Nghiên cứu biểu hiện enzyme acetylcholinesterase trong escherichia coli phục vụ mục đích phân tích phát hiện chất độc cơ phôt pho

NGHIÊM NGỌC HOA BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - NGHIÊM NGỌC HOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN ENZYME ACETYLCHOLINESTERASE TRONG ESCHERICHIA COLI PHỤC VỤ MỤC ĐÍCH PHÂN TÍCH PHÁT HIỆN CHẤT ĐỘC CƠ PHÔT PHO LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC CNSH2017-A Hà Nội – Năm 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGHIÊM NGỌC HOA NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN ENZYME ACETYLCHOLINESTERASE TRONG ESCHERICHIA COLI PHỤC VỤ MỤC ĐÍCH PHÂN TÍCH PHÁT HIỆN CHẤT ĐỘC CƠ PHƠT PHO Chun ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : TS Lê Quang Hòa TS Phạm Kiên Cường Hà Nội – Năm 2018 LỜI CAM ĐOAN Học viên: Nghiêm Ngọc Hoa Nơi đào tạo: Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Người hướng dẫn 1: TS Lê Quang Hòa Đơn vị: Viện Công nghệ Sinh học-Công nghệ thực phẩm/ĐH Bách Khoa HN Người hướng dẫn 2: TS Phạm Kiên Cường Đơn vị: Viện Công nghệ mới/Viện Khoa học Công nghệ quân Tên luận văn: “Nghiên cứu biểu enzym acetylcholinesterase Escherichia coli phục vụ mục đích phân tích phát chất độc phơt pho” Nội dung cam đoan: Tơi xin cam đoan, suốt q trình nghiên cứu luận văn thạc sĩ, hướng dẫn bảo tận tình giáo viên hướng dẫn, tơi tiến hành nghiên cứu luận văn cách trung thực, toàn nội dung báo cáo luận văn trực tiếp thực Tất nghiên cứu không chép từ báo cáo khoa học, luận văn tiến sĩ, thạc sĩ hay sách tác giả Học viên Nghiêm Ngọc Hoa LỜI CẢM ƠN Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Quang Hòa, Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội TS Phạm Kiên Cường, Viện Công nghệ - Viện Khoa học & Cơng nghệ qn tận tình trực tiếp hướng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Trong thời gian thực tập làm việc phịng Thí nghiệm Cơng nghệ Hóa sinh – Viện Công nghệ - Viện Khoa học & Công nghệ quân sự, nhận quan tâm giúp đỡ, bảo tận tình chun mơn, kĩ thuật động viên chân thành cán phịng Tơi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ q báu Nhân dịp tơi xin chân thành cảm ơn Thầy, Cô Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội nhiệt tình giảng dạy giúp đỡ trình học tập nghiên cứu Qua đây, xin chân thành cảm ơn cán phịng thí nghiệm Viện cơng nghệ sinh học công nghệ thực phẩm, bạn sinh viên, học viên, nghiên cứu sinh trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội giúp đỡ trình thí nghiệm Tơi xin gửi lời cảm ơn đến Thủ trưởng Viện Công nghệ - Viện Khoa học & Công nghệ quân Ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học & Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành luận văn Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè động viên giúp đỡ, tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn! Học viên Nghiêm Ngọc Hoa MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .1 LỜI CẢM ƠN .2 DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH ẢNH MỞ ĐẦU .9 Chương I: TỔNG QUAN 10 1.1 Enzym acetylcholinesterase (AChE) 10 1.1.1 Phân loại, cấu trúc enzym acetylcholinesterase 10 1.1.2.Tính chất xúc tác AChE 13 1.1.3.Vai trò, ứng dụng AChE nghiên cứu phát chất độc