Khóa luận tốt nghiệp Lê Đỗ Huyền Trang CNSH 0802 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN GERF TRONG NHểM GEN SI[.]
Trang 1VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘIKHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC
KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN GERF TRONG NHểM GEN SINH
TỔNG HỢP GỐC ĐƯỜNG KHỬ DTDP-6DEOXY-D-ALLOSE CỦACẤU TRÚC KHÁNG SINH DIHYDROCHALCOMYCIN
Giáo viên hướng dẫn: TS TẠ THỊ THU THỦY
Sinh viên thực hiện : LÊ ĐỖ HUYỀN TRANG
Líp : CNSH-0802
Trang 2LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy giáo cô giáo, các cán bộkhoa Công Nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mở Hà Nội đã trang bị kiến thức,tạo điều kiện về máy móc, trang thiết bị và giúp đỡ em trong q trình hồnthành khóa luận.
Em xin được bày tỏ lịng biết sâu sắc tới TS.Tạ Thị Thu Thủy người đãgiao đề tài và trực tiếp hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em trongquá trình thực nghiệm
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới kỹ sư Phạm Thị Thỳy Võn và kỹsư Nguyễn Thị Huế đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt cho em những kiếnthức cơ bản nhất từ những ngày đầu trong quá trình hồn thành khóa luận
Xin gửi lời cảm tới gia đình, bạn bè đó luụn quan tâm, động viên emtrong suốt thời gian qua
Do thời gian và khả năng bản thân cịn nhiều hạn chế nên trong bàikhóa luận cịn có nhiều điển thiếu sót Rất mong được sự chỉ bảo của các thầygiáo, cơ giáo, sự góp ý của các bạn để bài khóa luận được hồn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 25 tháng 05 năm 2012
Sinh viên
Trang 3MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU ĐẶC BIỆTDANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ KHÁNG SINH 3
1.1 Lịch sử phát triển của kháng sinh 3
1.2 Giới thiệu chung về kháng sinh .4
1.2.1 Định nghĩa về kháng sinh 4
1.2.2 Đơn vị kháng sinh .5
1.2.3 Phân loại kháng sinh 5
1.2.4 Cơ chế tác động của kháng sinh 7
1.2.4.1 Ức chế quá trình tổng hợp vách tế bào vi khuẩn 8
1.2.4.2 Ức chế chức năng của màng nguyên sinh chất 8
1.2.4.3 Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein 8
1.2.4.4 Ức chế quá trình tổng hợp axit nucleic .9
1.3 Ứng dụng của kháng sinh .9
1.3.1 Ứng dụng kháng sinh trong y học .9
1.3.2 Ứng dụng kháng sinh trong chăn nuôi 10
1.3.3 Ứng dụng kháng sinh trong trồng trọt .10
1.3.4 Ứng dụng kháng sinh trong công nghệ thực phẩm 10
1.4.Tớnh kháng thuốc 11
1.5.Giới thiệu về kháng sinh dihydrochalcomycin .11
1.6.Giới thiệu về đường dTDP-6deoxy-D-Allose .13
1.6.1 Gốc đường khử trong cấu trúc kháng sinh 13
1.6.2 Đường dTDP-6deoxy-D-Allose 14
1.6.3 Giới thiệu về gen gerF 14
1.7 Enzyme giới hạn 15
Trang 41.8.1 Vector 16
1.8.2 Vector biểu hiện pET-32a(+) 16
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
2.1 Hóa chất và thiết bị 18
2.1.1 Húa chất 18
2.1.2 Thiết bị, máy móc sử dụng trong nghiên cứu 20
2.2 Chủng vi sinh vật và điều kiện nuôi cấy 20
2.2.1.Vi sinh vật 20
2.2.2 Điều kiện nuôi cấy 20
2.3 Môi trường nuôi cấy 20
2.4 Các phương pháp nghiên cứu .`21
2.4.1 Phương pháp đo giá trị OD 21
2.4.2 Phương pháp chuyển gen vào vi khuẩn E.coli BL21 DE3 .21
2.4.2.1 Chuẩn bị tế bào khả biến 22
2.4.2.2 Chuyển gen vào vi khuẩn E.coli BL21DE3 23
2.4.3 Tách chiết DNA plasmid 23
2.4.4 Điện di DNA agarose gel 24
2.4.5 Phương pháp biểu hiện protein trong E.coli BL21-DE3 25
2.4.5.1 Biểu hiện protein ở các nồng độ IPTG khác nhau 26
2.4.5.2 Biểu hiện protein ở các nhiệt độ khác nhau 26
2.4.5.3 Biểu hiện protein ở các điều kiện thời gian khác nhau 27
2.4.6.Phương pháp tách protein thô .27
2.5 Điện di protein .28
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31
3.1 Phân tích trình tự axit amin của gen gerF 31
3.2 Kết quả kiểm tra plasmid có trong tế bào vật chủ E.coli BL21 DE3 35
3.3 Kết quả biểu hiện enzyme GerF 37
3.3.1 Nồng độ IPTG để biểu hiện protein 37
Trang 53.3.3 Ảnh hưởng của điều kiện thời gian đến biểu hiện protein 40
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN 42
4.1 Kết luận 42
Trang 6CÁC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU ĐẶC BIỆTDNARNAaaAmpdNTPLBODSDSEDTATAETBEIPTGTESol bpORFAcid deoxyribonucleicAcid ribonucleicAmino axitAmpicillinDeoxyribonucleotide 5’- triphosphatesLuria-BertaniOptical Density
Sodium dodecyl sulphate
Ethylen diamin tetra-acid aceticTris- acetate –EDTA
Tris- base- EDTA
Isopropyl-β-D-thiogalacto-pyranosideTrophectoderm
Sollution Base pare
Trang 7DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 1 : Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Hình 2: Cấu trúc kháng sinh dihydrochalcomycin
Hình 3: Nhóm gen deoxysugar tham gia sinh tổng hợp dihydrochalcomycin
Hình 4: Dự đốn chức năng của gen gerF trong sinh tổng hợp gốc đường khử dTDP- mycinose thành phần quan trọng trong cấu trúc kháng sinh
dihydrochalcomycin
Hình 5: Vector biểu hiện pET-32a(+)
Hình 6: Sơ đồ điện di protein trên gel acrylamide
Hình 7: So sánh trình tự nucleotide gen gerF với trình tự của một số gen có chức năng dTDP-4-keto-6-deoxyglucose 3-epimerase trong ngân hàng gen thế
giới NCBI
Hình 8: So sánh trình tự axit amin gerF với gen có cùng chức năng của chủng Streptomyces, KCTC 0041BP đăng ký trên ngân hàng gen
Hình 9: So sánh trình tự axit amin gerF với gen có cùng chức năng của chủngstreptomyces sp Mg1 đăng ký trên ngân hàng gen
Hình 10: So sánh trình tự axit amin gerF với gen có cùng chức năng của chủng streptomyces bikiniensis đăng ký trên ngân hàng gen
Hình 11: Trình tự axit amin của gerF với các enzyme có cùng chức năng của
xạ khuẩn khác đăng ký trên ngân hàng gen
Hình 12: Sơ đồ biểu hiện gen gerF vào vật chủ E.coli BL 21 DE3
Hình 13: Kết quả điện di sản phẩm chuyển gen gerF vào vector biểu hiện
pET-32a(+)
Trang 9Mở đầu
Ngày nay công nghệ sinh học được coi là một trong năm nghành côngnghệ tiên phong của nhân loại tiến vào thế kỷ 21 Trong đó cơng nghệ sinhhọc vi sinh vật sản xuất kháng sinh ngày càng có nhiều ứng dụng trong Y họcvà các lĩnh vực khác bảo vệ sức khỏe và phục vụ cho đời sống của con ngườivà đang có những bước phát triển vượt bậc.
