Nghiên cứu qui trình nuôi cấy, biệt hóa tế bào gốc sinh tinh để điều trị vô sinh nam giới

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ QUỐC PHÒNG ĐỀ TÀI ĐỘC LẬP CẤP NHÀ NƯỚC BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH NUÔI CẤY, BIỆT HÓA TẾ BÀO GỐC SINH TINH ĐỂ ĐIỀU TRỊ VÔ SINH NAM GIỚI MÃ SỐ: ĐTĐL2009T/27 Cơ quan chủ trì đề tài: Học viện Quân y - Bộ Quốc phòng Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Nguyễn Đình Tảo 8999 HÀ NỘI - 2011 MỤC LỤC Nội dung Trang CHƯƠNG I MỞ ĐẦU 28 CHƯƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 31 2.1 Tổng quan phân lập tế bào dòng tinh 31 2.2 Tổng quan tế bào nuôi cấy, biệt hóa tế bào gốc sinh tinh 41 2.3 Về tiêu chuẩn đánh giá tế bào gốc sinh tinh trình nuôi cấy 57 2.4 Về bảo quản tế bào dòng tinh 73 CHƯƠNG III ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 85 3.1 Đối tượng nghiên cứu: 85 3.2 Phương pháp nghiên cứu 86 3.3 Trang bị, hóa chất 102 CHƯƠNG IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 105 4.1 Nghiên cứu phân lập tế bào dòng tinh từ mào tinh 105 4.2 Nghiên cứu phân lập tế bào gốc sinh tinh từ ống sinh tinh 107 4.3 Kết nghiên cứu nuôi cấy tế bào dòng tinh 111 4.3.1 Đặc điểm bệnh nhân 111 4.3.2 Đặc điểm cấu trúc ống sinh tinh bệnh nhân azoospermia 111 4.3.3 Biến đổi số lượng tế bào dòng tinh từ mào tinh trình nuôi cấy 112 4.3.4 Biến đổi số lượng tế bào gốc sinh tinh từ ống sinh tinh trình nuôi cấy 115 4.3.5 Đánh giá tế bào gốc sinh tinh GPF 121 4.3.6 Đánh giá tế bào dòng tinh kỹ thuật FISH 123 4.3.7 Đánh giá tế bào dòng tinh kính hiển vi điện tử 125 4.3.8 Đánh giá khả thụ tinh tế bào sau nuôi cấy kỹ thuật ICSI thực nghiệm (n = 100 noãn): 126 21 4.3.9 Đánh giá khả thụ tinh tế bào sau nuôi cấy kỹ thuật ICSI lâm sàng (n = 125 noãn): 127 4.4 Kết nghiên cứu bảo quản tế bào gốc sinh tinh 129 4.4.1 Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu 130 4.4.2 Thể tích tinh hoàn 130 4.4.3 Kết nghiên cứu trữ lạnh tinh trùng thu nhận từ mào tinh 131 4.4.4 Kết nghiên cứu trữ lạnh mô tinh hoàn 132 4.5 Các qui trình phân lập, nuôi cấy bảo quản tế bào gốc sinh tinh 138 CHƯƠNG V BÀN LUẬN 157 5.1 Về lựa chọn bệnh nhân qua xét nghiệm đoạn nhỏ vùng AZF NST Y 157 5.2 Về trình phân lập tế bào gốc sinh tinh 163 5.3 Nuôi cấy tế bào dòng tinh thu từ mào tinh 164 5.4 Nuôi cấy tế bào gốc sinh tinh 165 5.5 Vai trò tế bào Sertoli nuôi cấy 166 5.6 Phương pháp nuôi cấy 166 5.7 Ý nghĩa phương pháp nuôi cấy 167 5.8 Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu bảo quản tế bào gốc sinh tinh 168 5.9 Thể tích tinh hoàn tế bào gốc sinh tinh lập 168 5.10 Trữ lạnh tế bào dòng tinh thu nhận từ mào tinh 169 5.11 Trữ lạnh tế bào gốc