE3 chứa lysogen ÀDE3 mang gen T7 RNA polymerase điều hòa lacUV5 tương thích với promoter T7 vector thay sử dụng RNA polymerase tế bào chủ E co li Các promoter hoạt động có xuất IPTG Do đó, chủng E coli BL21 (DE3) lựa chọn làm chủng biểu thu nhận VvPMOlO tái tổ họp Vector tái tổ họp chuyển vào tế bào E colỉ BL21 (DE3) phương pháp hóa biến nạp sàng lọc sơ mơi trường LB-Amp-agar Các tế bào nhận vector tái tổ hợp phát triển môi trường bổ sung kháng sinh ampicillin Điều phù họp với kết thực nghiệm chuyển vector pET22bVvPMOlO vào E coll BL21 (DE3), khuẩn lạc hình thành đĩa biến nạp hình 3.5B, đĩa đối chứng (hình 3.5A) khơng quan sát thấy tăng trưởng chủng E coli BL21 (DE3) 29 Hình 3.5 Kết biến nạp E colí BL21 (DE3) A Đối chứng B Mầu bổ sung vector tái tổ họp Đe sàng lọc chủng E colí BL21 (DE3) mang vector tái tổ họp, khuẩn lạc vi khuẩn mọc môi trường chọn lọc cấy chuyền đồng thời sang đĩa môi trường thạch LB-Amp-agar để giữ chủng tiến hành kiểm tra phương pháp PCR khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu cho gen mục tiêu Kết phản ứng PCR khuẩn lạc thể bảng gel điện di agarose Giếng (hình 3.6) có vạch sáng tương ứng với chứng dương, đồng thời chứng âm không xuất vạch sáng Dựa vào kết PCR khuẩn lạc, chúng tơi tạo dịng thành cơng chủng E coli BL21 (DE3) mang gen mục tiêu VvPMOlO (viết tắt BL21-VvPMO10) Hình 3.6 Kết kiểm tra E coli BL21 (DE3) chuyển gen PCR khuẩn lạc với cặp O,Okb _ mồi đặc hiệu cho gen mục tiêu 1- Hypper ladder Ikb 2- Chứng âm ’Okb ~ 3- Chứng dương với mâu vector tái tô họp; 4- Sản phẩm PCR khuẩn lạc BL21 30 0,6kb — 0,54kb 3.3 Kiểm tra biểu VvPMOlO E colỉ BL21 (DE3) Protein mục tiêu thiết kế có độ dài 185 acid amin kích thước khoảng 20,5 kDa Để kiểm tra lượng protein biểu vượt mức, tiến hành cảm ứng chủng BL21-VvPMO10 IPTG điều kiện 37°c, lắc 180 vòng/phút Sinh khối thu nhận phá bang sonicate thu nhận thành pha tổng, tan, tủa Các mẫu protein pha xử lý biến tính chạy gel SDS-PAGE để xác định protein mục tiêu Thí nghiệm thực song song với mẫu khuẩn BL21-VvPMO10 không cảm ứng IPTG Kết thực nghiệm trình bày hình 3.7 20kDa Hình 3.7 Kết kiểm tra biểu VvPMOlO tái tổ hợp 1- Thang PageRuler™ Unstained Broad Range Protein 2- 3- 4-Pha tổng, tan, tủa mẫu kliuẩn BL21-VvPMO10 không cảm ứng IPTG 5- 6-7- Pha tông, tan, tủa mẫu khuẩn BL21-VvPMO 10 cảm ứng IPTG 0,5mM Ket phân tích bang gel SDS-PAGE cho thấy pha tổng tủa mẫu khuẩn cảm ứng IPTG xuất vạch protein vượt mức giếng số (hình 3.7) Các vạch có kích thước khoảng 20kDa so với thang Mặt khác, mẫu đối chứng khơng cảm ứng vạch protein không xuất (giếng 2, 3, 4) ba pha Xét đến pha tan protein mục tiêu cảm ứng nhiệt độ 37°c, vạch protein vị trí 20kDa khơng xuất vượt mức (giếng số 6) 31 pha tủa (giếng 7) có lượng protein ngang với lượng protein pha protein tổng số (giếng 5) Như vậy, protein mục tiêu biểu vượt mức với kích thước giống lý thuyết phần lớn nằm pha tủa cảm ứng IPTG điều kiện 37°c 32 KẾT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ Trong số vi khuẩn gây bệnh, Vibrio - vi khuẩn gram âm gây tiêu chảy, nhiễm trùng vết thương tồn enzyme động lực có tác dụng giúp vi khuẩn xâm nhập tế bào chủ thơng qua cấu trúc xương ngồi chitin hay murin động vật Trong đó, domain protein GbpA chứng minh động lực gây bệnh trình xâm nhập vi khuẩn PMO có khả xúc tác chất chitin Tuy nhiên, mối quan hệ tiểu phần PMO trình biến dưỡng hoạt tính đầy đủ chat chitin chưa làm rõ Với mong muốn tạo nguồn enzyme chủ động có hoạt tính sinh học để cung cấp cho thí nghiệm tiếp theo, chúng tơi thực đề tài “Nghiên cứu biểu AA10 E coir Trong thời gian thực hiện, thu kết sau: - Thu nhận thành công gen VvPMOlO từ chủng V vulnificus ATCC 27562 - Tạo dòng thành công vector tái tổ họp pET22b-VvPMO10 mang gen mã hóa VvPMOlO - Tạo dịng thành cơng chủng biểu E coli BL21 (DE3) mang vector tái tổ họp - Biểu thành công protein mục tiêu tế bào chất E coli BL21-VvPMO10 Với kết trên, chúng tơi có số đề nghị sau: - Tiến hành khảo sát điều kiện cảm ứng IPTG để thu nhận VvPMOlO