Việc ứng dụng các tiến bộ di truyền học trong phân lập sàng lọc, cải tạogiống cho phép tạo ra những chủng giống vi sinh vật có khả năng tổng hợpcác hoạt chất mới có hiệu suất cao.
Trước tình trạng các loại vi sinh vật gây bệnh biến đổi gây hại cho đờisống con người ngày càng nhiều vì vậy thách thức đối với cơng nghệ sản xuấtkháng sinh khơng phải ít.
Dihydrochalcomycin là kháng sinh thuộc nhóm Macrolide (PKS –Polyketide synthase) có 16 cacbon, nhóm kháng sinh này có khả năng ức chếhoạt động của vi khuẩn rất mạnh Quá trình sinh tổng hợp kháng sinh này có
sự tham gia của nhiều loại gen trong đó gerF thuộc nhóm gen tham gia sinh
tổng hợp gốc đường khử dTDP-6deoxy-D-Allose của cấu trúc kháng sinhdihydrochalcomycin, tuy đóng vai trị quan trọng nhưng vẫn chưa có nghiêncứu chính thức về gen này Vì vậy nhóm nghiên cứu đã nghiên cứu về việc
biểu hiện gen GerF trong nhóm gen sinh tổng hợp gốc đường khử
dTDP-6deoxy-D-Allose của cấu trúc kháng sinh Dihydrochalcomycin
Đề tài nghiên cứu: Nghiờn cứu biểu hiện gen GerF trong nhóm gensinh tổng hợp gốc đường khử dTDP-6deoxy-D-Allose của cấu trúc kháng sinhDihydrochalcomycin.
Mục tiêu đề tài: Biểu hiện được gen gerF trong tế bào E.coli BL21 DE3
Trang 10Nội dung nghiên cứu:
- Kiểm tra vector chứa gen gerF (pGerF)
- Sử dụng phần mềm phân tích chức năng của gen gerF
Trang 11CHƯƠNG I
TỔNG QUAN VỀ KHÁNG SINH1.1 Lịch sử phát triển của kháng sinh
Từ thời xa xưa, trong dân gian đã biết dùng nấm mốc trên đậu phụ đểđắp chữa mụn nhọt Từ mấy thế kỷ trước tại Châu Âu, Châu Mỹ người ta đãbiết dựng bỏnh mỳ, ngô hay giầy da cũ đã mốc để điều trị vết lở loét, sưng mủtrên da Theo quan điểm của khoa học hiện nay thì mốc trên đậu phụ, trờnbỏnh mỳ, thực tế có chứa chất kháng sinh, chỉ có điều người xưa chưa biếtđến vi khuẩn, hay lại càng không biết khái niệm chất kháng sinh là gì
Cho đến năm 1928, một nhà khoa học scotland là Alexander Flemming,lần đầu tiên thấy trong môi trường nuôi cấy tụ cầu vàng nếu lẫn nấm thìkhuẩn lạc gần nấm sẽ không phát triển được Nấm này được đặt tên là
penicilium notatum, hoạt chất tiết ra gọi là penicilin.
Năm 1929, ông công bố penicilin trước dư luận công chúng Ơngkhẳng định rằng chất này có thể trở thành một thứ thuốc quan trọng nhưngơng khơng có khả năng và kỹ thuật để tách chiết.
Năm 1938, Flemming nhận được thư của hai nhà khoa học từ trườngđại học Oxford là Ernst Boris Chain và Howard Walter Florey, đề nghị hợptác với ông tiếp tục thực hiện cơng trình nghiên cứu về penicilin Ngày25/5/1940, họ đó tỏch chiết và thử nghiệm thành cơng penicilin trên chuột
Năm 1941, nhúm đó chọn được loại nấm penicilium ưu việt nhất làchủng penicilium chrysogenium, tạo ra loại penicilin có hoạt tính cao hơn cả
Trang 12Năm 1942 bắt đầu điều trị có hiệu quả bệnh nhiễm trùng Năm 1943dự án sản xuất penicilin được chính phủ Mỹ đặc biệt chú ý, cho đến năm1944, penicilin đã được sản xuất ở quy mô lởn Mỹ để phục vụ chữa trị chothương bệnh binh trong chiến tranh thế giới thứ II Sau đó Nga và một sốnước khác cũng sản xuất được penicilin G và penicilin V Việc phát hiện rapenicilin tạo ra một bước ngoặt lớn trong lịch sử y học thế giới
Cũng trong năm 1944, waksman tìm ra streptomycin bởi ni cấy nấm
streptomycin griseus và ơng gọi đó là kháng sinh
Đến nay các nhà khoa học thông báo đã phát minh được hơn 10000chất kháng sinh tự nhiên trong số đó hơn 2000 chất do thực vật tạo ra, khoảng7000 chất do vi sinh vật tổng hợp trong số này có khoảng 100 chất được ứngdụng trong y học và một số lĩnh vực khác
Từ những kháng sinh đã biết các nhà nghiên cứu đã điều chế được hàngngàn dẫn chất mới là các kháng sinh bán tổng hợp và trong số này có khoảng50 chất cũng đã được đưa vào sử dụng
Đồng thời có 2 kháng sinh được sản xuất hồn tồn bằng tổng hợp hóahọc đó là cloramphenicol và pyrrolnitrin
1.2 Giới thiệu chung về kháng sinh1.2.1 Định nghĩa về kháng sinh
Có rất nhiều định nghĩa về kháng sinh và theo sự phát triển của khoahọc thỡ cỏc định nghĩa dần dần được thay đổi và hoàn thiện hơn, cụ thể:
Năm 1941, bắt đầu sản suất kháng sinh penicilin để dùng trong lâmsàng Khi đó kháng sinh được coi là “những chất do vi sinh vật tiết ra ( vikhuẩn, vi nấm) có khả năng kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật khỏc”[1]
Trang 13Với sự phát triển của khoa học, ngày nay kháng sinh được định nghĩa “là tất cả các hợp chất có nguồn tự nhiên ( từ thực vật hay do vi sinh vật tiết ra)hoặc tổng hợp, bán tổng hợp với đặc tính là ngay ở nồng độ rất thấp có khảnăng đặc hiệu ức chế hoặc tiêu diệt chọn lọc các vi sinh vật gây bệnh, đồngthời không có tác dụng hoặc tác dụng yếu lên người, động vật hoặc thực vậtđược điều trị”[17]
1.2.2 Đơn vị kháng sinh
Đơn vị kháng sinh là lượng kháng sinh tối thiểu hòa tan trong một thểtích mơi trường xác định có tác dụng ức chế hay tiêu vi sinh vật kiểm định.[2]
VD1: Đơn vị hoạt lực của penicilin là lượng penicilin ít nhất hịa tan