phốt hữu ……………………………………………………………… 14 1.2.Nhân dòng, biểu acetylcholinesterase 17 1.2.1.Nhân dòng, biểu AChE 17 1.2.2.Tối ưu hóa codon E.coli 21 1.3.Tinh enzym AChE 23 1.4.Sản xuất enzym acetylcholinesterase 24 Chương II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 29 2.1 Nguyên liệu, máy móc 29 2.1.1 Nguyên liệu hóa chất 29 2.1.2 Máy móc 29 2.2 Phương pháp nghiên cứu 30 2.2.1 Phương pháp PCR 30 2.2.2 Điện di gel agarose 31 2.2.3 Nhân dòng gen mã hóa enzym AChE vào vector 32 2.2.4 Cắt vector nhân dòng mang đoạn gen mã hóa enzym AChE vector biểu enzym giới hạn 32 2.2.5 Tinh sản phẩm cắt giới hạn 33 2.2.6 Gắn gen mã hóa enzym AChE vào vector biểu 34 2.2.7 Phương pháp xác định hoạt độ enzym AChE 34 2.2.8 Nuôi cấy tế bào vi khuẩn E.coli thu protein tổng số phân đoạn dịch chiết kết tủa tế bào 35 2.2.9 Kiểm tra biểu AchE SDS-PAGE thẩm tách miễn dịch 36 2.2.10 Phương pháp tối ưu điều kiện biểu AChE E.coli 38 2.2.11.Phương pháp tinh enzym AChE 39 2.2.12 Nghiên cứu tính chất AChE tái tổ hợp 40 Chương III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 3.1 Nghiên cứu tạo vector tái tổ hợp biểu gen mã hóa acetylcholinesterase E coli 42 3.1.1 Tối ưu hóa codon gen mã hóa acetylcholinesterase E.coli 42 3.1.2 Xây dựng vector biểu pET43a-AchE 44 3.2 Nghiên cứu biểu gen mã hóa acetylcholinesterase E coli 51 3.2.1.Kiểm tra biểu gen mã hóa acetylcholinesterase E coli 51 3.2.2 Xác định hoạt tính enzym AChE tái tổ hợp 54 3.3 Nghiên cứu tối ưu điều kiện nuôi vi khuẩn E.coli để sinh nhiều enzym 55 3.4 Nghiên cứu quy trình tinh acetylcholinesterase tái tổ hợp 57 3.5 Nghiên cứu số tính chất enzym acetylcholinesterase tái tổ hợp thu 63 3.5.1 Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ 63 3.5.2 Nghiên cứu ảnh hưởng pH 66 Chương IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69 1.KẾT LUẬN 69 2.KIẾN NGHỊ 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO 70 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1: Trình tự cặp mồi AChE 68 Fw/Rv 30 Bảng 2: Thành phần phản ứng PCR 30 Bảng 3: Thành phần phản ứng gắn đoạn gen AChE vào vector pTOP TA V2 32 Bảng 4: Thành phần phản ứng cắt vector 33 Bảng 5: Thành phẩn phản ứng ligase 34 Bảng 6: Thành phần gel Acrylamide .36 Bảng 7: Thành phần môi trường LB lỏng 60 Bảng 8: Thành phần đệm phosphate 0,02M, pH 7,4 .60 Bảng 9: Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt độ enzym AChE tái tổ hợp 63 Bảng 10: Xác định độ bền nhiệt AChE 65 Bảng 11: Ảnh hưởng pH lên hoạt độ enzym AchE tái tổ hợp .66 Bảng 12: Xác định giá trị pH tối thích AchE tái tổ hợp .67 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Trung tâm hoạt động AChE .12 Hình 1.2: Mơ cấu trúc bậc bốn TcAChE 13 Hình 1.3: Mơ hình động học tối thiểu xúc tác AChE 13 Hình 1.4: Ảnh hưởng chất độc phốt tới enzym AChE 16 Hình 1.5: Nguyên tắc cảm biến sinh học OP dựa ức chế AChE .17 Hình 1.6: Quy trình nhân dịng biểu AChE bò .19 Hình 1.7: So sánh hoạt tính enzym DmAChE tái tổ hợp trước sau tối ưu codon qua mốc thời gian nuôi cấy 22 Hình 1.8: Chỉ số CAI hBChE trước sau tối ưu nấm men Pichia pastoris 23 Hình 1.9: Vector pET43a 26 Hình 1.10 : Trình tự vector pET 43a 27 Hình 1.11: Quy trình biểu enzym AChE tái tổ hợp 28 Hình 2.1: Chu trình nhiệt