Nghiên cứu biểu hiện gen gerf trong nhóm gen sinh tổng hợp gốc đường khử dtdp 6deoxy d allose của cấu trúc kháng sinh dihydrochalcomycin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN GERF TRONG NHểM GEN SINH TỔNG HỢP GỐC ĐƯỜNG KHỬ DTDP-6DEOXY-D-ALLOSE CỦA CẤU TRÚC KHÁNG SINH DIHYDROCHALCOMYCIN Giáo viên hướng dẫn : TS TẠ THỊ THU THỦY Sinh viên thực : LÊ ĐỖ HUYỀN TRANG Líp : CNSH-0802 HÀ NỘI – 2012 Khóa luận tốt nghiệp Lê Đỗ Huyền Trang-CNSH 0802 LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo cô giáo, cán khoa Công Nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mở Hà Nội trang bị kiến thức, tạo điều kiện máy móc, trang thiết bị giúp đỡ em q trình hồn thành khóa luận Em xin bày tỏ lòng biết sâu sắc tới TS.Tạ Thị Thu Thủy người giao đề tài trực tiếp hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em trình thực nghiệm Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới kỹ sư Phạm Thị Thỳy Võn kỹ sư Nguyễn Thị Huế tận tình hướng dẫn truyền đạt cho em kiến thức từ ngày đầu q trình hồn thành khóa luận Xin gửi lời cảm tới gia đình, bạn bè luụn quan tâm, động viên em suốt thời gian qua Do thời gian khả thân cịn nhiều hạn chế nên khóa luận cịn có nhiều điển thiếu sót Rất mong bảo thầy giáo, giáo, góp ý bạn để khóa luận hồn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 25 tháng 05 năm 2012 Sinh viên Lê Đỗ Huyền Trang Khóa luận tốt nghiệp Lê Đỗ Huyền Trang-CNSH 0802 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU ĐẶC BIỆT DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ MỞ ĐẦU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ KHÁNG SINH 1.1 Lịch sử phát triển kháng sinh 1.2 Giới thiệu chung kháng sinh .4 1.2.1 Định nghĩa kháng sinh 1.2.2 Đơn vị kháng sinh .5 1.2.3 Phân loại kháng sinh 1.2.4 Cơ chế tác động kháng sinh 1.2.4.1 Ức chế trình tổng hợp vách tế bào vi khuẩn 1.2.4.2 Ức chế chức màng nguyên sinh chất 1.2.4.3 Ức chế trình sinh tổng hợp protein 1.2.4.4 Ức chế trình tổng hợp axit nucleic .9 1.3 Ứng dụng kháng sinh .9 1.3.1 Ứng dụng kháng sinh y học .9 1.3.2 Ứng dụng kháng sinh chăn nuôi 10 1.3.3 Ứng dụng kháng sinh trồng trọt .10 1.3.4 Ứng dụng kháng sinh công nghệ thực phẩm 10 1.4 Tớnh kháng thuốc 11 1.5 Giới thiệu kháng sinh dihydrochalcomycin .11 1.6 Giới thiệu đường dTDP-6deoxy-D-Allose .13 1.6.1 Gốc đường khử cấu trúc kháng sinh 13 1.6.2 Đường dTDP-6deoxy-D-Allose 14 1.6.3 Giới thiệu gen gerF 14 1.7 Enzyme giới hạn 15 1.8 Giới thiệu vector biểu pET-32a(+) 16 Khóa luận tốt nghiệp Lê Đỗ Huyền Trang-CNSH 0802 1.8.1 Vector 16 1.8.2 Vector biểu pET-32a(+) 16 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Hóa chất thiết bị 18 2.1.1 Húa chất 18 2.1.2 Thiết bị, máy móc sử dụng nghiên cứu .20 2.2 Chủng vi sinh vật điều kiện nuôi cấy 20 2.2.1 Vi sinh vật 20 2.2.2 Điều kiện nuôi cấy 20 2.3 Môi trường nuôi cấy 20 2.4 Các phương pháp nghiên cứu .`21 2.4.1 Phương 2.4.2 pháp đo giá trị OD 21 Phương pháp chuyển gen vào vi khuẩn E.coli BL21 DE3 21 2.4.2.1 Chuẩn bị tế bào khả biến 22 2.4.2.2 Chuyển gen vào vi khuẩn E.coli BL21DE3 23 2.4.3 Tách chiết DNA plasmid 23 2.4.4 Điện di DNA agarose gel 24 2.4.5 Phương pháp biểu protein E.coli BL21-DE3 .25 2.4.5.1 Biểu protein nồng độ IPTG khác 26 2.4.5.2 Biểu protein nhiệt độ khác 26 2.4.5.3 Biểu protein điều kiện thời gian khác 27 2.4.6 Phương pháp tách protein thô .27 2.5 Điện di protein .28 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Phân tích trình tự axit amin gen gerF 31 3.2 Kết kiểm tra plasmid có tế bào vật chủ E.coli BL21 DE3 35 3.3 Kết biểu enzyme GerF 37 3.3.1 Nồng độ IPTG để biểu protein 37 3.3.2 Ảnh hưởng điều kiện nhiệt độ đến biểu protein 38 Khóa luận tốt nghiệp