Nghiên cứu biểu hiện dấu ấn insulin trong quá trình nuôi cấy biệt hóa tế bào gốc màng ối thành tế bào beta tụy đảo

NGHIÊN CỨU BIÊU HIỆN DẤU ẤN INSULIN TRONG QUÁ TRÌNH NI CẮY BIỆT HĨA TÉ BÀO GỐC MÀNG ĨI NGƯỜI THÀNH TÉ BÀO BETA T Y ĐẢO ThS N guyễn Văn T ần g* H ớng dẫn; TS Phạm Văn Trân** TÓM T T Mục tiêu nghiên cứu: ỉ Nghiên cứu quy tr nh phân iập, bào quản nuôi cấy tế bào gốc (TBG) màng ổi người 2.Biệt hóa TBG màng ối người thành tế bào beta tụy đảo có khả biểu dấu ấn insulin Phương pháp nghiên cữu: Tách tế bào enzym trypsin, ni cấy định hướng biệt hóa mơi trường DMEM có bổ sung Nicotinamide, p­mercaptoethanol yếu tố sinh trưởng Xác định tính gốc TBG dấu ấn OCT­4 xác định khà biệt hóa thành tế bào beta tụy đảo dấu ấn insulin Kết nghiên cứu: Quy tr nh tách phân lập TBG từ màng ối đạl hiệu cao, dấu ấn insulin xác định kỹ thuậ£ RT­PCR tăng dần theo thời gian nuôi cấy Kểt luận: TBG tách từ màng ối ni cấy định hướng biệt hóa thành tế bào beta tụy đảo để phục vụ cho nghiên cứu điều trị * Từ khóa: Tê bào gốc; Màng ối; Tế bào beta tụy đảo E x p r ssio n o f in su lin m a rk rs in th p ro c ss o f sp c m lzin g a n d cultu rin g st m c ils fr o m h u m a n a m n w tic m m bran into b ta c ils Summ ary Research objectives: ­ To study process of isolating, preserving and culturing stem cells from human araniotic membrane ­ To differentiate stem cells from human amniotic membrane into beta cells with the ability of expressing insulin markers Research methodology: Isolating stem cells by enzyme trypsin, culturing them in specialized orientation in DMEM added to Nicotinamide, B­mercaptoethanol and other growth factors The origin of stem cells was determined by OCT­4 and specialized abilities into beta cells by insulin markers Results: Protocol for isolating stem cells from amniotic membrane achieved high efficiency, insulin which was determined by RT­PCR technique increase gradually according to culturing time Conclusion: Stem cells isolated from amniotic membrane can differentiate into beta cells to serve for study and treatment * Key words: Stem cells; Amniotic membrane; Beta cells I.Đ Ặ T V Ấ N Đ Ề Tế bào gốc tể bào có tiềm phát triển, tự làm biệt hóa thành loại tế bào b nh thường khác củ a c thể T TB G b iệt hố thành nhiều loại tế bào chuyên biẹt để điều trị bệnh như: Đ tháo đường tý p 1, đột quỵ não, nhồi m áu tim , chấn thương tu ỷ sống bòn g nhiều bệnh khác Cho tớ i nay, b iện pháp hữu hiệu để điều trị trường hợp ỉà ghép mô, quan ­ nhu cầu ghép lại cao nhiều so với nguồn cung cấp * Cao đẳng Y tể Thanh H a ** Học viện Quân y 568 M àng ối sản phẩm thường bỏ sau tr nh sinh nở, chứa số ỉượng tiềm TBG gọi TB G màng ối Đ ây TB G đa tiềm có khả biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau, đó, có tê bào beta tụy đảo [6] V vậy, tiến hành đề