PCR 31 Hình 3.1: Chỉ số CAI cADN AChE bò (Bos taurus) biểu E coli 42 Hình 3.2: Chỉ số CAI cADN AChE bị sau tối ưu hóa codon biểu E.coli .43 Hình 3.3: PCR kiểm tra cặp mồi sau thiết kế với plasmid pGEMT-AChE 44 Hình 3.4: Đĩa khuẩn lạc E.coli DH5α đĩa LB có bổ sung Amp 45 Hình 3.5: PCR kiểm tra khuẩn lạc với cặp mồi AChE 68 Fw/Rv 46 Hình 3.6: Kiểm tra khuẩn lạc với cặp mồi M13 Fw/Rv 46 Hình 3.7: Ảnh điện di kết tách plasmid pTOP-AChE 47 Hình 3.8: Ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid pTOP – AChE với enzym giới hạn NdeI XhoI .48 Hình 3.9: Ảnh điện di kết tách plasmid pET 43a .48 Hình 3.10: Ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid pET43a với enzym giới hạn NdeI XhoI 49 Hình 3.11: Đĩa khuẩn lạc E coli DH5α đĩa LB có bổ sung Amp .50 Hình 3.12: PCR kiểm tra khuẩn lạc với cặp mồi AChE 68 Fw/Rv .50 Hình 3.13: Đĩa khuẩn lạc E coli BL21 DE3 đĩa LB có bổ sung Amp, Cm 52 Hình 3.14: PCR kiểm tra khuẩn lạc với cặp mồi T7/ AChE68 52 Hình 3.15: SDS-PAGE (A) thẩm tách miễn dịch (B) kiểm tra biểu AChE E coli 53 Hình 3.16: Kết điện di tối ưu biểu nồng độ IPTG 55 Hình 3.17 : Kết điện di tối ưu biểu thời gian cảm ứng .56 Hình 3.18: Sắc ký lực qua cột His-bind tinh AChE tái tổ hợp .57 Hình 3.19: Điện di gel polyacrylamide có SDS (A) kiểm tra biểu pET43a-AChE E coli BL21 DE3 tinh (B) 58 Hình 3.20: Quy trình tinh enzym AChE tái tổ hợp 59 Hình 3.21: Ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt độ AChE tái tổ hợp 64 Hình 3.22: Hoạt độ AChE tái tổ hợp xử lý nhiệt độ khác 65 Hình 3.23 Độ bền pH AChE tái tổ hợp .66 Hình 3.24: Đồ thị xác định pH tối thích AChE 67 Hình 3.25: Ảnh hưởng số chất độc đến hoạt độ AChE tái tổ hợp 68 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ach Acetylcholine AchE Acetylcholinesterase AchI Cơ chất Acetylthiocholine iodide BuChE Butyrylcholinesterase BVTV Bảo vệ thực vật ChE Cholinesterase CAT Chloramphenicol acetyl-transferase CB Carbamate cADN complementary ADN (AND bổ trợ) DTNB Chất sinh màu 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid kDa Kilodalton OP Các hợp chất thuốc trừ sâu phốt hữu PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng khuếch đại gen) SDS Sodium dodecyl sulphate Se203 Serine vị trí 203 Synap Khớp thần kinh Bước Nuôi khởi động vi khuẩn Vi khuẩn E.coli BL21 chứa AchE tái tổ hợp đĩa LB đặc cho vào 100ml môi trường LB lỏng với thành phần môi trường bảng có bổ sung Amp 50 µg/ml Cm 34 µg/ml, ni lắc qua đêm với tốc độ 200 vịng/phút 37ºC Bảng 7: Thành phần môi trường LB lỏng TT Tên nguyên liệu Định lượng Clorua Natri 0.5 g Cao nấm men 0.5 g Pepton 1.5 g Nước 100 ml pH Bước Nuôi cảm ứng vi khuẩn Lấy 10ml dịch vi khuẩn nuôi khởi động trẻ hóa tế bào 500L mơi trường LB lỏng bổ sung kháng sinh Amp 50 µg/ml, Cm 34 µg/ml Vi khuẩn ni lắc 200 vòng 37ºC đến OD600=0,6-0,8; bổ sung IPTG đến nồng độ cuối 0,25mM Nuôi tiếp 37ºC, Bước Thu sinh khối tế bào vi khuẩn Sau giờ, dịch ni ly tâm 8000 vịng/phút, phút, 4ºC, thu tủa Tủa ống hòa đệm phosphate 0,02M, pH 7,4 (bảng 8) theo tỷ lệ 1:3 (m/v) thu dịch chiết protein tổng số Bảng 8: Thành phần đệm phosphate 0,02M, pH 7,4 TT Tên nguyên liệu K2HPO4 Định lượng 2,794 g 60 KH2PO4 0,538 g Nước 1l pH 7,4 Bước Thu dịch chiết tế bào Dịch chiết