NGHIÊN cứu BIỂU HIỆN dấu ấn MIỄN DỊCH TRONG lơ xê MI cấp DÒNG LYMPHO ở TRẺ EM BẰNG PHƯƠNG PHÁP đếm tế bào DÒNG CHẢY tại VIỆN HUYẾT học TRUYỀN máu

Mối liên quan giữa một số dấu ấn miễn dịch với đáp ứng sau đợt điều trị cảm ứng ở bệnh nhân LXM cấp dòng lympho B...39... nhạy, độ đặc hiệu cao hơn, giúp chẩn đoán thể bệnh chính xác hơn

HOÀNG CHÍ CƯƠNG

NGHI£N CøU biÓu hiÖn DÊU ÊN MIÔN

DÞCH TRONG L¥ X£ MI CÊp DßNG LYMPHO ë

TRÎ EM B»NG PH¦¥NG PH¸P §ÕM TÕ BµO DßNG

CH¶Y T¹I VIÖN HUYÕT HäC- TRUYÒN M¸U

TRUNG ¦¥NG

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC

HOÀNG CHÍ CƯƠNG

NGHI£N CøU biÓu hiÖn DÊU ÊN MIÔN

DÞCH TRONG L¥ X£ MI CÊp DßNG LYMPHO ë

TRÎ EM B»NG PH¦¥NG PH¸P §ÕM TÕ BµO DßNG

CH¶Y T¹I VIÖN HUYÕT HäC- TRUYÒN M¸U

TRUNG ¦¥NG

Chuyên ngành: Huyết học- Truyền máu

Mã số:

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS Bạch Khánh Hòa

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Khái quát về các dấu ấn trong quá trình sinh sản và biệt hóa tế bào máu 3

1.1.1 Các dấu ấn biệt hóa tế bào máu 3

1.1.2 Sự trưởng thành và các dấu ấn biệt hóa của tế bào dòng lympho 5

1.2 Tóm tắt về LXM cấp và LXM cấp dòng lympho ở trẻ em và các phương pháp chẩn đoán 6

1.2.1 Lịch sử nghiên cứu 6

1.2.2 Các phương pháp chẩn đoán, xếp loại LXM cấp dòng lympho ở trẻ em 7

1.3.Tóm tắt về phương pháp Đếm tế bào dòng chảy 12

1.4 Tóm tắt về điều trị LXM cấp dòng lympho ở trẻ em 16

1.4.1 Mục tiêu điều trị 16

1.4.2 Các phương pháp điều trị 17

1.5 Tình hình nghiên cứu xếp loại và đặc điểm, mối liên quan giữa các dấu ấn miễn dịch với đáp ứng điều trị trong LXM cấp ở trẻ em trên thế giới và Việt Nam 19

1.5.1 Các nghiên cứu trên thế giới 19

1.5.2 Các nghiên cứu tại Việt Nam 22

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Đối tượng nghiên cứu 24

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân 24

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 24

2.2 Địa điểm- thời gian nghiên cứu 24

2.3.3 Hóa chất và sinh phẩm 25

2.3.4 Công cụ nghiên cứu 26

2.4 Phương pháp nghiên cứu 26

2.4.1 Thiết kế nghiên cứu 26

2.4.2 Quy trình nghiên cứu 27

2.4.3 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu 33

2.4.4 Phương pháp phân tích, xử lý số liệu 33

2.5 Khía cạnh đạo đức trong nghiên cứu 33

Chương 3: DỰ KIẾN KẾT QUẢ 34

3.1 Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu 34

3.1.1 Đặc điểm về giới 34

3.1.2 Đặc điểm về lứa tuồi 34

3.1.3 Đặc điểm xếp loại LXM cấp theo phương pháp hình thái học 34

3.1.4 Đặc điểm về kết quả điều trị 35

3.2 Đặc điểm xếp loại LXM cấp theo phương pháp Đếm tế bào dòng chảy 35

3.2.1 Phân bố theo dòng tế bào ung thư 35

3.2.2 Đặc điểm xếp loại LXM cấp dòng lympho B 36

3.2.3 Đặc điểm xếp loại LXM cấp dòng lympho T 37

3.3 Mối liên quan giữa một số dấu ấn miễn dịch với kết quả điều trị sau đợt điều trị cảm ứng 39

3.3.1 Mối liên quan giữa một số dấu ấn miễn dịch với tỷ lệ lui bệnh sau điều trị cảm ứng 39

3.3.2 Mối liên quan giữa một số tổ hợp dấu ấn miễn dịch với tỷ lệ lui bệnh sau điều trị cảm ứng 41

3.3.3 Mối liên quan giữa một số dấu ấn miễn dịch với tỷ lệ tử vong sau đợt điều trị cảm ứng 42

Bảng 1.2 Ý nghĩa tiên lượng của các bất thường di truyển hay gặp trong

LXM cấp dòng lympho trẻ em 10

Bảng 2.1 Xếp loại LXM cấp theo FAB1986 28

Bảng 2.2 Xếp loại miễn dịchLXM cấp dòng lympho 29

Bảng 2.3 Tiêu chuẩn chẩn đoán MDH dấu ấn miễn dịch bất thường và LXM cấp thể lai 30