tài nhằm: ­ Nghiên cứu quy trình phân lập, bảo quản ni cậy TBG màng ối người - Biệt hóa TBG màng ầ người thành tể bào beta đảo có khả b iầi dấu ẩn ừtsuUn II ĐỔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 2.1 Đối tượng nghiên cửu Màng ối TB G m àng ối lấy từ sản phụ mổ đẻ có kế t âm tín h với H IV, HBV, HCV giang mai K hoa sản ­ Bệnh viện Quân y 103 ­ Học viện Q uân y 2.2 P hư on g p h áp nghiên cứu Nghiên cứu mô tả thực nghiệm in vitro Nghiên cứu tiến hành Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học quân sự, Học viện Quân y 2.3 Các quy trình kỹ thuật 2.3.1 Kỹ th u ậ t p h â n lập Các TBG phân lập từ màng ối kỹ thuật sử dụng enzym phân cắt mô (Trypsin, Hyaluronidase CoUagenase B 0,1%) phối họp vói biện pháp học 2.3.2 Quy trình ni c y tăng sinh số lượng biệt hóa TBG màng ối người thành tế bào p tụy đảo Nuôi cấy tăng sinh TBG màng ối ni cấy ữong mơi trường DMEM có bổ sung thêm penicillin (50 Ư/mỉ), streptomycin (50 Jig/ml),_L­glutamin (2 X 10’3M ), huyết bào thai bê (10%), hai ngày thay môi trường lần để loại bỏ tế bào chết cung cấp chất dinh dưõng đồng thời cấy chuyển tế bào tuần lần để tr phịng thí nghiệm N i cấy biệt hóa T B G màng ối thành tế bào be ta tụy đào (B eta cells) Sử dụng tế bào P2 (passage 2) để biệt hóa TBG màng ối thành tế bào beta tụy đảo Nuôi cấy tăng sinh vòng ngày Quan sát thấy tế bào bao phù kín đĩa ni Sau đó, bổ sung vào mơi trường yếu tố định hưóng biệt hóa TBG màng ối thành tê bào beta tụy đảo bao gồm 10 mM nicotinamide, 55 (iM B~ mercaptoethanol, ỉ mmol natri pyruvat [2,3] Thu hoạch tế bào vào ngày thứ (N l) ngày thứ (N7) ngày thứ Í4 (N14) sau bổ sung yếu tố biệt hóa vào môi trường nuôi cấy Đánh giá két q uả biệt hóa T B G màng ối thành tế bào b eta tụy đảo giảm dấu ấn T BG (OCT­4, xác định W estern blot) với xuất tăng dấu ấn củ a tế bao b eta insulin mức độ protein (định iượng theo phươ ng pháp hóa m iễn d ịch phát quang) m ức độ A R N tt (RT­PCR) 2.3.3 Các kỹ thuật khác ­ Xác định khả b iệt h a định lượng nồng độ insulin dịch ly giải tế bào: Định lượng nông độ insulin theo phương pháp m iên dịch điện hóa ph át quang sử dụng kit (A bbott) Erên máy m iễn dịch tự động hoàn toàn A sxym (Abbott) ­ K ỹ th uậ t W st rn blot: X ác định biểu protein địch ly giải tế bào ­ Phư ng ph p điện h a p h t quang định lượng insulin: Định lượng insulin nghiên cứu sử dụng phương pháp m iễn dịch điện hóa phát quang sử dụng k hãng A bbott máy Asxym r a K Ế T QUẢ 3.1 K ết q u ả p h â n lập ­ M àng ối sau bồc tấch rử a dung dịch PBS IX , T B G m àng ối phân lập theo quy tr nh ­ Chúng lựa chọn môi trường phân lập TBG màng ối người Chọn môi trường tối ưu Trypsin 0,25% + Coliagenase B 0,1% thể bảng 569 Bảng Thòi gian tác đụng enzym phân cắt mô STT T ên enzym T h ời g ian làm tan r ã m àn g ếỉ (phứt) Trypsin 0,25% 45 ± 10 