vào 50ml canh thang có tác dụng ức chế sự phát triển của staphylococcusaureus 209P
VD2: Đơn vị hoạt lực của streptomycin là lượng streptomycin ít nhất
hịa tan trong 1ml canh thang có tác dụng ức chế sự phát triển của E.coli
Năng lực tích tụ kháng sinh của chủng hay nồng độ chất kháng sinhthường được biểu thị bằng các đơn vị là: mg/ml, àg/ml, hay đơn vị kháng sinhUI/ml (hay UI/g)
1.2.3 Phân loại kháng sinh
Phân loại kháng sinh nhằm khái quát một cách hệ thống danh mục cáckháng sinh ngày càng nhiều thêm Có thể phân loại dựa vào phổ tác dụng, cơchế tác dụng, phân loại theo nguồn gốc, con đường sinh tổng hợp hay cấu trúchóa học Tuy nhiên phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học là khoa họcnhất.[1]Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học gồm có 9 nhóm khángsinh chính:
Nhóm 1: Các kháng sinh cacbonhydrat
Các saccarid thuần nhất: Njirimycin
Các aminoglycosid, Các N-glycosid : StreptomycinCác ortozomycin: Verninomycin
Trang 14Nhóm 2: Các lacton macrocyclic
Các kháng sinh macrolid : ErythromycinCác kháng sinh polyen: Nystatin
Các kháng sinh anzamycin : RifamycinCác kháng sinh macrotetrolid : Tetranactin
Nhóm 3: Các kháng sinh quinon và dẫn xuất
Các kháng sinh tetracyclin: TetracyclinCác kháng sinh antracyclin: AdriamycinCác kháng sinh naftoquinon: ActinorodinCác kháng sinh benzoquinon: Mitomycin
Nhóm 4: Các kháng sinh peptid và axit amin
Các dẫn chất axit amin: CycloserinCác kháng sinh β-lactam: PenicilinCác kháng sinh peptid: Bacitracin
Các kháng sinh cromopeptid: ActinomycinCác kháng sinh depcipeptid: ValinomycinCác peptid tạo kelat: Bleomycin
Nhóm 5: Các kháng sinh dị vịng chứa Nitơ
Các kháng sinh nucleozid: Polioxin
Nhóm 6: Các kháng sinh dị vịng chứa oxy
Kháng sinh polyete: Monenzin
Nhóm 7: Các kháng sinh mạch vòng no
Các dẫn chất alkan: CycloheximidKháng sinh steroid: Axit fuzidic
Nhóm 8: Các kháng sinh chứa nhân thơm
Dẫn chất benzen: Chloramphenicol
Các chất nhân thơm ngưng tụ:griseofulvinCác ete thơm: Novobiocin
Trang 15Các chất chứa phospho: Phosphomycin
1.2.4 Cơ chế tác động của kháng sinh
Các kháng sinh tác dụng cơ bản qua việc ức chế các phản ứng tổng hợprất khác nhau của tế bào vi sinh vật gây bệnh Chúng liên kết vào các vị tríchính xác hay các phân tử đích của tế bào vi sinh vật mà tạo ra các phản ứngtrao đổi chất Cỏc đớch tác dụng đặc trưng cho từng nhóm kháng sinh, tuynhiên trong nhiều trường hợp vẫn chưa biết được chính xác hết các cơ chế tácđộng của kháng sinh.[2] Các mức tác dụng kháng sinh đối với vi khuẩn đượcthể hiện như sau: (hình 1)
Trang 161.2.4.1 Ức chế quá trình tổng hợp hình thành vách tế bào vi khuẩn
Chức năng của màng tế bào là: Giữ hình dạng đặc trưng của vi khuẩn,che đỡ cho màng tế bào không bị phá vỡ dưới áp lực thẩm thấu cao ở bêntrong tế bào, làm khuôn mẫu để tổng hợp vách tế bào mới
Kháng sinh tác động lên quá trình hình thành vách tế bào làm cho vikhuẩn dễ bị các đại thực bào phá vỡ màng tế bào do thay đổi áp suất thẩmthấu với cơ chế:
Giai đoạn 1: Kháng sinh gắn vào thụ thể PBPs ức chế tranpeptidasengăn tổng hợp peptidoglycan Những thụ thể khác nhau có ái lực khác nhauđối với một loại thuốc
Giai đoạn 2: Hoạt hóa các enzyme tự tiêu ly giải tế bào trong môi
trường đẳng trương làm vi khuẩn Gram(-) cú vách tế bào khơng hồn chỉnh,các vi khuẩn Gram(+) biến thành dạng hình cầu khơng có vách tế bào
1.2.4.2 Ức chế hình thành màng nguyên sinh chất
Chức năng của màng nguyên sinh chất: Thẩm thấu chọn lọc, vậnchuyển chủ động và kiểm soát các thành phần bên trong màng tế bào với cơchế làm mất đi sự toàn vẹn của tế bào vì vậy các phân tử có khối lượng lớn vàcác ion bị thốt ra ngồi từ đó tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh, màng tế bào vikhuẩn và vi nấm dễ bị phá vỡ bởi một số tác nhân như: Imidazole tác động
lên vi nấm, polymycin tác động lên vi khuẩn Gram(-) làm mất đi sự toàn vẹn
của màng của tế bào
1.2.4.3 Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein
Trang 17polisomes thành monosomes dẫn đến vi khuẩn mất chức nằng tổng hợpprotein
Nhóm aminoglycosid gắn với receptor trên tiểu phân 30S củaribosome làm cho q trình dịch mã khơng chính xác.
Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phân 50S của ribosome ức chếenzyme peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các axit amin với các chuỗipolypeptide.
Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phân 50S của ribosomelàm ngăn cản q trình dịch mó cỏc axit amin mới vào chuỗi polypeptide.
1.2.4.4 Ức chế quá trình tổng hợp axit nucleic
Nhóm refampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản q trìnhsao mã tạo thành mRNA (RNA thơng tin).
Nhóm quinon ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm cho haimạch đơn của DNA không thể duỗi xoắn làm ngăn cản q trình nhân đơi củaDNA.
Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA( axit paminobenzonic) có tácdụng cạnh tranh PABA và ngăn cản q trình tổng hợp axit nucleotid.
Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác có q trình tạo nhânpurin làm ức chế quá trình tạo axit nucleic
1.3 Ứng dụng của kháng sinh
1.3.1 Ứng dụng kháng sinh trong y học
Penicillin là kháng sinh đầu tiên được sử dụng trong y học từ năm1940, sau đó một loạt các chất kháng sinh khác từ xạ khuẩn được phát minhra và nhanh chóng được ứng dụng để điều trị các bệnh nhiễm trùng hiểmnghèo
Trang 18Bleomycin, Daunorubicin và Mitomycin C kháng ung thư Nistattin vàGriseofulvin kháng nấm,
1.3.2 Ứng dụng kháng sinh trong chăn nuôi
Kháng sinh được sử dụng như chất kích thích tăng trọng gia súc giacầm, giảm chi phí thức ăn như: Enduracidin, mikamicin, siomicin, thiopeptin,thiotrepton,
- Tác dụng lên hệ vi sinh vật đường ruột làm tăng số lượng vi sinh vật có íchtrong ruột, tăng cường tổng hợp vitamin, tăng cường tái hấp thụ thức ăn,làm giảm các vi sinh vật có hại tiết ra chất độc, giúp động vật tăng cườngtrao đổi chất nhanh
- Một cách gián tiếp tăng cường điều tiết hoocmon đặc biệt là hoocmon sinhtrưởng giúp cơ thể lớn nhanh
1.3.3 Ứng dụng kháng sinh trong trồng trọt
Sử dụng thuốc hóa học trong bảo vệ thực vật đưa lại hiệu quả kinh tế rõrệt nhưng có nhiều nhược điểm như: Khó phân hủy trong đất dẫn đến tích lũycác chất độc, thay đổi hệ sinh thái, ảnh hưởng đến đời sống con người cịn sửdụng kháng sinh trong trồng trọt có nhiều ưu điểm: Hoạt tính kháng sịnhmạnh đối với mầm bệnh, dễ thấm vào các tế bào cây, liều điều trị không hạiđến cây, không gây ảnh hưởng hoặc gây ảnh hưởng thấp đến môi trường sốngcủa các sinh vật khác và môi trường sống của con người, một số kháng sinhđược sử dụng như:
- Trichotexin: Chống nhiều loại nấm gây bệnh như Botrytis cenerea,helmintosporium gây bệnh cho bơng
- Kasugamycin: Có thể thay cho blasticidin chữa bệnh vàng lụi và độc tínhvới người loại thấp
Trang 191.3.4 Ứng dụng kháng sinh trong công nghiệp thực phẩm
Bảo quản thực phẩm tươi và thực phẩm đóng hộp là vấn đề rất quantrọng Nguyên nhân làm hỏng thực phẩm là do vi khuẩn gây ra, sau khi phânhủy thực phẩm nú cũn tiết ra chất độc Một số kháng sinh được sử dụng trongbảo quản như: Pimaricin là chất diệt nấm bảo vệ bề mặt thực phẩm, tilozin tácdụng chống lại các bào tử vi khuẩn, nizin có tác dụng chống lại clostridium,
1.4 Tớnh kháng thuốc
Khi tìm ra penicilin nhân loại có trong tay một vũ khí thần kỳ chống lạicác bệnh nhiễm trùng do các vi khuẩn Gram(+) gây ra: Staphylococcus,streptococcus, Sau đó streptomycin được phát minh(1944) có tác dụng lên vikhuẩn Gram(-) và trực khuẩn lao Lồi người tưởng như bình an vỡ cú trong
tay những “thần dược” để chống lại các bệnh nhiễm trùng tuy nhiên việc sửdụng kháng sinh chưa hợp lí hay nói đúng là sử dụng sai kháng sinh trongđiều trị, chăn nuôi làm xuất hiện ngày càng nhiều các vi sinh vật kháng khángsinh làm cho kháng sinh khơng cịn là thần dược nữa.[1]
Định nghĩa: Kháng thuốc là hiện tượng vi sinh vật mất đi tính nhạy cảmban đầu của nó trong một thời gian hay vĩnh viễn với tác dụng của kháng sinhhay hóa trị liệu.[1]
Kháng thuốc tự nhiên: Hiện tượng vi sinh vật đó khỏng thuốc từ ban
đầu, có sẵn trong gen (proteus khỏng các tetracyclin, streptococus nhóm D
kháng lincomycin) Về mặt sinh húa cú 2 cơ chế quan trọng: Đó là tính thấmcủa tế bào hay sự thiếu vắng phân tử đích.
Kháng thuốc mới nhận: Khi xử lý vi sinh vật với kháng sinh thì trongsố đú cú một số cá thể có khả năng sống sót trong mơi trường có hàm lượngkháng sinh cao đáng kể so với vi sinh vật có cùng nguồn gốc.
Điều đó lý giải mỗi ngày lại có rất nhiều các loại kháng sinh mới đượcnghiên cứu bào chế để chống lại các loại vi sinh vật kháng thuốc ngày cànggia tăng
Trang 20Dihydrochalcomycin là kháng sinh thuộc nhóm Macrolide (PKS –Polyketide synthase) có 16 cacbon.[8] Nhóm kháng sinh này có khả năng ứcchế hoạt động của vi khuẩn rất mạnh bằng cách các kháng sinh liên kết vớitiểu phần lớn 50S ribosome của vi khuẩn từ đó ức chế q trình sinh tổng hợpprotein của vi khuẩn.[9]
Dihydrochalcomycin được tách chiết từ chủng streptomyces sp,
KCTC0041 Bp Dihydrochalcomycin có hoạt tính chống lại các vi khuẩn
Gram(+), là kháng sinh nhóm macrolide có vai trị ứng dụng quan trọng và
vượt trội hơn so với các kháng sinh macrolide 12 hay 14 cacbon bởi khángsinh nhóm này chưa có hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn.[9]
Dihydrochalcomycin có thể liên kết trực tiếp với trung tâm hoạt độngpeptidyltranferase của vi khuẩn và từ đó bất hoạt q trình sinh tổng hợpprotein của vi khuẩn mà những kháng sinh thuộc nhóm Macrolide có 12, 14cacbon khơng liên kết trực tiếp được.[14](Hình 2)
Hình 2: Cấu trúc kháng sinh dihydrochalcomycin
Cấu trúc kháng sinh dihydrochalcomycin gồm 3 thành phần chính: 2gốc đường D-chalcose và D-mycinose gắn với lõi macrolacton tại vị trí lầnlượt là C5 và C20 thông qua cầu nối O-glycosydic
Trang 21kháng sinh này Các gen tham gia sinh tổng hợp đường khử chalcose và D-mycinose đã được xác định trong cosmid Geri5 và đã được giải trình tự từcosmid.
1.6.Giới thiệu về đường dTDP-6deoxy-D-Allose1.6.1 Gốc đường khử trong cấu trúc kháng sinh
Đường khử là gốc đường đặc biệt được tìm thấy rất nhiều trong cấutrúc của tế bào vi khuẩn, trong tế bào nấm, trong cấu trúc của nhiều chấtkháng sinh, chất chống ung thư hay rất nhiều chất có hoạt tính sinh học.[3]
Trong phân tử chúng có nhiều hơn một nhóm hydroxyl(OH) được thaythế bởi nguyên tử H hay cỏc nhúm chức khác như amino, methyl, alkyl, cỏcloại đường này có thể tồn tại ở dạng đường đơn hay đường đa hoặc phânnhánh là dẫn xuất của các chất trao đổi bậc hai trong các hợp chất tự nhiên.[3]Trong cấu trúc tế bào đường khử tham gia tạo thành cấu trúcpeptidoglycon là thành phần của lớp thành tế bào của rất nhiều loại vi sinh vật
đặc biệt là một số vi khuẩn Gram(+) hoặc hình thành lớp lypopolysacharidetrong cấu trúc màng tế bào của vi khuẩn Gram(-)
Nếu mất đi gốc đường khử trong cấu trúc tế bào của một số vi sinh vậtsẽ gây ức chế sinh trưởng của tế bào hoặc tiêu diệt vi sinh vật.[11]
Trong các hợp chất có hoạt tính sinh học đường khử đóng vai trị quantrọng trong việc xác định hoạt tính của chúng, nếu mất gốc đường trong cấutrúc thì hoạt tính sinh học của hợp chất đó cũng bị mất.[12]
Gốc đường khử trong nhóm kháng sinh enedine có vai trị quyết địnhhoạt tính kháng khuẩn của chất kháng sinh, gốc đường rhamnose trong khángsinh calichaemicin đóng vai trị làm cầu nối liên kết phần tử kháng sinh vớienzyme tham gia vào quá trình sao mã hay sinh tổng hợp mRNA.[11]
Trang 221.6.2 Đường dTDP-6deoxy-D-Allose
Đường dTDP-6deoxy-D-Allose là đường trung gian trong con đườngsinh tổng hợp gốc đường D-mycinose là gốc đường cấu tạo kháng sinhdihydrochalcomycin Gốc đường dTDP-6-glucose-β-D-Allose dưới tác dụngcủa các enzyme mã hóa bởi các gen khác nhau được chuyển hóa thành đườngD-mycinose, D-mycinose là thành phần quan trọng của kháng sinhDihydochalcomycin Trong cấu trúc kháng sinh dihydrochalcomycin, gốcđường mycinose đóng vai trị là nhóm liên kết với miền II tiểu phần 23SrRNA của vi khuẩn với vòng macrolacton của kháng sinhdihydrochalcomycin từ đó tăng khả năng chống lại tế bào vi khuẩn.[9]
1.6.3 Giới thiệu về gen gerF
Nhóm gen được dự đốn là tham gia sinh tổng hợp đường D-mycinose
trong quá trình tổng hợp kháng sinh dihydrochalcomycin gồm 6 gen là: gerD,gerE, gerF, gerK, gerM2, gerM3 đã (hình 4)[20]
Trong đó gerF là gen mã hóa cho enzyme dTDP-4-keto-6-deoxyglucose3-epimerase, tham gia vào sinh tổng hợp đường của kháng sinhdihydrochalcomycin thuộc nhóm macolide từ streptomycin sp.KCTC0041BP.GerF có số axit amin là 196, độ dài của gen gerF là 588 bp.[4]
Trang 23Cơ chế: Enzyme gerF (dTDP-4-keto-6-deoxyglucose 3-epimerase)
cùng với sự tương tác của enzyme gerK1(dTDP-4-keto-6-deoxyglucose
reductase) tạo đồng phân cấu trúc quang học chuyển vị trí OH ở vị trí cacbonsố 3 của đường dTDP-4-keto-6-deoxygluco sau đó khử cacbon số 4-keto củađường deoxy-D-Allose, xúc tác chuyển hóa dTDP-4-keto-6-deoxyglucose thành đường dTDP-4-keto-6-deoxy-β-D-Allose Nhờ một sốenzyme thì gốc đường 6-deoxy-β-D-Allose thành gốc đường dTDP-mycinose và gốc đường dTDP-mycinose.[16] Cuối cùng là quá trình tạo kháng sinhDihydrochalcomycin (hình 3)
Tuy có vai trị quan trọng nhưng vẫn chưa có nghiên cứu chính thức vềloại gen này
Hình 4: Dự đốn chức năng của gen gerF trong sinh tổng hợp gốc đường khửdTDP- mycinose thành phần quan trọng trong cấu trúc kháng sinh
dihydrochalcomycin.