sinh tinh mô tinh hoàn bệnh nhân 176 KẾT LUẬN 182 KIẾN NGHỊ 184 TÀI LIỆU THAM KHẢO 185 PHỤ LỤC 201 - Danh sách bệnh nhân PESA, MESA - Danh sách bệnh nhân trữ lạnh tinh trùng từ mào tinh mô tinh hoàn 22 DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT ART Assisted Reproductive Technology (Kỹ thuật hỗ trợ sinh sản) AID Artificial insemination by donor (Thụ tinh nhân tạo tinh trùng người cho) CPA Cryoprotective agents: Các chất bảo vệ tế trình đông lạnh AZF Azoospermic factor CS Cộng CSF Cryosurvival factor: số sống sau trữ lạnh tinh trùng DMSO Dimethyl sulphoxide G Glycerol HE Phương pháp nhuộm tiêu Hematoxylin- Eosin IVF In Vitro Fertilization (Thụ tinh ống nghiệm) ICSI Intracytoplasmic Sperm Injection (Tiêm tinh trùng vào bào tương trứng) NOA Non-Obstructive Azoospermia MESA Microsurgical Epididymal Sperm Aspiration OA Obstructive Azoospermia PESA Percutaneous Epididymal Sperm Aspiration SC Stem Cell TESE Testicular Sperm Extraction TEM Transmission electron microscopy: Kính hiển vi điện tử truyền qua TTTON Thụ tinh ống nghiệm WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế giới ) 23 DANH MỤC BẢNG Nội dung Trang Bảng 4.1 Tuổi thời gian vô sinh trung bình nhóm bệnh nhân 105 Bảng 4.2 Nồng độ số hormone bệnh nhân 105 Bảng 4.3 Kết thu gom, phân lập tế bào dòng tinh 106 Bảng 4.4 Tuổi thời gian vô sinh bệnh nhân nghiên cứu 111 Bảng 4.5 Tỷ lệ di động tinh trùng tinh tử mào tinh qua thời điểm nuôi cấy môi trường không bổ sung hormone 113 Bảng 4.6 Tỷ lệ di động tinh trùng tinh tử mào tinh qua thời điểm nuôi cấy môi trường có bổ sung hormone 114 Bảng 4.7 So sánh kết nuôi cấy tế bào mào tinh môi trường nuôi cấy có bổ sung không bổ sung hormone 114 Bảng 4.8 Biến đổi số lượng tế bào dòng tinh chuột môi trường nuôi cấy 116 Bảng 4.9 Biến đổi số lượng tế bào dòng tinh người môi trường nuôi cấy 118 Bảng 4.10 Khả thụ tinh tinh tử chuột sau nuôi cấy 126 Bảng 4.11 Sự phát triển phôi chuột ngày với tinh tử sau nuôi cấy 126 Bảng 4.12 Sự phát triển phôi chuột ngày với tinh tử sau nuôi cấy 127 Bảng 4.13 Khả thụ tinh tinh tử sau nuôi cấy 127 Bảng 4.14 Sự phát triển phôi ngày với tinh tử sau nuôi cấy 128 Bảng 4.15 Sự phát triển phôi ngày với tinh tử sau nuôi cấy 129 Bảng 4.16 Tuổi, thời gian vô sinh bệnh nhân 130 Bảng 4.17 Đặc điểm thể tích tinh hoàn bệnh nhân nghiên cứu 130 Bảng 4.18 Kết độ di động tinh trùng thu nhận từ mào tinh trước, sau trữ lạnh nuôi cấy 131 Bảng 4.19 Tỉ lệ sống tinh trùng trước trữ lạnh sau rã đông 131 24 Bảng 4.20 Hình thái tinh trùng trước sau rã đông 132 Bảng 4.21 Đặc điểm mô tinh hoàn trước trữ lạnh nhóm sử dụng chất bảo quản Glycerol (Sperm freeze) 133 Bảng 4.22 Kết sau trữ lạnh mô tinh