Collagenase B ,ỉ% + Ỉ0 Trypsin 0,25% + Collagenase B 0,1% (1:1) 20 ± Hyaluronidase 0,6% Không tác đụng Sau lựa chọn môi trường tối ưu, chúng tơi tiến hành phân lập sau ni cấy tế bào màng ối vừa phân lập đĩa nuôi cấy với môi trường DM EM Sau 24 giờ, tế bào bám dính vào bề mặt đáy đĩa ni cấy, TBG màng ối có h nh thoi, kích thước trung binh Sau 24 phân lập thu h nh ảnh TBG từ màng ối nh h nh H nh Ảnh TBG m àng ối sau 24 phân lập (Chụp từ kính hiển vi đối pha, X 200) 3.2 K ết q u ả nuô i cấy tă n g sin h T B G m àng ổi ngưịi TBG ni cấy đĩa plastic đường kính 10 cm, với mơi trường DMEM high glucose có thêm 10% FBS + 1% Peniđỉỉine­Streptomycme + ĩ % L­glutamat, tủ nuôi cấy HEPA­NƯAĨRE 37°c, khơng khí có 5% C 2, độ ẩm bão hịa đ ã mơ tả ưong phàn đối tượng phương pháp nghiên cứu Kết nuôi cấy môi trường nuôi cấy tương tự kết nghiên cứu khác (hình 2) H nh H nh ảnh tế bào chụp trực tiếp đĩa ni cấy qua kính hiển vi đối pha A: Sau ngày nuôi cấy B: Sau 14 ngày nuôi cấy N gaỵ sau nuôi cấy 24 giờ, TBG m àng ối có xu hướng bám dính vào bề mặt đĩa nuôi cấy phát triển thành cụm tế bào h nh đa diện h nh thoi có kích thước trun g b nh Sau tuần nuôi cây, m ật độ tế bào phát triển bao phủ khoảng 50 ­ 60% bề mặt^ổĩa nuôi cấy 570 3.3 Biểu d u n sinh học trình nuối c y 3.3.1 Biểu O CT-4 - d u n TBG Trái với đấu ấn insuỉỉn, nồng độ ARNtt OCT­4, dấu ấn TBG giảm dần theo thời gian nhóm ni cấy mơi trường có bổ sung nicotinamid 8­mercaptoetanol H nh ảnh hóa miễn dịch tế bào ngày thứ 14 tế bào cịn biểu OCT­4 OCT-4 H kDa) Act n ► a A c B H nh A H nh ảnh TBG màng ối ngirời sau ngày ni cấy B N huộm hóa miễn dịch tế bào với OCT­4, màu xanh OCT­4, m àu xanh tím nhu ộm nhân DAPĨ, c H nh ảnh w estern blot phát OCT­ protein TBG màng ối tr nh biệt hóa thành tế bào p tụy đảo Lượng protein OCT­ giảm dần tr nh biệt hóa p ­ actin protein nội chứng cho thấy lượng protein tỷ số Nồng độ p rotein O CT ­4, dấu ấn TBG giảm dàn theo thời gian củ a nhóm đựợc ni cấy mơi trường có bổ sung n icotinam id v p­m ercaptoethanol H nh ảnh w estern blo t cho thấy O CT­4 giảm dần theo thời gian, tr nh b iệt hóa 3.3.2 Biểu Insulin - D u n TBG màng ối người biệt hóa thành tế bào p íụy đảo 3,5 Xi ÍJ e l if i iNhómchứng ■Nhỏmbìệt hỏâ 2.5 3.5­1 ló m b iệt ó a 3.25 2.5'ì ­ jp s 'ễ S i5 - ‘ủ ọẹ >s« i ­ Ngày Ngày Ngày 14 Thời gian nuôi cấy H nh Đ thị nồng độ ARNtt insulin so với nhóm chứng Ngày Ngày Thời gian nuôi cấy Ngày 14 H nh Đồ thị nồng độ insulin so với nhóm chứng Có biệt hóa TB G m àng ối người thành tế bào b eta tụy đảo S au ngày nuôi cấy đĩa plastic thấy nồng độ A R N tt insuỉin (xác định RT­PCR) không tăng Sau 14 ngày nuôi cấy 571 plastic, nhóm có bổ sung mơi trường ni cấy N icotinam ide p ­ M ercaptoetanol thấy tăng cao insulin K ết q uả định lượng protein insulin phù hợp với kế t qu ả định lượng ARNtt K