1.7 Enzyme giới hạn
Trang 24RE) mà bị cắt từ các nhiễm sắc thể hoặc gen khác nhau có thể được nối lại vớinhau Nhiều kỹ thuật sinh học phân tử và enzyme giới hạn đều dựa vào cácenzyme giới hạn.[19]
1.8 Giới thiệu về vector biểu hiện pET-32a(+)1.8.1 Vector
Vector là một hay nhiều đoạn DNA có kích thước nhỏ cho phép cài(gắn) các đoạn DNA cần thiết, có khả năng tái bản khơng phụ thuộc vào sựphân chia của tế bào, tồn tại trong tế bào vật chủ qua nhiều thế hệ khụng gõybiến đổi gen của tế bào vật chủ.[5]
Vector biểu hiện: Là những vector tỏch dòng mang promoter mạnh,
cho phép biểu hiện đồng thời cả gen chỉ thị và gen tỏch dũng tạo nên cácprotein lai.[5]
Một vector biểu hiện gen gồm các thành phần chủ yếu: promoter mạnh,trình tự sao chộp(ori), vị trí khởi đầu phiờn mó, vị trớ bám của riboxom, tínhiệu kết thúc mó, cỏc trình tự đa cắt nối (MCS) và các gen chỉ thị
Vector biểu hiện mạnh là vector có đặc điểm: Có khả năng tạo số lượnglớn các bản sao trong tế bào vật chủ(ori mạnh), promoter hoạt động mạnh,dịch mã tạo nhiều proteinn lai, đoạn trình tự MSC có nhiều vị trí cắt đặc hiệucủa nhiều loại enzyme giới hạn,
1.8.2 Vector biểu hiện pET-32a(+)
Trang 25Điều đặc biệt là trình tự 6aa histidin tích điện (-) và nó gắn với proteinsản phẩm của gen cần biểu hiện Vì vậy khi tinh sạch dựa vào đặc tính nàyngười ta sẽ đưa sản phẩm vào mơi trường có điện tích (+) để lọc sản phẩm.[21][22] Vị trí duy nhất để chuyển gen được biểu hiện trên vector Vùng biểuhiện hay vùng cloning của gen cần biểu hiện được gắn với T7 promotor, đâylà promotor mạnh giúp cho điều tiết tăng cường quá trình tổng hợp protein.
Bố trí thiết kế vector pET-32a(+) gồm có:
- Promotor T7: 764-780 Nu- T7 transcription start: 763 Nu
- Trình tự coding 6xHis•Tag: 327-344 Nu (6xHis•Tag có chứa 6aa histidinđược sử dụng để tinh sạch protein
Trang 26CHƯƠNG II
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 Hóa chất và thiết bị
2.1.1 Húa chất
- Cao nấm men, trypton, NACl, agar dùng trong môi trường nuôi cấy vi sinhvật.
- Enzyme giới hạn, enzyme RNAase được dùng trong tinh sạch DNA và cácphản ứng cắt loại bỏ RNA lẫn trong dung dịch DNA
- Kháng sinh Ampicilin, tạo mơi trường có kháng sinh trong ni cấy visinh vật có khả năng kháng kháng sinh, thử kháng sinh.
- TE buffer, isopropanol, cồn 700, 900, Solusion I, Solution II, Solution III:sử dụng trong quá trình tách chiết DNA Plasmid.
- Tris.Cl, EDTA, NaOH, SDS, potassium, acetate, nước cất, dùng pha dungdịch solution I, II, III
- Ethylbromine, agarose, TAE 5X, buffer loading dùng trong chạy điện di- Đĩa peptri dùng để nuôi cấy vi khuẩn.
- Ống phalcon 15ml, 50ml, bình tam giác 250ml ni cấy vi sinh vật.- Pipet, đầu côn, eppendoft, ống đong, găng tay,
1/ Chuẩn bị dung dịch đệm( buffer)
Được pha chế từ NaH2PO4 có tính axid nhẹ và NaHPO4 có tính kiềmnhẹ Dựa vào máy đo pH để điều chỉnh pH=7-7,2 thì thích hợp cho mơitrường ly tâm.
2/ Dung dịch dùng để tách chiết plasmid
Trang 27- 0,5M EDTA 2ml
- Nước: 95.5 ml hấp Solution I rồi bảo quản ở nhiệt độ 40CSolution II: Phá vỡ màng tế bào
- 5M NaOH: 4ml- 10% SDS: 10ml
- Nước: 86ml, bảo quản Solution II ở nhiệt độ 40CSolution III: Kết tủa protein và các chất
- Potassiumacetate( CH3COOK): 12.96g
- 100ml nước
- Điều chỉnh pH=4.8 bằng axit acetic bảo quản Solution III ở 40C3/ Dung dịch chạy điện di DNA(TAEX1)
TAE x50: Sử dụng để pha TAE x1
- Tris base: 242g
- Axit acetic (CH3COOH): 57.1ml- 0.5M EDTA (pH=8): 100ml
TAE x1:
Lấy 20ml TAE x50 bổ xung thêm 980ml nước cất ta thu được 1000ml TAEx1 dùng trong chạy điện di DNA.
4/ Dung dịch chạy điện di protein
- Acrylamide 30%(30% Acrylamide/0.8% bisacrylamide): Cho 30gAcrylamide, 0.8g N,N’-methylene-bisacrylamide, cho thêm nước vào để dungdịch đạt 100ml
- 4X TRIS-Cl/SDS,pH 6.8: Hòa tan 6.05g Tris Base và 4ml SDS 10% trong40 ml nước, dùng HCl 1N để điều chỉnh về pH=6.8 Bổ sung thêm nước đểdung dịch đạt 100ml
Trang 28- 5X SDS/electrophoresis buffer: Hòa tan 15.1g Tris Base, 72g glycin, 5gSDS trong 800ml nước Sau đó thêm nước để dung dịch đạt 1000ml.