đem siêu âm phá tế bào đá Sau đó, hỗn hợp dịch ly tâm 13000 vịng/phút, 4ºC, 20 phút, thu dịch (dịch chiết tế bào) Dịch chiết sau điện di SDS-PAGE Bước Cô dịch chiết tế bào Dịch chiết tế bào qua màng lọc có kích thước 30 kDa hệ thống máy lọc tiếp tuyến AKATA PURE đến thể tích 15ml Dịch sau đem đo hàm lượng protein máy Nano drop, sử dụng dịch blank đệm phosphate 0,02M, pH 7,4 Bước Lựa chọn loại gel Ni sepharose fast flow Để phân tách enzym AChE từ dịch nuôi tế bào chứa protein tổng số, phương pháp sắc ký lực sử dụng Loại gel lựa chọn: Ni-sepharose fast flow Quy trình sắc ký lực sử dụng gel, cột hệ thống máy sắc ký tự động AKATAprime Plus GE, thực điều kiện thường, phịng thí nghiệm Bước Nhồi cột Gel Ni-sepharose fast flow (GE) nhồi vào cột XK 16/20 để tích cột gel 5ml Sau gel lắng hết, tiến hành rửa gel với lần thể tích nước cất khử ion với vận tốc 1ml/min Bước Chuẩn bị đệm Trong sắc ký lực sử dụng loại đệm sau với thành phần sau: Đệm gắn: đệm phosphate 0,02M; imidazole 5mM 61 Đệm rửa: đệm phosphate 0,02M; imidazole 100mM Đệm rửa giải: đệm phosphate 0,02M; imidazole 250mM Bước Cân cột -Gắn Ni2+: lần thể tích đệm NiSO4 50mM cho chảy qua cột với vận tốc 0,5ml/min Sau cột rửa lại lần thể tích nước cất với vận tốc 0,5ml/min giá trị mAU 0, đường biểu diễn đường thẳng - Cân cột: Cột cân với lần thể tích đệm gắn đường biểu diễn mAU đường thẳng (mAU=0), sẵn sàng cho bước tinh Bước 10 Load mẫu Khoảng 10ml dịch chiết tế bào sau đặc load vào super load, sau đưa lên cột cân với tốc độ 0,5 ml/min Cột cân tiếp đệm rửa nhằm loại bỏ phần protein không gắn cột Bước 11 Rửa cột Sau tái cân bằng đệm gắn, cột rửa đệm rửa, protein có lực mạnh đẩy khỏi cột Giai đoạn dừng lại đường biểu diễn mAU đường thằng nằm ngang (mAU=0) Bước 12 Rửa giải, thu phân đoạn Cột rửa giải đệm rửa giải, protein đích gắn cột tách khỏi cột, phân đoạn thu tích 2ml Bước 13 Thử hoạt tính phân đoạn thu sau tinh Các phân đoạn thu sau tinh thử hoạt tính theo phương pháp Ellman cộng [15] Bước 14 Kiểm tra độ SDS-PAGE, thẩm tách miễn dịch 62 3.5 Nghiên cứu số tính chất enzym acetylcholinesterase tái tổ hợp thu 3.5.1 Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ Tốc độ phản ứng hoạt độ enzym phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ môi trường Tốc độ phản ứng tuyệt đại đa số enzym gia tăng nhiệt độ môi trường phản ứng gia tăng đạt giá trị xác định (nhiệt độ tối ưu) khơng tăng tiếp giảm hoạt tính xúc tác nhiệt độ tiếp tục tăng Để xác định ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ enzym dịch chiết tái tổ hợp, tiến hành thí nghiệm xác định hoạt tính enzym điều kiện nhiệt độ môi trường khác (từ 10 đến 60oC) theo biên độ thay đổi nhiệt độ 5oC Kết thí nghiệm trình bày bảng hình 3.21 Bảng 9: Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt độ enzym AChE tái tổ hợp Nhiệt độ 10 15 20 25 30 30,42 49,28 91,26 142,37 202,8 Hoạt độ tương đối (%) 15 24,3 45 70,2 100 Nhiệt độ 35 40 45 50 55 60 180,49 86,39 40,36 17,64 15,62 12,17 89 42,6 19,9 8,7 7,7 6,0 U/mg(TB) U/mg(TB) Hoạt độ tương đối (%) 63 Hình 3.21: Ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt độ AChE tái tổ hợp Hình 3.21 cho thấy: nhiệt độ tăng dần từ thấp tới cao tốc độ phản ứng thủy phân acetylcholine với