Bảng 2.4 Bảng điểm xếp loại miễn dịch EGIL chẩn đoán LXM cấp thể lai 31

Bảng 3.1 Đặc điểm chung về giới tính của nhóm nghiên cứu 34

Bảng 3.2 Đặc điểm về tuổicủa nhóm nghiên cứu 34

Bảng 3.3 Đặc điểm xếp loại thể bệnh theo FAB1986 34

Bảng 3.4 Đáp ứng điều trị sau đợt hóa trị liệu tấn công 35

Bảng 3.5 Đáp ứng điều trị sau đợt hóa trị liệu tấn công theo thể bệnh 35

Bảng 3.6 Phân bố thể bệnh theo đặc điểm dòng tế bào 35

Bảng 3.7 Phân bố thể bệnh theo dưới nhóm 36

Bảng 3.8 Đặc điểm về mức độ biểu hiện CD45 36

Bảng 3.9 Đặc điểm biểu hiện các dấu ấn non 36

Bảng 3.10 Đặc điểm biểu hiện các dấu ấn đặc trưng dòng lympho B 37

Bảng 3.11 Đặc điểm biểu hiện các dấu ấn dòng tủy 37

Bảng 3.12 Phân bố thể bệnh theo dưới nhóm 37

Bảng 3.13 Đặc điểm biểu hiện các dấu ấn non 38

Bảng 3.14 Đặc điểm biểu hiện các dấu ấn đặc trưng dòng lympho T 38

Bảng 3.15 Đặc điểm biểu hiện các dấu ấn dòng tủy 38

Bảng 3.16 Mối liên quan giữa một số dấu ấn miễn dịch với đáp ứng sau đợt điều trị cảm ứng ở bệnh nhân LXM cấp dòng lympho B 39

sau đợt điều trị cảm ứng ở BN LXM cấp dòng lympho B 41Bảng 3.19 Mối liên quan giữa một số tổ hợp dấu ấn miễn dịch với đáp ứng

sau đợt điều trị cảm ứng ở BN LXM cấp dòng lympho T 42Bảng 3.20 Mối liên quan giữa một số dấu ấn miễn dịch với tử vong sau đợt

điều trị cảm ứng ở BN LXM cấp dòng lympho B 42Bảng 3.21 Mối liên quan giữa một số dấu ấn miễn dịch với tử vong sau đợt

điều trị cảm ứng ở BN LXM cấp dòng lympho T 43Bảng 3.22 Mối liên quan giữa một số tổ hợp dấu ấn miễn dịch với tử vong

sau đợt điều trị cảm ứng ở BN LXM cấp dòng lympho B 43Bảng 3.23 Mối liên quan giữa một số tổ hợp dấu ấn miễn dịch với tử vong

sau đợt điều trị cảm ứng ở BN LXM cấp dòng lympho B 44

Hình 1.1 Các dấu ấn miễn dịch tế bào lympho B theo tuổi biệt hóa 5Hình 1.2 Các dấu ấn miễn dịch tế bào lympho T theo tuổi biệt hóa 6Hình 1.3 Phân bố các quần thể tế bào trên Đếm tế bào dòng chảy 14

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1 Xếp loại tế bào máu bằng các kháng thể đơn dòng đặc hiệu với

kháng nguyên biệt hóa 4

Sơ đồ 1.2 Cấu tạo cơ bản hệ thống máy Đếm tế bào dòng chảy 13

Sơ đồ 1.3 Các vùng cửa sổ blast trên cửa sổ kết hợp CD45 và SSC bằng kỹ

thuật đếm tế bào dòng chảy 16

Sơ đồ 2.1 Các bước tiến hành nghiên cứu 27

ĐẶT VẤN ĐỀ

Lơxêmi (LXM) cấp là nhóm bệnh thường gặp nhất trong các bệnh cơquan tạo máu Bệnh có thể gặp ở mọi lứa tuổi, biểu hiện bệnh đa dạng.TạiViệt Nam, tác giả Đỗ Trung Phấn và Trần Thị Minh Hương (2002) nghiêncứu tình hình bệnh máu tại viện Huyết học- Truyền máu, Bệnh viện Bạch Maithấy bệnh LXM cấp gặp với tỷ lệ cao nhất (chiếm 38,5%) trong số các bệnhmáu gặp tại Bệnh viện Bạch Mai [1]