Tất cả các chất sau khi pha bảo quản ở 40C và trong tối
Chú ý: Trong thao tác ở phịng thí nghiệm ln phải có thiết bị bảo hộvà mọi thao tác đều phải sử dụng găng tay.
2.1.2 Thiết bị, máy móc sử dụng trong nghiên cứu
- Tủ cấy UV dùng trong nuôi cấy vi sinh vật
- Nồi hấp vô trùng để hấp vô trùng các thiết bị và môi trường nuôi cấy- Máy voltex dùng để lắc, trộn, hịa tan dung dịch
- Tủ ấm để ni cấy vi sinh vật trong môi trường LB đặc- Máy ly tâm sử dụng trong tách chiết plasmid, tinh sạch DNA- Máy chạy điện di: Máy chạy điện di DNA và chạy điện di protein- Tủ lắc để nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường lỏng
- Tủ lạnh thường và tủ lạnh sõu dựng bảo quản môi trường và vi sinh vật- Cân điện tử dùng để cân hóa chất pha dung dịch và mơi trường ni cấy- Bình ổn nhiệt sử dụng trong quá trình tạo tế bào khả biến
- Máy soi gel có tia UV để quan sát DNA plasmid
2.2 Chủng vi sinh vật và điều kiện nuôi cấy2.2.1 Vi sinh vật
- Chủng vi khuẩn E.coli XL1-Blue được sử dụng làm vật chủ chuẩn bị
plasmid tái tổ hợp
- Chủng vi khuẩn E.coli BL21 làm vật chủ biểu hiện plasmid chứa genpGerF
2.2.2 Điều kiện nuôi cấy
- Chủng E.coli XL1-Blue, E.coli BL21 nuôi trong máy lắc ở điều kiện nhiệt
độ 370C trong môi trường LB lỏng và LB đặc trong tủ ấm 370C, với chủng đãchuyển gen thỡ nuụi trong mơi trường LB có bổ sung thêm kháng sinh tỉ lệ1àg/ml
Trang 29- Môi trường LB lỏng: + Cao nấm men: 5g/l+ Trypton: 10g/l+ NaCl: 10g/l
- Môi trường LB đĩa thạch(LB đặc)+ Cao nấm men: 5g/l
+ Trypton: 10g/l+ NaCl: 10g/l+ Aga: 20g/l
2.4 Các phương pháp nghiên cứu2.4.1 Phương pháp đo giá trị OD
Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sángcủa một chất ở một bước sóng xác định Trong nghiên cứu này ta cần đo giátrị OD của môi trường sau khi đã tăng sinh, nhằm xác định mật độ tế bào vi
khuẩn (E.coli BL21 DE3) có trong mơi trường.
Đối với E.coli ta xác định giá trị OD ở bước sóng 610nm tương ứng với
571x105 tế bào trong 1ml môi trường.
2.4.2 Phương pháp chuyển gen vào vi khuẩn E.coli BL21 DE3
1 Mục đích:
Sử dụng vi khuẩn E.Coli có khả năng nhận DNA cụ thể Ba phương
pháp được sử dụng: Chuyển đổi các plasmid/cosmid tái tổ hợp, chuyển đổihỗn hợp, phương pháp lựa chọn màu.
2 Hóa chất và vật liệu
- Đĩa LB đặc có kháng sinh Ampicilin- CaCl2 0,1M
- Buffer- Bể ổn nhiệt- Ống nghiệm
Trang 30- Tăm, pipet, đầu côn, eppendoft,
2.4.2.1 Chuẩn bị tế bào khả biến
Nguyên tắc: Màng tế bào vi khuẩn E.Coli có thể trở nên khả biến khi
được xử lý với Ca2+ Dưới tác dụng của CaCl2 màng tế bào đang ở thời kỳsinh trưởng trở nên xốp, tạo điều kiện cho DNA có thể chui qua lỗ màng vàotế bào.
1 Tiến hành
- Chủng vi khuẩn được cấy ria trên môi trường LB đặc và nuôi qua đêm ở370C
- Tăng sinh cấp I: Dùng đầu tăm đã được hấp vô trùng lấy một khuẩn lạcmọc riêng lẻ cho vào 3ml môi trường LB lỏng đựng trong ống fancol 15ml,lắc qua đêm ở 370C, 200 vũng/phỳt
- Tăng sinh cấp II: Chuyển 0,5 ml dịch nuôi cấp I sang 50ml mơi trường LBlỏng trong bình tam giác 250ml, lắc tiếp khoảng 3h đến khi OD610nm đạt0,6-0,8 chuyển dịch nuôi cấy sang ống ly tâm đã giữ lạnh trờn đỏ.
Thường sử dụng chủng vi khuẩn tăng sinh cấp I để chuẩn bị tế bào khả biến:- 3ml tăng sinh cấp I ly tâm 6000 vũng/phỳt ở 00C trong 10 phút
- Loại dịch ni thu xác tế bào
- Hịa cặn nhẹ nhàng trong 1ml-2ml CaCl2 0,1M
- Tiếp tục ly tâm 6000 vũng/phỳt ở 00C trong 10 phút, loại bỏ CaCl2 và thuxác tế bào, hòa cặn nhẹ nhàng trong 1ml-2ml CaCl2 0,1M
- Sau đó ly tâm 6000 vũng/phỳt ở 00C trong 10 phút, loại bỏ CaCl2 thu xáctế bào, bổ sung 100àl CaCl2, hòa cặn nhẹ nhàng giữ trong đá lạnh 45 phút- Chia vào mỗi ống eppendoft 50àl dịch tế bào, bổ sung 50àl glycerol 60%,làm đông lạnh nhanh bằng Nitơ lỏng và giữ ở -800C.
Trang 31- Cấy trải trên môi trường LB đặc có kháng sinh và khơng có kháng sinh đểkiểm tra.
2.4.2.2 Chuyển gen vào vi khuẩn E.coli BL21 DE3
- Sử dụng 100àl tế bào khả biến lưu trữ ở -800C, sau rã đông các tế bào phảiđược sử dụng hoặc vứt bỏ vỡ chỳng không thể tái đông lạnh.
- Đặt ống eppendoft chứa tế bào khả biến trực tiếp vào nước đá ngay sau khilấy ra khỏi tủ lạnh -800C
- Cho từ 1-5àl DNA plasmid (gen gerF) vào ống eppendoft có gắn nhãn
- Khi các tế bào khả biến đã tan hỳt 100àl dịch tế bào vào ống eppendoft cóchứa DNA sau đó voltex để chúng hịa trộn đều với nhau, để lạnh trong vòng30 phút.
- Lấy hỗn hợp này cho vào waterbath ở 420C trong 40 giây để sốc nhiệt Sốcnhiệt làm cho tế bào đóng lại và giữ lại các DNA plasmid/cosmid.
- Ngay sau đó thêm vào mỗi ống 200àl LB lỏng vơ trùng, lắc ở 370C trongvịng 30 phút
- Cuối cùng lấy ra và cấy trải trên mơi trường LB đặc có kháng sinh, cấyxong 5 phút với cho vào tủ ấm 370C trong 24h, khi đĩa thạch xuất hiện khuẩnlạc lấy khuẩn lạc đó để kiểm tra DNA plasmid.
2.4.3 Tách chiết DNA plasmid
Plasmid là những phân tử DNA nhỏ, mạch vịng có khả năng tái bảnđộc lập và có kích thước 0,05-10% kích thước của NST vi khuẩn Plasmid cóvai trị quan trọng trong các nghiên cứu về công nghệ DNA tái tổ hợp Chúngđược làm vector để chuyển các đoạn gen ngoại lai và tế bào vật chủ.