AChE tăng dần tăng mạnh khoảng nhiệt độ từ 30-35oC; với giá trị tối ưu ~ 30oC; sau giá trị tối ưu tốc độ phản ứng giảm dần giảm mạnh sau 40oC Để nghiên cứu độ bền với nhiệt AChE, enzym xử lý nhiệt độ 300C, 370C, 420C, 470C, 520C, 570C ,620C 670C 10 phút trước bổ sung vào thành phần phản ứng thủy phân chất tổng hợp, sau hoạt độ lại xác định 300C đệm pH 7,4 nêu Kết xác định hoạt độ AChE lại sau xử lý nhiệt (bảng 10, hình 3.22) cho thấy, hoạt độ cắt chất AChE bị giảm dần tăng nhiệt độ xử lý bị hoàn toàn bị xử lý nhiệt 670C 10 phút 64 Bảng 10: Xác định độ bền nhiệt AchE Nhiệt độ Hoạt độ tương đối (U/mg) % Hoạt độ tương đối 30 37 42 47 193,70 178,20 100,72 63,92 100 94 52 33 52 57 62 67 40,68 19,37 9,69 1,94 21 10 Hình 3.22: Hoạt độ AChE tái tổ hợp xử lý nhiệt độ khác Năm 2010, Assis cộng nghiên cứu tính chất AChE tách chiết từ não cá heo sọc Amazon Colossoma macropomum [3] Để nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính AChE, nhóm tác giả tiến hành khảo sát hoạt độ AChE khoảng nhiệt độ từ đến 70ºC 180s đánh giá độ bền nhiệt enzym dải nhiệt độ từ 25 đến 80ºC Kết cho thấy nhiệt độ tối ưu enzym 45ºC; enzym 30% hoạt tính sau ủ 50ºC 30 phút so với ủ 35ºC Ngoài ra, Bocquene cộng lại cho thấy AChE từ não loài Pleuronectes platessa hoạt động tối ưu nhiệt độ từ 32 đến 34ºC [6], Hazel cộng tìm nhiệt độ tối thích AChE lồi Carassius auratus 35ºC [16] Điều cho thấy AChE tách chiết từ lồi khác có nhiệt độ tối thích độ bền nhiệt khác 65 3.5.2 Nghiên cứu ảnh hưởng pH Các phản ứng sinh hóa phản ứng hóa học phụ thuộc nhiều vào pH Vì vậy, vấn đề đặt phải xác định giá trị pH tối ưu cho phản ứng Để xác định ảnh hưởng pH tới hoạt độ AChE tái tổ hợp, tiến hành xác định độ bền pH pH tối thích AChE Chúng tơi tiến hành ủ enzym với đệm pH khác (4, 5, 6, 7, 8, 9) 30 phút 30ºC sau tiến hành xác định hoạt độ AChE lại điều kiện ban đầu, kết trình bày bảng 11, hình 3.23 Bảng 11: Ảnh hưởng pH lên hoạt độ enzym AchE tái tổ hợp pH U/mg % hoạt tính tương đối 46,33 86,87 171,82 183,40 169,89 54,05 24 45 89 95 88 28 Hình 3.23 Độ bền pH AChE tái tổ hợp Có thể thấy AChE giữ khoảng 90% hoạt độ ban đầu xử lý pH trung tính (6-8) cịn pH axit (4 -5) kiềm (9) enzym bị hoạt độ Dựa vào kết xác định độ bền pH tiến hành xác định pH tối thích enzym giải pH từ đến Kết thu (bảng 12, hình 3.24) cho thấy pH tối thích AChE 7,4 66 Bảng 12: Xác định giá trị pH tối thích AchE tái tổ hợp pH 6.2 6.4 6.6 6.8 7.2 7.4 7.6 7.8 65 70 82 82 84 95 98 100 92 90 88 129,38 139,34 163,22 163,22 167,20 189,10 195,07 199,05 183,13 179,15 % hoạt tính tương đối U/mg Hình 3.24: Đồ thị xác định pH tối thích AChE Qua kết nghiên cứu này, lựa chọn giá trị pH = 7,4 tối ưu cho nghiên cứu tính chất hóa lý AChE phân tích chất độc phốt hữu AChE Năm 2011, Assis cộng nghiên cứu ảnh hưởng pH lên hoạt tính AchE từ não cá heo sọc C Macropomum [3] Khoảng pH khảo sát dải từ 2,5 đến 9,5 Kết cho thấy enyzme hoạt động tối thích pH 7,5 3.5.3 Nghiên cứu ảnh hưởng số loại thuốc trừ sâu đến hoạt tính AChE tái tổ hợp Chúng lựa chọn loại thuốc trừ sâu phốt hữu sử dụng phổ biến nước ta là: - Thiophốt (Parathion) màu vàng, mùi tỏi, dạng nhũ tương - Vôfatốc (methyl parathion) màu nâu thẫm (dạng nhũ tương) màu đỏ tươi (dạng bột) mùi cỏ thối 