Ở trẻ em, Lơxêmi cấp cũng là loại ung thư khá phổ biến, chiếm khoảng31% tổng số các ca ung thư ở trẻ em dưới 15 tuổi trong những năm từ1990-1995 ở Mỹ, trong đó Lơxêmi cấp dòng lympho chiếm đến 3/4 Ướctính mỗi năm ở Mỹ có khoảng 3250 trường hợp trẻ em được chẩn đoánLơxêmi cấp, trong đó khoảng 2400 trường hợp là Lơxêmi cấp dònglympho Tỷ lệ mới mắc của LXM cấp dòng lympho ở trẻ em tại Mỹ là 3.7-4.9/100000 người mỗi năm [2] [3]

Từ nhiều năm nay, với sự phát triển của phương pháp hình thái học,phương pháp hóa học tế bào, việc chẩn đoán LXM cấp dòng lympho đã cónhiều thuận lợi Tuy nhiên vẫn còn có một số khó khăn nhất định do phụthuộc nhiều yếu tố chủ quan trong phân tích kết quả, một số sai sót có thể gặptrong quá trình thực hiện kỹ thuật,… làm ảnh hưởng đến công tác chẩn đoánthể bệnh, qua đó ảnh hưởng đến việc điều trị và tiên lượng

Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của phương phápĐếm tế bào dòng chảy (Flow Cytometry) trên thế giới cũng như ở Việt Nam,việc chẩn đoán LXM cấp nói chung và LXM cấp dòng lympho ở trẻ em nóiriêng đã có những bước tiến rõ rệt Phương pháp này đem lại hiệu quả cao, độ

nhạy, độ đặc hiệu cao hơn, giúp chẩn đoán thể bệnh chính xác hơn, từ đó giúpích cho việc điều trị và tiên lượng bệnh.

Đã có một số nghiên cứu xếp loại MDH trong LXM cấp sử dụngphương pháp Đếm tế bào dòng chảy tại Việt Nam, tuy nhiên chưa có nhiềunghiên cứu tiến hành trên đối tượng trẻ em Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài

“Nghiên cứu biểu hiện dấu ấn miễn dịch trong LXM cấp dòng lympho ở trẻ em bằng phương pháp Đếm tế bào dòng chảy (Flow Cytometry) tại Viện Huyết học- Truyền máu Trung ương” với mục tiêu:

1 Nghiên cứu biểu hiện dấu ấn miễn dịch để xếp loại Lơ xê mi cấp

dòng lympho ở trẻ em tại Viện Huyết học- Truyền máu Trung Ương.

2. Bước đầu tìm hiểu mối liên quan giữa một số dấu ấn miễn dịch với

đáp ứng điều trị sau đợt điều trị cảm ứng với phác đồ FRALLE 2000.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.Khái quát về các dấu ấn trong quá trình sinh sản và biệt hóa tế bào máu.

1.1.1 Các dấu ấn biệt hóa tế bào máu.

Trong quá trình sinh sản, biệt hóa tế bào máu, tế bào lần lượt trải quacác thay đổi về cấu trúc của nhân, nguyên sinh chất và đặc biệt là có sự hìnhthành những dấu ấn mang tính chất đặc trưng cho từng dòng, thậm chí cho từngloại tế bào và các dấu ấn này tương ứng với từng giai đoạn biệt hóa Việc xácđịnh các dấu ấn biệt hóa này đã cho phép nhận dạng chính xác các tế bào máu

Dấu ấn màng đầu tiên đặc trưng cho tế bào gốc tạo máu là CD34 Sau

đó cùng với quá trình sinh sản và biệt hóa của tế bào gốc thành các tế bào gốcđịnh hướng dòng tủy hay định hướng dòng lympho, mật độ các dấu ấn CD34trên màng tế bào gốc giảm dần và dần dần xuất hiện thêm các dấu ấn khác đặctrưng và đánh dấu quá trình biệt hóa

Năm 1981, một hội nghị quốc tế về kháng nguyên màng bạch cầu đãthống nhất đặt tên các dấu ấn màng là CD (Cluster of Differentiation - cụmbiệt hóa) Cho đến nay người ta đã phát hiện ra khoảng trên 350 CD [4] Các

CD này không chỉ xuất hiện trên màng tế bào mà một số CD còn xuất hiệntrong bào tương và nhân tế bào

Sơ đồ 1.1 Xếp loại tế bào máu bằng các kháng thể đơn dòng đặc hiệu với

kháng nguyên biệt hóa (Hoffbrand 1995) [5]

1.1.2 Sự trưởng thành và các dấu ấn biệt hóa của tế bào dòng lympho.

Tế bào mẹ (CFU-L) của lympho chung được phát triển từ tế bào gốcsinh máu Từ đây, chúng phân chia (theo chức năng) thành 3 nhóm chính làlympho T (85%), lympho B (10%) và NK- Natural Killer cell (5-10%) [6]