1 Vật liệu và hóa chất
- Vật liệu: Vi khuẩn E.Coli mang vector cần tách chiết
- Hóa chất: Dung dịch sol I, sol II, sol III, đệm TE, isopropanol hoặc ethanollạnh 100%, ethanol lạnh 70%.
Trang 32Bước 1: Nuụi lắc 16- 18h vi khuẩn E.Coli trong 3ml mơi trường LB
lỏng có bổ sung Amp tỉ lệ 1àg/ml, ở 370C, tốc độ lắc 200 vũng/phỳt, đến khiOD đạt 0,6-0.8 là thích hợp để tách chiết DNA plasmid
Bước 2: Cho dịch nuôi tế bào vào ống eppendoft 1.5-2 ml, ly tâm với
tốc 10000 vũng/phỳt trong 10 phút ở nhiệt độ phịng Sau đó loại bỏ dịchni, giữ lại phần xác tế bào.
Bước 3: Hịa tan tế bào trong 200àl dung dịch sol I bằng máy voltex đểở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
Bổ sung 200àl dung dịch sol II vào ống eppendoft trên, đảo ngược nhẹnhàng ống eppendoft khi dung dịch trong suốt là được.
Bổ sung thờm 200àl sol III để lạnh, tiếp tục đảo ngược nhẹ nhàng đểxuất hiện kết tủa trắng.
Bước 4: Ly tâm ống eppendoft bằng máy ly tâm với vận tốc 10000vũng/phỳt trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.
Dùng pipet hút phần dịch trong bên trên sang một ống eppendoft mớiloại bỏ phần cặn phía dưới.
Bước 5: Bổ sung thêm 0,6 ml isopropanol ở -200C hoặc ethanol lạnh100% vào ống eppendoft chứa dịch vừa thu được ly tâm với vận tốc 10000vũng/phỳt trong 10 phút ở nhiệt độ phòng hút bỏ hết phần dịch bằng pipet,phần cặn còn lại trong ống eppendoft là DNA Bổ sung 0,5 ml cồn ở -200Cvào ống chứa DNA, lắc đều rồi ly tâm 10000 vũng/phỳt trong 10 phút ở nhiệtđộ phòng Thao tác lần hai để rửa sạch DNA.
Bước 6: DNA tinh sạch được để cho bay hết hơi cồn và nước ở nhiệt độphòng trong vòng 1-2h, rồi bổ sung thờm 20àl nước cất hoặc TE buffer bảoquản ở -40C.
2.4.4 Điện di DNA agarose gel1 Mục đích:
Trang 332 Ngun tắc:
DNA tích điện âm khơng đổi nhờ khung photphate vì thế dưới tác độngcủa điện trường các phân tử DNA sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương vàcác DNA khác nhau về kích thước, khối lượng phân tử, mức độ xoắn và đadạng phân tử(mạch thẳng hay mạch vòng) dần được tách nhau ra trên trườngđiện di, các đoạn DNA có kích thước càng nhỏ thì tốc độ di chuyển trêntrường điện di càng nhanh hơn Sau khi điện di kết thúc ta có thể quan sát cácphân tử DNA nhờ sử dụng thuốc nhuộm phát huỳnh quang như ethidium Mỗimột băng điện di phản ánh một tập hợp phân tử DNA có cùng kích thước.
3 Hóa chất và vật liệu
- Máy chạy điện di agarose
- Gel agarose, dung dịch TAE x1 dùng để chạy điện di DNA- Đầu côn, pipet,
4 Cách tiến hành:
- Lấy 0,2-0,5g agarose vào 30ml dung dịch TAEx1(tỉ lệ: 6-7gagarose/1000ml TAE x1) vào bình thủy tinh chịu nhiệt, lắc đều cho vào lị visóng 1-2 phút để agarose tan hết Bổ sung thêm Ethylbromine tỉ lệ 1àl/10ml.Đổ dung dịch agarose này vào khay gel điện di có cài sẵn lược thích hợp đểtạo giếng tra DNA Sau 30-60 phút gel đó đụng cứng gỡ ra và đặt vào bể điệndi, đổ đệm TAE(x1) vào sao cho ngập mặt gel 1-2mm.
- Lấy 5àl DNA trộn đều với 1-2àl PBL, trộn nhẹ nhàng để khơng tạo bọt vìnếu tạo bọt khí tra mẫu vào giếng trong gel mẫu sẽ bị bọt khí đẩy hết ra ngồi.Sau đó tra mẫu vào giếng trong gel
- Chạy điện di với hiệu điện thế 110V, trong khoảng 25-30 phút
- Quan sát bản gel bằng máy soi gel được chiếu bằng tia UV, sau đó kết luậnvà chụp ảnh
Trang 34Tăng sing cấp I: Lấy 3ml mơi trường LB lỏng có bổ sung 3àg Amp cho
vào ống phalcon 15ml, nuôi chủng vi sinh vật đã được chuyển gen gerF trong
máy lắc vận tốc 200 vũng/phỳt, ở nhiệt độ 370C, từ 16-18h.
Tăng sinh cấp II: Lấy 30ml mơi trường LB lỏng có bổ sung 30àg Ampcho vào bình tam giác 250ml đã được khử trùng, tiếp theo cho 300àl giốngtăng sinh cấp I vào nuôi trong máy lắc 200 vũng/phỳt
Các điều kiện ảnh hưởng đến khả năng tạo protein tan nội bào (enzymenội bào) là: Nồng độ IPTG biểu hiện(IPTG là chất có khả năng điều hịadương tính), điều kiện nhiệt độ biểu hiện và thời gian biểu hiện thích hợp đểkhả năng tạo protein nội bào của vật chủ biểu hiện cao nhất
2.4.5.1 Biểu hiện protein ở các nồng độ IPTG khác nhau
Với các nồng độ IPTG khác nhau là 5àl, 10àl, 15àl, cho vào 3 bình tamgiác khác nhau trong thí nghiệm này ta biểu hiện ở cùng nhiệt độ 260C và thờigian là 6h trong giai đoạn tăng sinh cấp II, khi mức độ tế bào đạt mật độ ta đoOD = 0.6-0.8
Mục đích thay đổi nồng độ IPTG để tìm ra được ở nồng độ IPTG nàothì khả năng tạo protein tan nội bào(enzyme nội bào) là cao nhất, sau khi đãtìm ra được nồng độ IPTG thích hợp nhất thì tìm nhiệt độ và thời gian thíchhợp để biểu hiện protein
2.4.5.2 Biểu hiện protein ở các nhiệt độ khác nhau
Mục đích của việc thay đổi nhiệt độ ni cấy là để tìm được nhiệt độni cấy thích hợp nhất để thu được enzyme tan nội bào mong muốn là caonhất Tăng sinh cấp II tới khi mức độ tế bào đạt mật độ ta đo OD= 0.6-0.8 bổsung IPTG với nồng độ thích hợp đã được nghiên cứu ni ở các điều kiệnnhiệt độ khác nhau:
Trang 35Sau khi cho IPTG vào tiếp tục nuụi lắc với vận tốc 200 vòng/phút, ởcác điều kiện nhiệt độ khác nhau như trên, tuy nhiên thời gian nuôi để thunhận protein đều là 6h.