Lê Đỗ Huyền Trang-CNSH 0802 3.3.3 Ảnh hưởng điều kiện thời gian đến biểu protein 40 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN 42 4.1 Kết luận 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 Khóa luận tốt nghiệp Lê Đỗ Huyền Trang-CNSH 0802 CÁC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU ĐẶC BIỆT DNA Acid deoxyribonucleic RNA Acid ribonucleic aa Amino axit Amp Ampicillin dNTP Deoxyribonucleotide 5’- triphosphates LB Luria-Bertani OD Optical Density SDS Sodium dodecyl sulphate EDTA Ethylen diamin tetra-acid acetic TAE Tris- acetate –EDTA TBE Tris- base- EDTA IPTG Isopropyl-β-D-thiogalacto-pyranoside TE Trophectoderm Sol Sollution bp Base pare ORF Open reading frame Khóa luận tốt nghiệp Lê Đỗ Huyền Trang-CNSH 0802 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình : Cơ chế tác dụng kháng sinh Hình 2: Cấu trúc kháng sinh dihydrochalcomycin Hình 3: Nhóm gen deoxysugar tham gia sinh tổng hợp dihydrochalcomycin Hình 4: Dự đốn chức gen gerF sinh tổng hợp gốc đường khử dTDP- mycinose thành phần quan trọng cấu trúc kháng sinh dihydrochalcomycin Hình 5: Vector biểu pET-32a(+) Hình 6: Sơ đồ điện di protein gel acrylamide Hình 7: So sánh trình tự nucleotide gen gerF với trình tự số gen có chức dTDP-4-keto-6-deoxyglucose 3-epimerase ngân hàng gen giới NCBI Hình 8: So sánh trình tự axit amin gerF với gen có chức chủng Streptomyces, KCTC 0041BP đăng ký ngân hàng gen Hình 9: So sánh trình tự axit amin gerF với gen có chức chủng streptomyces sp Mg1 đăng ký ngân hàng gen Hình 10: So sánh trình tự axit amin gerF với gen có chức chủng streptomyces bikiniensis đăng ký ngân hàng gen Hình 11: Trình tự axit amin gerF với enzyme có chức xạ khuẩn khác đăng ký ngân hàng gen Hình 12: Sơ đồ biểu gen gerF vào vật chủ E.coli BL 21 DE3 Hình 13: Kết điện di sản phẩm chuyển gen gerF vào vector biểu pET32a(+) Hình 14 : Điện di enzyme gerF nồng độ IPTG khác Hình 15: Điện di enzyme gerF điều kiện nhiệt độ khác Hình 16: Điện di enzyme gerF điều kiện thời gian khác Khóa luận tốt nghiệp Lê Đỗ Huyền Trang-CNSH 0802 Khóa luận tốt nghiệp Lê Đỗ Huyền Trang-CNSH 0802 Mở đầu Ngày công nghệ sinh học coi năm nghành công nghệ tiên phong nhân loại tiến vào kỷ 21 Trong cơng nghệ sinh học vi sinh vật sản xuất kháng sinh ngày có nhiều ứng dụng Y học lĩnh vực khác bảo vệ sức khỏe phục vụ cho đời sống người có bước phát triển vượt bậc Việc ứng dụng tiến di truyền học phân lập sàng lọc, cải tạo giống cho phép tạo chủng giống vi sinh vật có khả tổng hợp hoạt chất có hiệu suất cao Trước tình trạng loại vi sinh vật gây bệnh biến đổi gây hại cho đời sống người ngày nhiều thách thức cơng nghệ sản xuất kháng sinh khơng phải Dihydrochalcomycin kháng sinh thuộc nhóm Macrolide (PKS – Polyketide synthase) có 16 cacbon, nhóm kháng sinh có khả ức chế hoạt động vi khuẩn mạnh Quá trình sinh tổng hợp kháng sinh có tham gia nhiều loại gen gerF thuộc nhóm gen tham gia sinh tổng hợp gốc đường khử dTDP-6deoxy-D-Allose cấu trúc kháng sinh dihydrochalcomycin, đóng vai trị quan trọng chưa có nghiên cứu thức gen Vì nhóm nghiên cứu nghiên cứu việc biểu gen GerF nhóm gen sinh tổng hợp gốc đường khử dTDP6deoxy-D-Allose cấu trúc kháng sinh Dihydrochalcomycin Đề tài nghiên cứu: Nghiờn cứu biểu gen GerF nhóm gen sinh tổng hợp gốc đường khử dTDP-6deoxy-D-Allose cấu trúc kháng sinh Dihydrochalcomycin Mục tiêu đề tài: Biểu gen gerF tế bào E.coli BL21 DE3 tìm điều kiện thích hợp để biểu protein nội bào (Enzyme nội bào) Khóa luận tốt nghiệp Lê Đỗ Huyền Trang-CNSH 0802 Nội dung nghiên cứu: - Kiểm tra vector chứa gen gerF (pGerF) - Sử dụng phần mềm phân tích chức gen gerF - Nghiên cứu biểu gen gerF vật chủ E.Coli BL21 DE3