Dòng lympho B: trưởng thành từ tế bào mẹ của lympho chung L), trải qua giai đoạn biệt hóa khác nhau ở tủy xương, song song với việc xuấthiện, thay đổi mức độ biểu hiện hoặc mất đi các CD để trở thành tế bàotrưởng thành ở máu ngoại vi, với sự có mặt của các tế bào đệm trong tủyxương tiết các cytokine cần thiết cho quá trình biệt hóa này [7]

(CFU-Hình 1.1 Các dấu ấn miễn dịch tế bào lympho B theo tuổi biệt hóa

Dòng lympho T: quá trình biệt hóa và trưởng thành xảy ra ở tủy xương

và tuyến ức, trải qua nhiều giai đoạn với sự hình thành và biến mất của các

CD đặc trưng, với sự hỗ trợ của các tế bào biểu mô, tế bào đuôi gai và các đạithực bào tại tuyến ức [7]

Hình 1.2 Các dấu ấn miễn dịch tế bào lympho T theo tuổi biệt hóa

1.2 Tóm tắt về LXM cấp và LXM cấp dòng lympho ở trẻ em và các phương pháp chẩn đoán.

1.2.1 Lịch sử nghiên cứu.

LXM cấp là một nhóm bệnh đặc trưng bởi sự tăng sinh và tích lũytrong tủy xương và máu ngoại vi của những tế bào non ác tính Những tế bàonày dần sẽ thay thế và ức chế quá trình trưởng thành và phát triển của các tếbào bình thường trong tủy xương

Bệnh LXM cấp được Velpeau ghi nhận lần đầu từ năm 1827 Đến năm

1845, Bennett đã đặt tên cho bệnh LXM cấp là leucocythemia (tăng bạchcầu) Sau đó, Virchow gọi bệnh này là bệnh máu trắng (white blood), rồichính ông đặt tên cho bệnh cái tên mà cho đến bây giờ vẫn đang được sử

dụng, đó là leukemia (tiếng Hy Lạp có nghĩa là máu trắng) Năm 1887, phảinhờ có phát minh nhuộm tiêu bản của Ehrlich thì mới có thể phân biệt đượcnhững dạng khác nhau của dòng bạch cầu Tới năm 1900 thì các cụm từ dòngtủy và dòng lympho đã bắt đầu được sử dụng để xếp loại LXM cấp [6] Ngàynay, cùng với những tiến bộ trong các phương pháp chẩn đoán, đặc biệt là cáctiến bộ trong phương pháp miễn dịch học (MDH) và di truyền phân tử(DTPT), việc chẩn đoán LXM cấp nói chung và LXM cấp dòng lympho ở trẻ

em nói riêng cũng được cải tiến rõ rệt Các thể LXM ở trẻ em được thống kê

rõ ràng hơn với tỷ lệ LXM cấp dòng lympho chiếm đến 80%, tiếp theo làLXM cấp dòng tủy, chiếm khoảng 15%, còn lại 3-5% là LXM kinh dòng BChạt [8] Nhiều nghiên cứu trên các cộng đồng người khác nhau cũng đã chỉ raLXM cấp dòng lympho ở trẻ em chiếm tỷ lệ cao nhất trong các LXM [9] Ở

Mỹ, nghiên cứu về LXM cấp dòng lympho cũng chỉ ra rằng đây là loại LXMcấp hay gặp nhất ở trẻ em, với tần suất mắc bệnh cao nhất ở độ tuổi từ 2-5tuổi Trong đó, LXM cấp dòng lympho B chiếm hơn 80% số trường hơp,LXM cấp dòng lympho T chiếm khoảng 10-15% số trường hợp [2] [10]

1.2.2 Các phương pháp chẩn đoán, xếp loại LXM cấp dòng lympho ở trẻ em.

1.2.2.1 Phương pháp hình thái học (HTH).

Bằng phương pháp nhuộm giêmsa tiêu bản máu ngoại vi và tiêu bảndịch hút tủy xương, dựa vào đặc điểm hình thái tế bào để xác định tỷ lệ tế bàoblast, ngoài ra ta có thể nhận biết một số khác biệt giữa các dòng tế bào áctính

1.2.2.2 Phương pháp hóa học tế bào (HHTB).

Từ những năm 1940 - 1970, các phát hiện về rối loạn chuyển hóa đặctrưng cho từng dòng tế bào đã được áp dụng hình thành các kỹ thuật nhuộmhóa học tế bào, các kỹ thuật phổ biến hiện nay đang sử dụng cho xếp loại

LXM cấp như: Myeloperoxydase (MPO), Sudan đen (SB: Sudan Black),Periodic Acid Schiff (PAS), Esterase không đặc hiệu có và không có ức chếbằng NaF, Esterase đặc hiệu.