2.4.5.3 Biểu hiện protein ở các điều kiện thời gian khác nhau
Mục đích của việc thay đổi thời gian ni cấy là để tìm được thời gianni cấy thích hợp nhất để thu được enzyme tan nội bào mong muốn là caonhất Tiến hành cấy tăng sinh cấp II ở các điều kiện thời gian khác nhau vớinhiệt độ thích hợp và bổ sung nồng độ IPTG thích hợp đã được nghiên cứu.Tiếp tục nuôi trong máy lắc với vận tốc 200 vũng/phỳt và thời gian nuôi cấylà 6h và 10h
2.4.6 Phương pháp tách protein thô
Bước 1: Dịch nuụi cú chứa tế bào cho vào trong ống phalcon 50ml lytâm với vận tốc 4000 vũng/ phỳt, ở điều kiện lạnh -40C trong 10 phút Nhẹnhàng loại bỏ dịch nuôi và thu xác tế bào lắng cặn phía dưới.
Bước 2: Cho 5ml buffer lạnh vào, voltex để tế bào tan đều vào môitrường buffer
Bước 3: Ly tâm với vận tốc 4000 vũng/ phỳt, ở -40C, trong 10 phút.Nhẹ nhàng loại bỏ buffer thu phần xác tế bào ở dưới Nhắc lại bước này ở cácđiều kiện giống như trên.
Bước 4: Thu phần xác tế bào, tiếp tục cho 1ml buffer vào voltex để tếbào tan đều Dùng pipet vô trùng hút dịch cho vào eppendoft giữ xác tế bào ở-200C.
Bước 5: Sử dụng thiết bị công phá mẫu là máy siêu âm 20 giõy/lần, 3-5lần nhằm phá vỡ tế bào để dịch trong tế bào và enzyme nội bào được giảiphóng để ta thu dịch.
Bước 6: Ly tâm mẫu thu được ở 10000 vũng/phỳt trong 10 phỳt, hỳtdịch nổi bên trên sang ống eppendoft loại bỏ xác tế bào ta thu được enzymethô
Trang 36Trong quá trình ly tâm tế bào ta luôn làm trong điều kiện lạnh để đảmbảo khơng bị biến tính và làm giảm hoạt tính của enzyme.
2.5 Điện di protein1 Nguyên tắc:
Điện di trên gel polyacrylamide kỹ thuật để phân tách các protein theokhối lượng phân tử chiều dài của chuỗi polypeptide, cấu hình xoắn củaprotein và các nhân tố khác [5]
2 Thiết bị và hóa chất
- Máy chạy điện di protein, pipet, đầu côn, cồn vệ sinh, găng tay, - 30% acrylamide/ 0,8% bisacrylamide- 4X Tris-Cl/SDS, pH=6.8- Tris Cl/SDS, pH=8.8- 5X SDS/electrophoresis buffer- 2X SDS/sample buffer- 10% Amoni persulfat- TEMED3 Cách tiến hành
Chuẩn bị đổ gel có nồng độ 5% của Acrylamide.
Đổ gel lớp tỏch(gel tra protein), tỉ lệ theo bảng sau:[17]
30% acrylamide/0.8 bisacrylamide 2.5ml
4X Tris-Cl/SDS, pH=8.8 3.75ml
Nước 8.75ml
10% amoni persulfat 0.05ml
TEMED 0.01ml
Trang 37gel khi lớp gel cỏch mộp trờn bản thủy tinh 1.5-2cm Trong quá trình đổ gelnên tránh khơng để cho bọt khí cịn lại trong lớp gel.
Bước 2: Phủ một lớp nước hoặc n-propanol lên trên bề mặt lớp gel vừađổ để tạo đường phân cách giữa hai lớp gel Q trình polyme hóa sẽ hồnthành từ 1-3h.
Đổ gel lớp stacking ( lớp cơ đặc), tỉ lệ theo bảng:[17]
30%acrylamide/0.8 bisacrylamide 0.65ml
4X Tris-Cl/SDS, pH=6.8 1.25ml
Nước 3.05ml
10% amoni persulfat 25àl
TEMED 5àl
Hình 6: Sơ đồ điện di protein trên gel acrylamide
Trang 38Sau khi lớp gel thứ 2 đó đụng nhẹ nhàng gỡ lược ra khỏi bản gel vàkhuụn kớnh ra khỏi khung cố định rồi đặt khuụn kớnh đú vào thiết bị chạyđiện di.
Chuẩn bị dung dịch chạy điện di: Dung dịch chạy điện di protein làdung dịch 1X SDS/ electrophoresis buffer
- Ta thêm nước cất vào dung dịch 5X SDS/electrophoresis buffer để tạothành dung dịch 1X SDS/ electrophoresis buffer.
- Dung dịch nhuộm bản gel là 0.1% coomassie Blue R-250 được phatheo tỉ lệ Methanol: glacial acetic acid: nước =5:5:1
Bước 4: chạy điện di:
Đổ ngập dung dịch điện di 1XSDS/electrophoresis buffer lên toàn bộbản gel trong buồng điện di sao cho dung dịch ngập bản gel 1-2mm.
Mẫu protein: lấy 10àl protein, 5àl PBL, SDS 10% cho vào ốngeppendoft cho mẫu vào nước nóng 950C trong 5 phút để làm biến tính protein.Lấy mẫu tra lần lượt vào các giếng trong bản gel rồi chạy điện di ở hiệu điệnthế 130V đến khi mẫu chạy gần hết bản gel cỏch đỏy 1cm
Bước 5: Nhuộm bản gel:
Chạy điện di xong bản gel được nhuộm bằng dung dịch 0.1%coomassie Blue R-250 được lọc qua giấy whatman ở 500C trong thời gian 30phút.
Bước 6: Tẩy màu:
Cho bản gel vào trong dung dịch chứa Methanol: nước ( tỉ lệ 45% :55%) lắc nhẹ trong 30 phút rồi đổ dung dịch vừa rửa đi.
Pha dung dịch 5% (v/v) methanol, 7% (v/v) acid acetic, 88% (v/v) nướcđể loại bỏ màu Cho bản gel vào lắc cho đến khi bản gel mất màu là được.
Trang 39CHƯƠNG III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Phân tích trình tự axit amin của gen gerF
Gen gerF mã hóa cho enzyme dTDP-4-keto-6-deoxyglucose
3-epimerase Kết quả giải trình tự được thể hiện ở hình và được so sánh bằngphần mền BLAST trên địa chỉ http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
Trình tự nucleotid thu được khi ta đem so sánh với trình tự các gen cóchức năng tương tự trên ngân hàng gen NBCI thì thấy trình tự này tương đồng100% với trình tự nucleotid đã được cơng bố trên ngân hàng gen thế giớivới
mã số ABB52524.1 thuộc chủng streptomyces sp, KCTC
Trang 40Hình 7: So sánh trình tự nucleotide gen gerF với trình tự của một số gen cóchức năng dTDP-4-keto-6-deoxyglucose 3-epimerase trong ngân hàng gen
thế giới NCBI.
Chỉ đánh giá về độ tương đồng về nucleotid thì chưa đủ, ta cần phải cócác phân tích đánh giá về trình tự axit amin và cấu trúc enzyme này Trình tựnucleotid được chuyển thành trình tự axit amin bằng phương pháp sử dụngphần mềm BLAST so sánh với trình tự axit amin đã được đăng ký trên ngânhàng gen thế giới, trình tự axit amin khi giải trình tự như sau:
MHPLSIEGAWSQEPVIHSDHRGRSHEWFRGERFRQTFGHDFPVAQVNVAVSHRGALRGIHYTEIPPGQAKYSVCVRGAGLDVIVDVRIGSPTFGRWEIVPMDAERNTAVYLAAGLGRAFLSLTDDATLVYLCSSGYAPEREHSVNPLDPDLGIVWPADIEPLLSDRDKNAPTLATAERLGLLPT