ết hóa m iễn dịch tế bào thấy TB G biểu rõ nét insulin nhóm xử lý vói nicotinamide p­mercaptoethanol IV BÀN LƯẶN 4.1 Quy trình phân lập T k ết đạt phân lập T BG từ m àng ối enzym chúng tô i nhận thấy: Nếu phân cắt màng ối Trypsin th số lượng tế bào thu thấp thòi gian thường phải kéo dài, có 60 phút tế biểu mô màng ối bị phân cắt hết N ếu cho thêm enzym co llagenase B vào T rypsin với tỷ ỉệ 1:1 th số lượng tế bào thu nhiều thời gian tan rã m àng ối nhanh (bàng ĩ) Chúng sử dụng tryp sin collagenase B để làm tan rã m àng ối giải phóng tế bào S d ĩ sử dụng trypsin tr nh phân lập v trypsin enzym protease có khả phân giải protein ngoại bào tương tự collagenase N goài ra, enzym khơng có tác đụng màng tế bào cấu trúc đặc biệt màng tế bào 4.2 Bảo q u ản v nuôi cấy tă n g sinh TB G m àng ối Khi bảo quản màng ối TBG màng ối glycerol 4°c, tế bào chết toàn Bảo quản đông lạnh với dimethyl sulphoxide (DMSO) nhiệt độ -80°c cho phép giữ lại tới 50% tế bào sống vài tháng [7] M ột số yếu tố sinh trưởng cytokine bị tr nh [5,7 ] Tuy nhiên, bảo quản màng ối dung dịch glycerol 50% khả sống tế bào khơng cịn [5] Nh n chung, khả sống tế bào màng ối phụ thuộc vào môi trường bảo quản, nhiệt độ 4.3 Biểu d u n insulin q trình bỉệt hóa TBG màng ối thành tế bào p tụy đảo Trong nghiên cứu chúng tôi, sau ngày nuôi cấy đĩa plastic thấy nồng độ ARNtt insulin (xác định RT­PCR) không tăng Sau 14 ngày nuôi cấy plastic, nhóm có bổ sung mơi trường ni cấy nicotinamide B­mercaptoetanol thấy tăng tổng hợp ARNtt insulin v ề h nh thái, tế bào tron g nhóm chứng ni cấy m trường DM EM đuy trì h nh thoi tương tự TBG màng ối b an đầu Trong té bào định hướng b iệt hóa thành tế bào beta tụy đảo, dần biến đổi h nh thái Sau ­ ngày, tế bào bám dính tố t vào bề m ặt đĩa nuôi cấy, phát triển chưa th thay đổi h nh thái Các tế bào ph át triển h nh thoi giống tế bào ban đầu Đ iều chứng tỏ, mật độ thấp, tế bào chưa tiếp xúc với nhau, th tế bào chưa biệt hóa có cytokin định hướng biệt hóa T ới ngày thứ 14, phần lớn tế bào có h nh đa diện, h nh dạng điển h nh tế bào biểu mô tuyến nuôi cấy Q uá tr nh biệt h óa T B G thành tế bào b eta tụy chia thành hai giai đoạn: G iai đoạn biệt hóa chức năng, tức giai đoạn m TB G bắt đầu biểu d ấu ấn đặc hiệu tế bào tụy Giai đoạn thứ hai giai đoạn biệt hóa v ề h nh thái, tể bào tụy xếp tạo thành tiểu đảo Langerhans h nh thành cấu trúc h nh thái củ a tụy Chóng tơi đùng k ỹ th uật phân tử để xác định tế bào có biểu dấu ấn tế bào tụy hay không Trong khuôn khổ củ a đề tài, xác định dấu ấn sinh học cù a tể bào b eta tụy đảo insulin v loại tế b tiết insulin S d ĩ chúng tơi chọn đấu ấn v insulin có biểu TB G tế bào tụy với mức độ khác Khi TB G biệt 572 hóa thành tế bào tụy th biểu củ a insulin tăng lên N hư vậy, tế bào tăng sản xuất insulin nói chức năng, T B G trờ th ành tế