Kỹ thuật nhuộm MPO dựa trên nguyên lý là các tế bào có chứa men

myeloperoxydase (MPO) như bạch cầu hạt, bạch cầu mono có tác dụng oxy hóacác cơ chất như gốc phenol, một số acid amin và acid thơm Phản ứng này sẽdiễn ra nhanh hơn nếu có thêm hydrogen peroxydase (H2O2) trong phản ứng.Các tế bào dòng lympho không chứa men này nên phản ứng sẽ âm tính

Kỹ thuật nhuộm Sudan đen đã được nghiên cứu và phân tích mức độ

dương tính ở các dòng tế bào máu khác nhau và thống nhất nhận định dòngbạch cầu hạt dương tính mạnh nhất, dòng mono dương tính ở các mức độkhác nhau còn dòng lympho thường âm tính Trên cùng một tế bào thì mức độdương tính của SB thường mạnh hơn MPO

Kỹ thuật Esterase không đặc hiệu giới hạn ở những men thủy phân các

ester đơn giản của các alcol có nhóm N- tự do và các acid hữu cơ Sau nàyngười ta dùng muối NaF để ức chế phản ứng này ở dòng mono giúp phân biệtdòng bạch cầu hạt và bạch cầu mono

Kỹ thuật nhuộm PAS sử dụng periodic (HIO4.2H2O) dùng để phát hiệnblast dòng lympho trong xếp loại LXM cấp nhưng chỉ khoảng 50% LXM cấpdòng lympho cho phản ứng dương tính

Dựa trên đặc điểm hình thái học và HHTB của tế bào LXM, xếp loạiFAB 1986 (French American British 1986) đã và đang được sử dụng trongxếp loại LXM từ nhiều năm nay

Bảng 1.1 Xếp loại LXM cấp dòng lympho theo FAB 1986

Hạt nhân Không thấy hoặc

nhỏ

Một hay nhiều hạtnhân to

Một hay nhiều hạtnhân hình túi

Tỷ lệ nhân/NSC Thấp Khá cao, thay đổi Cao

Độ kiềm NSC Thay đổi Vừa hoặc đậm Rất đậm

Không bào Thường không có Thường không có Hốc to và nhiều

 Hóa học tế bào: Âm tính với MPO, SB, esterase không đặc hiệu.Khoảng 50% các trường hợp dương tính với PAS

1.2.2.3 Phương pháp di truyền tế bào- di truyền phân tử.

Nghiên cứu bệnh sinh LXM cấp nhận thấy có liên quan đến tổn thương

di truyền trong các tế bào gốc tạo máu làm tăng sinh và tích tụ các tế bào nongây lấn át các dòng tế bào tạo máu bình thường gây bệnh cảnh lâm sàngLXM, biểu hiện tổn thương di truyền trong LXM cấp rất đa dạng bao gồm cảnhững bất thường về số lượng đến những bất thường về cấu trúc phân tử.Việc phát hiện các bất thường di truyền có ý nghĩa quan trọng trong chẩnđoán, tiên lượng cũng như theo dõi điều trị

Bảng 1.2 Ý nghĩa tiên lượng của các bất thường di truyển hay gặp trong

80% (65-90%)71% (55-85%)73% (55-85%)53%

 Phương pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp, gián tiếp

Dựa trên nguyên lý phản ứng miễn dịch kháng nguyên-kháng thể KT) để phát hiện các KN biệt hóa tế bào khi cho chúng kết hợp đặc hiệu với

(KN-KT đơn dòng có gắn huỳnh quang và phát quang khi đọc kết quả trên KHVhuỳnh quang Kỹ thuật này đã mang lại giá trị bổ sung cho phương pháp

HTH-HHTB (hình thái học-hóa học tế bào) Tuy nhiên còn có một số hạn chế

đó là: Kết quả phụ thuộc vào người làm, người đọc, chưa tách biệt được tuyệtđối quần thể tế bào non ác tính (Blast) cần nghiên cứu, chỉ phân tích đượctừng dấu ấn riêng biệt do đó độ chính xác chưa cao

 Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch

Hóa mô miễn dịch là một phương pháp được áp dụng từ khá lâu trongviệc chẩn đoán, xếp loại bệnh lý LXM cấp cũng như các bệnh lý ác tính kháccủa hệ tạo máu Phương pháp này dựa trên cơ sở các kháng thể đơn dòng gắnchất nhuộm màu liên kết đặc hiệu với các kháng nguyên trên bề mặt tế bào,sau đó quan sát trên kính hiển vi để xác định nguồn gốc, đặc tính tế bào.Phương pháp này có một số nhược điểm là phân tích được số lượng ít các dấu

ấn tế bào, độ nhạy thấp hơn do phụ thuộc nhiều vào kỹ thuật nhuộm, phụthuộc chủ quan người phân tích kết quả…