dạng tan protein tiết vùng chu chất E coli - Tinh chế protein mục tiêu có độ tinh cao phục vụ cho thí nghiệm phân tích hoạt tính, khối phổ - Xác định hoạt tính chat chitin khác - Xác định mối quan hệ VvPMOlO trình biến dưỡng chitin chủng V vulnificus ATCC 27562 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO Van Niel, c B Microbiology and molecular biology The Quarterly review of biology 41, 105-112 (1966) Wong, K K & Griffin, p M Other Vibrio Species Principles and Practice ofPediatric Infectious Diseases 879-881.el (2018) doi:10.1016/B978-0-32340181-4.00159-6 Drake, s L., DePaola, A & Jaykus, L.-A An Overview of Vibrio vulnificus and Vibrio parahaemolyticus Compr Rev Food Sci Food Saf 6, 120-144 (2007) Paranjpye, R N & Strom, M s Colonization of shellfish by pathogenic Vibrios, in Proceedings of OCEANS 2005 MTS/IEEE 1-5 (IEEE) doi: 10.1109/OCEANS.2005.1639903 Baker-Austin, c et al Vibrio spp infections Nat Rev Dis Prim 4, (2018) Jones, M K & Oliver, J D Vibrio vulnificus: Disease and pathogenesis Infection and Immunity 77, 1723-1733 (2009) Ganguly, N K & Kaur, T Mechanism of action of cholera toxin & other toxins Indian J Med Res 104, 28—37 (1996) Sanchez, J & Holmgren, J Cholera toxin structure, gene regulation and pathophysiological and immunological aspects Cell Mol Life Sci 65, 13471360 (2008) Matsuda, s et al Association of Vibrio parahaemolyticus Thermostable Direct Hemolysin with Lipid Rafts Is Essential for Cytotoxicity but Not Hemolytic Activity Infect Immun 78, 603-610 (2010) 10 Nishibuchi, M., Khaemonee-iam, V., Honda, T., Kaper, J B & Miwatani, T Comparative analysis of the hemolysin genes of Vibrio cholerae non-01, V mimicus , and V hollisae that are similar to the tdh gene of V parahaemolyticus FEMS Microbiol Lett 67, 251-256 (1990) 11 Lin, z., Kumagai, K., Baba, K., Mekalanos, J J & Nishibuchi, M Vibrio 35 parahaemolyticus has a homolog of the Vibrio cholerae toxRS operon that mediates environmentally induced regulation of the thermostable direct hemolysin gene Journal of Bacteriology 175, 3844-3855 (1993) 12 Yamamoto, K., Wright, A c., Kaper, J B & Morris, J G The cytolysin gene of Vibrio vulnificus: Sequence and relationship to the Vibrio cholerae El Tor hemolysin gene Infect Immiin 58, 2706-2709 (1990) 13 Kabir, s Characterization of the lipopolysaccharide from Vibrio cholerae 395 (Ogawa) Infect Immun 38, 1263-1272 (1982) 14 Bahrani, K & Oliver, J D Studies on the lipopolysaccharide of a virulent and an avirulent strain of Vibrio vulnificus Biochem Cell Biol 68, 547-551 (1990) 15 Donlan, R M & Costerton, J w Biofilms: Survival mechanisms of clinically relevant microorganisms Clinical Microbiology Reviews 15, 167193 (2002) 16 Yildiz, F H & Visick, K L Vibrio biofilms: so much the same yet so different Trends in Microbiology 17, 109-118 (2009) 17 Cámara, M., Hardman, A., Williams, p & Milton, D Quorum sensing in Vibrio cholerae Nature Genetics 32, 217-218 (2002) 18 Liang, X et al An onboard checking mechanism ensures effector delivery of the type VI secretion system in Vibrio cholerae Proc Natl Acad Sci 116, 23292-23298 (2019) 19 Shime-Hattori, A et al Two type IV pili of Vibrio parahaemolyticus play different roles in biofilm formation FEMS Microbiol Lett 264, 89-97 (2006) 20 Juge, N Microbial adhesins to gastrointestinal mucus Trends in Microbiology 20, 30-39 (2012) 21 Jang, K K., Gil, s Y., Lim, J G & Choi, s H Regulatory Characteristics of Vibrio vulnificus gbpA Gene Encoding a Mucin-binding Protein Essential for Pathogenesis J Biol Chem 291, 5774-5787 (2016) 36 22 Kim, T J., Jude, B A & Taylor, R K A colonization factor links Vibrio cholerae environmental survival and human infection Nature 438, 863-866 (2005) 23 Wong, E et al The Vibrio cholerae colonization factor GbpA possesses a modular structure that governs binding to different host surfaces PLoS Pathog 8, 1-12 (2012) 24 Coưêa, T L R et al An actinobacteria lytic polysaccharide monooxygenase acts on both