bào có chức cùa tế bào tụy Qua h nh thái biểu dấu ấn sinh học chứng tỏ TBG màng ối cósựbiệt hóa thành tế bào tụy Nghiên cứu phù họp với tác giả khác [4, 8] V K Ế T LUẬN 5.1 Phân iập , đ in h d anh , nuôi c y tăn g sin h bảo quản TB G m àng ối người ­ Đã phân lập thành công TBG từ màng ối người môi trường tối ưa trypsin 0.25% + Coliagenase B 0.1% ­ Nuôi cấy tăng sinh cá c T B G m àng ối người Bảo quản TB G m àng ối người thành công Không khác biệt khả sống bám dính vào bề mặt đĩa ni cấy tế bào 5.2 B iểu d u n in su lin tron g q trình ni c y ­ Đã biệt hóa tế bào có chức tế bào beta tụy đảo từ T B G m àng ối người ­ B iểu A R N tt insulin chứng tỏ có biệt hóa củ a TB G m àng ối người thành tế bào beta tụy đảo T À I L IỆ U T H A M K H Ả O [Ỉ Nguyễn Mạnh Khánh, Nguyễn Thị Thu Hà, Nguyễn Tiến Bình, Lý Tuấn Khải, Trư ng Thị Minh Nguyệt, Nguyễn Thanh Bình, Ngơ Văn Tồn (2007), “Ghép TBG tự thân điều trị khớp già thân xương chày5' TCNCYH Phụ trư ng / (4)/2007): ­ [2] Bhandarỉ, D.R., t al (1997), The simpliest method for in vitro beta­cell production from human adult stem cells Diff r ntiation 82(3): pp 144 ­ 452 [3] Furth, M.E and A Atala (2009) Stem cel sources to treat diabetes J C ll Bioch m 106(4): pp 507 ­511 [4] G lling, R.W., t a l (2003), Lower blood glucose, hyperglucagonemia, and pancreatic alpha cell hyperplasia in glucagon receptor knockout mice Proc Natl Acad Sci USA 100(3): pp 1438­ 1443 5] Hao, Y., t a l (2000), Identification of antiangiogenic and anti­inflammatory proteins in human amniotic membrane Corn a 19(3): pp 348 ­ 352 [6] Koik , T., t a t (1999), Cultured epithelial grafting using human amniotic membrane: the potential for using human amniotic epithelial cells as a cultured oral epithelium sheet Arch Oral Biol 56(10): pp 1170 ­ 1776 [7 Kubo, T., t al (2001), Time­sequential changes in biomechanical and morphological properties of articular cartilage in cryopreserved osteochondral allografting J Orthop Sci 6(3): pp 276 ­ 281 [8 Ma da, H., t al ( 2004), Epidermal growth factor and insulin inhibit cell death in pancreatic beta cells by activation of PI3­kinase/AKT signaling pathway under oxidative stress Transplant Proc 36(4): pp 1163 ­ 1165 573 ... để biệt hóa TBG màng ối thành tế bào beta tụy đảo Nuôi cấy tăng sinh vòng ngày Quan sát thấy tế bào bao phù kín đĩa ni Sau đó, bổ sung vào mơi trường yếu tố định hưóng biệt hóa TBG màng ối thành. .. có biểu dấu ấn tế bào tụy hay không Trong khuôn khổ củ a đề tài, xác định dấu ấn sinh học cù a tể bào b eta tụy đảo insulin v loại tế b tiết insulin S d ĩ chúng tơi chọn đấu ấn v insulin có biểu. .. G tế bào tụy với mức độ khác Khi TB G biệt 572 hóa thành tế bào tụy th biểu củ a insulin tăng lên N hư vậy, tế bào tăng sản xuất insulin nói chức năng, T B G trờ th ành tế bào có chức cùa tế bào