 Phương pháp đếm tế bào dòng chảy (Flow Cytometry)

Đếm tế bào dòng chảy (Flow Cytometry) là kỹ thuật đo và phân tíchđồng thời nhiều thông số, đặc điểm của một phần tử (tế bào) cần nghiên cứubao gồm: Kích thước, tính chất hạt trong nguyên sinh chất (NSC), độ phứctạp của bào tương và nhân, mức độ gắn huỳnh quang (mức độ kết hợp khángthể với kháng nguyên cần nghiên cứu)

Kỹ thuật Đếm tế bào dòng chảy được thực hiện trên tế bào trong huyềndịch (máu, tủy xương, dịch cơ thể hoặc huyền dịch tế bào tổ chức), các tế bàonày được ủ với các KT gắn huỳnh quang, KT này đặc hiệu với các protein KNtương ứng trên bề mặt tế bào hoặc trong bào tương và nhân tế bào Dùng mộtpanel KT có số lượng KT phù hợp tùy thuộc vào yêu cầu lâm sàng cụ thể ởmỗi bệnh nhân để xác định kiểu hình miễn dịch

1.3.Tóm tắt về phương pháp Đếm tế bào dòng chảy

Kháng thể đơn dòng (Monoclonal antibody): là các kháng thể đặc hiệucho một đáp ứng kháng nguyên Các kỹ thuật sinh học cho phép xác định các

tế bào mang các dấu ấn đặc trưng có mặt trên bề mặt hoặc trong nhân tế bàobạch cầu người Các tế bào này được dùng để gây miễn dịch cho động vật thuđược các tế bào lympho B mẫn cảm của cá thể động vật đó Lai tế bàolympho B đã được mẫn cảm này với một tế bào u plasmo thu được một tếbào lai có khả năng sinh một lương không giới hạn kháng thể đơn dòng chốnglại dấu ấn đặc trưng của tế bào bạch cầu người ban đầu Kháng thể đơn dòng

là công cụ quan trọng để xếp loại miễn dịch LXM cấp cũng như thực hiệnnghiên cứu về nhiều biểu hiện protein tế bào khác nhau, mở ra một kỷ nguyênmới cho nền y học

Cấu tạo của hệ thống máy Đếm tế bào dòng chảy: bao gồm có 3 hệ

Sơ đồ 1.2 Cấu tạo cơ bản hệ thống máy Đếm tế bào dòng chảy

Nguyên lý của phương pháp

Hoạt động của thiết bị dựa trên nguyên lý thủy động lực học dynamic), tạo ra một dòng chảy tế bào liên tục qua một khe đếm Dòng chảynày được duy trì đảm bào tại một thời điểm chỉ có một tế bào riêng lẻ đi quakhe đếm, tại khe đếm này có chùm sáng laser đi qua Các tế bào tác động đếnviệc tán xạ của chùm sáng, đồng thời các chất huỳnh quang gắn với kháng thể

(hydro-bị chùm sáng kích thích, phát ra ánh sáng huỳnh quang Thu nhận và phântích các thông tin của chùm sáng này cho phép phân tích thông tin về tế bào,bao gồm kích thước, độ phức tạp nhân và nguyên sinh chất, sự có mặt haykhông các dấu ấn trên bề mặt tế bào, trong bào tương, nhân tế bào… Chùmsáng thu được sau khi tia laser đến bị tác động bào gồm ánh sáng tán xạ vàánh sáng bức xạ có được do sự phát xạ của chất huỳnh quang Ánh sáng tán

xạ cùng chiều với tia tới gọi là tán xạ thẳng (FS: Forward Scatter), còn ánhsáng tán xạ với góc lớn hơn được gọi là tán xạ bên (SS: Side Scatter) Mức độtán xạ phụ thuộc vào các đặc tính của tế bào đó, như kích thước, mức độ hạt,

độ phức tạp của nhân,… Tán xạ thẳng cho biết kích thước tế bào; tán xạ bên

cho biết mức độ phức tạp của nhân và nguyên sinh chất, mức độ hạt Do có sựkhác biệt về các thông số này, biểu đồ 2 thông số FS và SS cho phép ta phânbiệt 3 quần thể tế bào lớn là mono, lympho, bạch cầu hạt Tuy nhiên, dokhông có sự khác biệt rõ rệt giữa các tế bào non ác tính với các tế bào tiềnthân của các quần thể trên nên trên biểu đồ FS và SS, người ta không nhậnbiết được rõ quần thể tế bào non ác tính Bằng việc sử dụng CD45 (hay LCA)

là kháng nguyên phổ biến dòng bạch cầu, kết hợp với thông tin có được củachùm ánh sáng tán xạ bên (SS), Borowitz và cộng sự đã phân tách được quầnthể tế bào non ác tính với các quần thể tế bào bình thường [12] Cơ sở củaphương pháp sử dụng CD45 và SS này là các tế bào non ác tính bắt nguồn từ

hệ tạo máu và các tế bào tiền thân dòng tủy trong tủy xương có biểu hiệnCD45 ở mức thấp và trung bình, trong khi tế bào mono và lympho có mứcbiểu hiện cao hơn, đồng thời chúng có SS thấp hơn so với các tế bào dòngbạch cầu hạt [13]