67 175,16 - Dipterec dạng tinh thể, màu trắng - DDVP (dichloro diphenyl vinyl phosphat) màu vàng nhạt Kết thu hình 3.25: Hình 3.25: Ảnh hưởng số chất độc đến hoạt độ AChE tái tổ hợp Từ kết thu hình hoạt độ AChE giảm tăng nồng độ chất độc tăng giá trị IC50 chất độc Parathion, methyl parathion, Dipterex, DDVP OB-S với AChE tái tổ hợp tương ứng là: 3,42µM; 3,22 µM, 4,92 µM; 5,75 µM 2,11µM Khả ức chế enzym AchE loại chất độc phospho hữu tiền đề quan trọng để tiến tới chế tạo kit phát nhanh chất độc có nguồn gốc phốt 68 Chương IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN - Đã tối ưu hóa codon, nhân dịng biểu thành công AChE E coli dạng AChE-His-tag sử dụng vector pET43a Vi khuẩn E coli BL21 DE3 mang vector pET43a-AChE biểu AChE điều kiện cảm ứng với IPTG 0,25mM, sau thời gian 37oC Trong dịch chiết tế bào tổng số AChE tái tổ hợp có kích thước khoảng 68 kDa có hoạt độ 6,94 U/mgprotein Đã xây dựng thành cơng quy trình tinh AChE với bước đơn giản: i) - thu dich chiết đệm phosphate 0,02M, pH 7,4 có NaCl 100 mM, imidazol 5mM; ii) sắc ký qua cột His-bind đệm phosphate 0,02M, pH 7,4 có NaCl 100 mM, imidazol 5mM; rửa chiết enzym gắn với gel His-bind đệm có chứa imidazol 250 mM AChE sau tinh có hoạt độ riêng 200U/mgpr, cho băng protein với khối lượng phân tử khoảng 68 kDa SDS-PAGE, nhận kháng thể đơn dòng kháng AChE thẩm tách miễn dịch AChE tái tổ hợp hoạt động tối thích pH 7,4 300C; hồn tồn hoạt - tính xúc tác bị xử lý nhiệt 670C thời gian 10 phút KIẾN NGHỊ - Gửi giải trình tự plasmid tái tổ hợp pET43a-AChE - Nghiên cứu quy trình tách đông khô enzym quy mô lớn, đánh giá tính ổn định hoạt độ enzym AChE đơng khơ tái tổ hợp, tính ổn định chủng vi khuẩn tái tổ hợp 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO Arrieta DE., McCurdy S A., Henderson J D., Lefkowitz L J., Reitstetter R., et al ( 2009), Normal range of human red blood cell acetylcholinesterase activity, Drug Chem Toxicol, vol 32, no 3, pp 182–185 Askar KA., Kudi A C., Moody A J (2011), Purification of Soluble Acetylcholinesterase from Sheep Liver by Affinity Chromatography, Appl Biochem Biotechnol, vol 165, no 1, pp 336–346 Assis CR., Castro PF., Amaral IP., Carvalho EV., Carvalho LB Jr B R (2010), Characterization of acetylcholinesterase from the brain of the Amazonian tambaqui (Colossoma macropomum) and in vitro effect of organophosphorus and carbamate pesticides, Environmental Toxicology and Chemistry, vol 29, no 10, pp 2243–2248, 2010 Bedini S., Pellegrino E., Argese E., Giovannetti M (2001), Miglioramento del suolo e biostabilizzazione di metalli pesanti mediati da glomalina, vol 13, no Berman J., Mel Y (1971), Rapid and Complete Purification of Acetylcholinesterases of Electric Eel and Erythrocyte by Affinity Chromatography, Proc Natl Acad Sci, vol 68, no N2, pp 395–398 Bocquene G., Galgani F T P (1990), Characterization and assay conditions for use of AChE activity from several marine species in pollution monitoring, Mar Env, vol 30, pp 75–89 Bon S., Huet M., Lemonnier M., Rieger F., Massoulié J (1976), Molecular forms of Electrophorus acetylcholinesterase Molecular weight and composition, Eur J Biochem, vol 68, no 2, pp 523–30 Ceylan H., Erdoğan O (2017), Cloning, expression, and