cellulose and xylan to boost biomass saccharification Biotechnol Biofuels 12, 1-14 (2019) 25 Nakagawa, Y s et al A small lytic polysaccharide monooxygenase from Streptomyces griseus targeting a- And P-chitin FEBS J 282, 1065-1079 (2015) 26 Pruzzo, c., Vezzulli, L & Colwell, R R Global impact of Vibrio cholerae interactions with chitin Environ Microbiol 10, 1400-1410 (2008) 27 Feldhusen, F The role of seafood in bacterial foodbome diseases Microbes and Infection 2, 1651-1660 (2000) 28 Span, E A & Marietta, M A The framework of polysaccharide monooxygenase structure and chemistry Curr Opin Struct Biol 35, 93-99 (2015) 29 Forsberg, z et al Structural determinants of bacterial lytic polysaccharide monooxygenase functionality J Biol Chern 293, 1397-1412 (2018) 30 Eriksson, K E., Pettersson, B & Westermark, u Oxidation: an important enzyme reaction in fungal degradation of cellulose FEBS Lett 49, 282-285 (1974) 31 Vaaje-Kolstad, G et al An Oxidative Enzyme Boosting the Enzymatic Conversion of Recalcitrant Polysaccharides Science (80- ) 330, 219 LP 222 (2010) 32 Sabbadin, F et al An ancient family of lytic polysaccharide monooxygenases with roles in arthropod development and biomass digestion Nat Commun 9, 37 (2018) 33 Couturier, M et al Lytic xylan oxidases from wood-decay fungi unlock biomass degradation Nat Chem Biol 14, 306-310 (2018) 34 Filiatrault-Chastel, c et al AA16, a new lytic polysaccharide monooxygenase family identified in fungal secretomes Biotechnol Biofuels 12, 1-15 (2019) 35 Levasseur, A., Drula, E., Lombard, V., Coutinho, p M & Henrissat, B Expansion of the enzymatic repertoire of the CAZy database to integrate auxiliary redox enzymes Biotechnology’ for Biofuels 6, (2013) 36 Vu, V V, Beeson, w T., Phillips, c M., Cate, J H D & Marietta, M A Determinants of Regioselective Hydroxylation in the Fungal Polysaccharide Monooxygenases J Am Chern Soc 136, 562-565 (2014) 37 Quinlan, R J et al Insights into the oxidative degradation of cellulose by a copper metalloenzyme that exploits biomass components Proc Natl Acad Sci u s A 108, 15079-15084 (2011) 38 Eibinger, M et al Cellulose surface degradation by a lytic polysaccharide monooxygenase and its effect on cellulase hydrolytic efficiency J Biol Chern 289, 35929-35938 (2014) 39 Loose, J s M., Forsberg, z., Fraaije, M w., Eijsink, V G H & VaajeKolstad, G A rapid quantitative activity assay shows that the Vibrio cholerae colonization factor GbpA is an active lytic polysaccharide monooxygenase FEBS Lett 588, 3435-3440 (2014) 40 Bhowmick, R et al Intestinal Adherence of Vibrio cholerae Involves a Coordinated Interaction between Colonization Factor GbpA and Mucin Infect Immun 76, 4968-4977 (2008) 41 Manuscript, A Sockolosky 2012 87, 129-135 (2014) 42 Rosano, G L & Ceccarelli, E A Recombinant protein expression in Escherichia coli: Advances and challenges Front Microbiol 5, 1-17 (2014) 43 Pots, J Alfresco Developers Guide American journal of epidemiology 172, 38 NP (2010) 44 Choi, J H & Lee, s Y Secretory and extracellular production of recombinant proteins using Escherichia coli Appl Microbiol Biotechnol 64, 625-635 (2004) 45 Yang, Y et al Improving extracellular production of Serratia marcescens lytic polysaccharide monooxygenase CBP21 and Aeromonas veronii B565 chitinase Chi92 in Escherichia coli and their synergism AMB Express 7, 170 (2017) 39 ... 17 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 17 2.2 Vật liệu phương pháp nghiên cứu 17 2.3 Vật liệu phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1 Đối tượng nghiên cứu 17 2.3.2 Hóa... exo-cellulase (hình 4) 36 38_ 1.3.3 Tình hình nghiên cứu Các nghiên cứu giới protein GbpA xác định enzyme độc lực giúp vi khuẩn xâm nhập vào vật chủ theo nghiên cứu Thomas cộng (2005)23 Sau đó, GbpA... Với mong muốn tạo nguồn enzyme chủ động có hoạt tính sinh học để cung cấp cho thí nghiệm tiếp theo, chúng tơi thực đề tài ? ?Nghiên cứu biểu AA10 E coir Trong thời gian thực hiện, thu kết sau: - Thu