Hình 1.3 Phân bố các quần thể tế bào trên Đếm tế bào dòng chảy [14]

Tế bào có dấu ấn cần khảo sát được ủ với kháng thể đơn dòng tươngứng gắn với chất huỳnh quang Phức hợp tế bào (KN)- kháng thể này đi qua

hệ thống máy Đếm tế bào dòng chảy Chất huỳnh quang gắn kháng thể đơndòng dưới tác động của chùm laser tới bị kích thích và phát ra ánh sáng, cóbước sóng đặc trưng theo loại chất huỳnh quang Ánh sáng này được thu nhậnbởi các đầu thu đặc biệt thích hợp với từng bước sóng, qua đó cho phép đánhgiá có sự hiện diện hay không, cũng như mật độ hiện diện của dấu ẫn miễndịch (kháng nguyên) cần khảo sát trên bề mặt tế bào, trong bào tương haytrong nhân tế bào.

Ứng dụng của phương pháp trong xếp loại LXM cấp

 Xếp loại miễn dịch bằng phương pháp Đếm tế bào dòng chảy có vaitrò rất quan trọng giúp xác định dòng tế bào và mức độ biệt hóa Việc lấybệnh phẩm sử dụng cho phương pháp này cũng dễ dàng hơn, do có thể thựchiện với bệnh phẩm máu ngoai vi (trong trường hợp bệnh nhân không thựchiện được xét nghiệm huyết tủy đồ)

 Xác định quần thể tế bào blast bằng cửa sổ CD45 và SSC: Quần thểblast có SSC thấp (thấp hơn quần thể lymphocytes bình thường) và có CD45dương tính mức độ nhẹ cho tới âm tính Đó là đặc điểm khác biệt với quần thểblast dòng hạt.Sử dụng phần mềm phân tích kết quả trên chương trình phântích LXM cấp cho máy Cytomic Navios của hãng Beckman Coulter (Mỹ)

Sơ đồ 1.3 Các vùng cửa sổ blast trên cửa sổ kết hợp CD45 và SSC bằng kỹ

thuật đếm tế bào dòng chảy

 Phân tích dấu ấn biệt hóa tế bào máu trong quần thể tế bào blast+ Tiêu chuẩn chẩn đoán dương tính của các CD trên Đếm tế bào dòngchảy:(Theo European Group for the Immunogical characterization ofleukemias: EGIL)

Dương tính khi: Có  20% tế bào trong quần thể tế bào blast dươngtính với dấu ấn biệt hóa tương ứng và ≥ 10% đối với kháng nguyên nhânTdT

 Dựa vào đặc điểm xuất hiện các dấu ấn miễn dịch theo dòng để xácđịnh các dưới nhóm

Mục tiêu điều trị của điều trị LXM cấp nói chung và LXM cấp dòng

lympho ở trẻ em là làm lui bệnh tới khỏi bệnh, gồm:

- Làm lui các biểu hiện lâm sàng và huyết học;

- Duy trì tình trạng lui bệnh bằng hóa trị liệu hệ thống và điều trị dựphòng thâm nhiễm thần kinh trung ương;

- Điều trị các biến chứng của bệnh và do điều trị

Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của các công ty và nhà phân phốidược phẩm, sự lựa chọn thuốc cho điều trị theo đúng và đủ các phác đồ chuẩn

đã trở nên dễ dàng hơn Đã có nhiều phác đồ được áp dụng trong điều trịLXM cấp dòng lympho ở Việt Nam như phác đồ CCG1991 cho nhóm nguy

cơ thường, phác đồ MSKCC- New York 2 cho nhóm nguy cơ cao, phác đồMSKKC cho nhóm tái phát tủy xương, phác đồ FRALLE2000 [15] Trong

đó, phác đồ FRALLE2000 đã được áp dụng rộng rãi ở các cơ sở điều trị huyếthọc nhi khoa trên cả nước nói chung và tại khoa Nhi Viện Huyết học- Truyềnmáu Trung Ương nói riêng từ năm 2010 tới nay

1.4.2.2 Ghép tế bào gốc tạo máu

Trong khoảng hơn 40 năm qua trên thế giới, chất lượng điều trị LXMcấp dòng lympho đã đạt được nhiều thành công và có tính cải thiện một cách