characterization of human brain acetylcholinesterase in Escherichia coli using a SUMO fusion tag, Turkish J Biol, vol 41, no 1, pp 77–87 70 Colović M., Krstić D Z., Lazarević-Pašti T D., Bondžić A M., Vasić V M (2013), Acetylcholinesterase inhibitors: pharmacology and toxicology, Curr Neuropharmacol, vol 11, no 3, pp 315–35 10 Datta K., Banerjee A., Basu P S., Datta T K (1988), Acetylcholinesterase (EC 3.1.1.7), a neurotransmitter enzyme in scorpion hemolymph, Biochem Pharmacol, vol 37, no 5, pp 963–6 11 Đinh NgọcTấn (1998), Nghiên cứu lựa chọn điều kiện nâng cao hoạt độ enzyme cholinesterase tách từ nguồn nguyên liệu nước ứng dụng phân tích chất độc photpho, Luận án tiến sĩ 12 Dong J., Xie X., He Y S., Beier R C., Sun Y M., et al (2013), Surface Display and Bioactivity of Bombyx mori Acetylcholinesterase on Pichia pastoris, PLoS One, vol 8, no 8, p e70451 13 Dvir H., Jiang H L., Wong D M., Harel M., Chetrit M., et al ( 2002), X-ray structures of Torpedo californica acetylcholinesterase complexed with (+)huperzine A and (-)-huperzine B: structural evidence for an active site rearrangement, Biochemistry, vol 41, no 35, pp 10810–8 14 Dvir H., Silman I., Harel M., Rosenberry T L., Sussman J L (2010) Acetylcholinesterase: From 3D structure to function, Chem Biol Interact, vol 187, no 1–3, pp 10–22 15 Ellman L., Featherstone R (1961), A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity 16 Hazel J (1969), The effect of thermal acclimation upon brain acetylcholinesterase activity of Carassius auratus and Fundulus heteroclitus, Life Sci, vol 8, pp 775–784 17 Heim J., Schmidt-Dannert C., Atomi H., Schmid R D (1998), Functional expression of a mammalian acetylcholinesterase in Pichia pastoris: Comparison to acetylcholinesterase, expressed and reconstituted from 71 Escherichia coli, Biochim Biophys Acta - Gene Struct Expr, vol 1396, no 3, pp 306–319 18 Hsiao M., Lai J.-Y., Liao H.-Y., Feng H.-T (2004), Purification and Characterization of Acetylcholinesterase from Oriental Fruit Fly [ Bactrocera dorsalis (Hendel)] (Diptera: Tephritidae), J Agric Food Chem, vol 52, no 17, pp 5340–5346 19 Husain K (1994), Phenyl Valerate and Choline Ester Hydrolases in the Platelets of Human, Hen, Rat and Mouse, sage J, vol 13, no 20 Itai M (1998), Bovine acetylcholinesterase: cloning, expression and characterization, Biochem J, vol 334, pp 251–259 21 De La Hoz D., Doctor P., Scott Ralston J., Rush R S., David Wolfe A (1986), A simplified procedure for the purification of large quantities of fetal bovine serum acetylcholinesterase, Life Sci, vol 39, no 3, pp 195–199 22 Lê Minh Trí (2005), Nghiên cứu khai thác ứng dụng enzyme acetylcholinesterase chẩn đoán chất độc phospho hữu cơ, Luận văn thạc sỹ khoa học 23 Lê Minh Trí (2010), Nghiên cứu tinh sạch, tính chất đặc trưng ứng dụng acetylcholinesterase từ tái tổ hợp, Luận án tiến sĩ sinh học 24 Li F., Han Z (2002), Purification and characterization of acetylcholinesterase from cotton aphid (Aphis gossypii glover), Arch Insect Biochem Physiol, vol 51, no 1, pp 37–45 25 Masson P.F., Gillon E., Nachon F., Lockridge O., Schopfer L M (2007), Biochim Biophys Acta, vol 16, p 1774 26 Michaelson S., Small D H., Livett B G (1994), Expression of dimeric and tetrameric acetylcholinesterase isoforms on the surface of cultured bovine adrenal chromaffin cells, Journal of Cellular Biochemistry, vol 55, no 3, pp 398–407 72 27 Nicola A., Sharma S., Sobott F., Loenarz C., Oppermann U., et al (2008), Codon optimization can improve expression of human genes in Escherichia coli: A multi-gene study, Protein Expr Purif, vol 59, no 1, pp 94–102 28 Paulus J.M., Maigne J (1981), Mouse megakaryocytes secrete acetylcholinesterase, Blood, vol 58, pp 1100–1106 29 Quinn D.M (1987), Chem Rev, vol 955, p 87 30 Rosenberry T.(1975), Proc Natl Acad Sci U S A, vol 3834, p 72 31 Shen T., Tai K., Henchman R H., McCammon J A (2002), Molecular dynamics of acetylcholinesterase, Acc Chem Res, vol 35, no 6, pp 332– 340 32 Simon S., Massoulié J (1997), Cloning and expression of acetylcholinesterase from Electrophorus Splicing pattern of the 3’ exons in vivo and in transfected mammalian cells, J Biol Chem, vol 272, no 52, pp 33045–55 33 Sussman J., Frolow F., Oefner C., Goldman A., Toker L., Silman I (1991) Science, vol 872, p 253 34 Taylor P (1996), Cholinesterase agents, Goodman Gilman’s Pharmacol Basis Ther, vol 9, pp 161–176 35 Tian J., Chen X N., Xie Y H., Lu Y., Xu W T., et al (2016), Expression and characterization of a codon-optimized butyrylcholinesterase for analysis of organophosphate insecticide residues, J Integr Agric, vol 15, no 3, pp 684– 693 36 Tổng cục môi trường.(2015), Hiện trạng ô nhiễm môi trường hóa chất bảo vệ thực vật tồn lưu thuộc nhóm chất hữu khó phân hủy Việt Nam 37 Vikas D., Gahlaut A., Dilbaghi N., Hooda V (2013), Acetylcholinesterase biosensors for electrochemical detection of organophosphorus compounds: a review, Biochem Res Int, vol 2013, p 731501 73 38 Vimala V (2016), Pesticides Detection Using Acetylcholinesterase Nanobiosensor, Biosens J, vol 5, no 39 Wu A.B., Chen H D., Tang Z Z., Ye B W., Liu W J., et al (2008), Synthesis of Drosophila melanogaster acetylcholinesterase gene using yeast preferred codons and its expression in Pichia pastoris, Chem Biol Interact, vol 175, no 1–3, pp 403–405 40 Zajicek J.(1957), Studies on the histogenesis of blood platelets and megakaryocytes, Acta Physiol Scand, vol 40, pp 1–32 41 Zhang W., Yuan L., Zhang L., Li N., Chen S., et al (2011), Recombinant Expression and Biosensor Design of Mouse Brain Acetylcholinesterase by One-Step Electrochemical Deposition, 5th International Conference on Bioinformatics and Biomedical Engineering, pp 1–4 42 https://en.wikipedia.org/wiki/Codon_Adaptation_Index 74 ... ? ?Nghiên cứu biểu enzym acetylcholinesterase Escherichia coli phục vụ mục đích phân tích phát chất độc phôt pho? ?? với mục tiêu tạo enzym acetylcholinesterase tái tổ hợp E coli phục vụ mục đích phân. .. NGHIÊM NGỌC HOA NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN ENZYME ACETYLCHOLINESTERASE TRONG ESCHERICHIA COLI PHỤC VỤ MỤC ĐÍCH PHÂN TÍCH PHÁT HIỆN CHẤT ĐỘC CƠ PHÔT PHO Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH... luận văn: ? ?Nghiên cứu biểu enzym acetylcholinesterase Escherichia coli phục vụ mục đích phân tích phát chất độc phôt pho? ?? Nội dung cam đoan: Tơi xin cam đoan, suốt q trình nghiên cứu luận văn