ổn định Hầu hết bệnh nhi ngày nay được điều trị thành công, đạt được tìnhtrạng lui bệnh mà không cần sử dụng đến phương pháp ghép tế bào gốc tạomáu [17] Ghép tế bào gốc tạo máu được đặt ra với nhóm bệnh nhân nguy cơcao, không đạt được tình trạng lui bệnh hoặc tái phát, đặc biệt tái phát sớmsau khi hoàn thành hóa trị liệu [16] Ghép tế bào gốc tạo máu ở những bệnhnhi này gíúp kéo dài thời gian sống thêm 5 năm không bệnh (EFS) và thờigian sống thêm chung (OS) Trong khoảng thời gian từ năm 1995 đến năm

2000, dưới sự phối hợp của Nhóm nghiên cứu Quốc tế Berlin- Munster (I-BFM) với Nhóm nghiên cứu nhi khoa của Hiệp hội Ghép Châu Âu(EBMT), một nghiên cứu lâm sàng ngẫu nhiên đã được thực hiện trên 357bệnh nhi, với mục đích so sánh kết quả điều trị của phương pháp ghép tế bàogốc sử dụng nguồn người cho cùng huyết thống cho bệnh nhi nhóm nguy cơcao sau đợt lui bệnh hoàn toàn đầu tiên (CR1) với phương pháp hóa trị liệuđơn thuần Kết quả cho thấy, thời gian sống thêm 5 năm không bệnh ở nhómghép tế bào gốc được cải thiện đáng kể (56,7%) so với nhóm hóa trị liệu đơnthuần (40,6%) (P= 0,02) [18] Trong một nghiên cứu tương tự của các tác giảItalia mới được công bố gần đây, phân tích kết quả điều trị trên 211 bệnh nhithuộc nhóm nguy cơ cao được ghép tế bào gốc đồng loại ở lần lui bệnh hoàntoàn đầu tiên từ năm 1990 đến năm 2005, cũng cho thấy xác suất sống thêmtoàn bộ 10 năm và sống thêm 10 năm không bệnh lần lượt là 63,4% và 61%.Cũng trong nghiên cứu này, tỷ lệ tử vong và tỷ lệ tái phát tích lũy 10 năm liênquan đến ghép cũng rất thấp, tương ứng là 15% và 24% [19]

Frankfurt-1.4.2.3 Điều trị nhắm đích

Điều trị hóa chất có nhược điểm chung, đó là cùng một lúc làm tổnthương cả tế bào ác tính và tế bào lành, dẫn đến một số hạn chế trong hiệu quả

điều trị và khả năng phục hồi sau điều trị Từ nhiều năm nay, các nhà khoahọc đã tiến hành nhiều nghiên cứu để tìm ra các loại thuốc đặc hiệu có tácdụng chọn lọc trên tế bào ác tính, hoặc trên một số phân tử đặc hiệu có tínhquyết định trong cơ chế bệnh sinh của bệnh, gọi là điều trị nhắm đích(targeted therapies) Một bước tiến quan trọng trong điều trị LXM cấp dònglympho là hiệu quả của điều trị nhắm đích, tấn công vào các bản dịch mã đặchiệu, như phân tử protein lai BCR-ABL bởi các chất ức chế tyrosine kinase(TKIs), hoặc các kháng nguyên bởi các kháng thể đơn dòng đặc hiệu Các tếbào blast trong LXM cấp dòng lympho biểu hiện nhiều kháng nguyên đặchiệu khác nhau như CD19, CD20, CD22, CD33 và CD52; đây chính là cácđích nhắm của các kháng thể đơn dòng Cho đến nay, kháng thể đơn dòngkháng CD20 (rituximab) là có nhiều dữ kiện sử dụng lâm sàng nhất, được sửdụng phối hợp trong các phác đồ đa hóa trị liệu điều trị LXM cấp dòng Btrưởng thành/ U lympho Burkitt Một kháng nguyên khác là CD19, với tầnxuất biểu hiện cao trong LXM cấp dòng lympho B, cũng đã có kháng thể đặchiệu, đó là blinatumomab, tấn công trực tiếp CD19 và CD3 Ngoài ra, cũng đã

có những nghiên cứu nhỏ hơn, hoặc các báo cáo ca bệnh được ghi nhận vềkháng thể đơn dòng kháng CD52 (alemtuzumab), kháng CD22(epretuzumab), và kháng CD33 (gemtuzumab) [20] Việc áp dụng phươngpháp điều trị nhắm đích này càng cho thấy vai trò quan trọng của xếp loạimiễn dịch trong việc xác định chính xác các dấu ấn đặc hiệu để có quyết địnhchính xác trong việc sử dụng thuốc đúng là hợp lý

1.5 Tình hình nghiên cứu xếp loại và đặc điểm, mối liên quan giữa các dấu ấn miễn dịch với đáp ứng điều trị trong LXM cấp ở trẻ em trên thế giới và Việt Nam

1.5.1 Các nghiên cứu trên thế giới