hoàn sử dụng Glycerol (Sperm Freeze) 133 Bảng 4.23 Đặc điểm mô tinh hoàn trước trữ lạnh nhóm sử dụng chất bảo quản DMSO 135 Bảng 4.24 Kết sau trữ lạnh mô tinh hoàn sử dụng DMSO 135 Bảng 4.25 Biến đổi số lượng tế bào dòng tinh môi trường trước sau bảo quản DMSO 137 Bảng 5.1 Kết độ di động, tỉ lệ sống tinh trùng thu nhận từ mào tinh trước sau trữ lạnh tác giả 172 25 DANH MỤC HÌNH Nội dung Trang Hình 2.1 Sơ đồ trình sinh tinh trùng 58 Hình 2.2 Sơ đồ cấu trúc phần ống sinh tinh người bình thường 60 Hình 2.3 Cấu trúc ống sinh tinh người bình thường (x600) 66 Hình 2.4 Cấu trúc ống sinh tinh BN tắc (nhuộm HE, X600) 66 Hình 2.5 Cấu trúc ống sinh tinh BN không tắc (nhuộm HE, x600) 67 Hình 2.6 Các tế bào dòng tinh từ bệnh nhân azoospermia không tắc 68 Hình 2.7 Hình ảnh ống sinh tinh tế bào thu tách từ ống sinh tinh 69 Hình 2.8 Các tế bào dòng tinh nuôi cấy 70 Hình 2.9 Các tế bào gốc sinh tinh nuôi cấy phân chia giảm phân chụp kính hiển vi điện tử 71 Hình 4.1 Mẫu mô tinh hoàn sau thu hồi 107 Hình 4.2 Ống sinh tinh bệnh nhân azoospermia cắt ngang (HE, x400) 107 Hình 4.3 Các tế bào sau phân lập cách (soi nổi, x100) 108 Hình 4.4 Các tế bào sau phân lập cách (soi nổi, x100) 109 Hình 4.5 Các tế bào gốc sinh tinh thu từ môi trường nuôi cấy 109 Hình 4.6 Hệ thống phân lập tế bào dựa vào lực từ tính (MACS) 110 Hình 4.7 Ống sinh tinh bệnh nhân azoospermia tắc (HE, x600) 111 Hình 4.8 Ống sinh tinh bệnh nhân azoospermia không tắc (HE, x600) 112 Hình 4.9 Các tinh tử phân lập (x600) 115 Hình 4.10 Tinh hoàn chuột ngày tuổi x100 117 Hình 4.11 Tinh hoàn chuột ngày tuổi x400 118 Hình 4.12 Ngày nuôi cấy x400 vi trường thấy tinh nguyên bào tinh bào 119 Hình 4.13 Hình ảnh nuôi cấy 10 ngày x600 120 26 Hình 4.14 Các tế bào dòng tinh sau 20 ngày nuôi cấy 120 Hình 4.15 Hình ảnh tế bào gốc sinh tinh nuôi cấy với GFP x400 122 Hình 4.16 Hình ảnh nhuộm FISH NST 18, NST X NST Y 123 Hình 4.17 Hình ảnh nhuộm FISH NST 18, NST X NST Y 124 Hình 4.18 Hình ảnh tinh tử tròn kính hiển vi điện tử x5000 125 Hình 4.19 Hình ảnh tinh tử kéo dài x3000 125 Hình 4.20 Tinh trùng nhuộm Papanicolaou (x1000) 132 Hình 4.21 Mô tinh hoàn tổn thương nặng sau trữ lạnh Glycerol (x200) 134 Hình 4.22 Mô tinh hoàn sau rã đông sử dụng chất bảo quản Glycerol (x400) 134 Hình 4.23 Mô tinh hoàn sau rã đông sử dụng chất bảo quản DMSO (x400) 136 Hình 4.24 Siêu vi thể đầu tinh trùng sau trữ lạnh sử dụng DMSO x5000 136 27 CHƯƠNG I MỞ ĐẦU Theo kết nghiên cứu Việt Nam, tỷ lệ vô sinh chung từ - 13%, vô sinh nam chiếm khoảng 40% [4] Có nhiều nguyên nhân dẫn đến vô sinh nam Trong nguyên nhân tinh trùng tinh dịch (azoospermia) chiếm khoảng 10-20% nguyên nhân khó điều trị Ở Việt Nam, kỹ thuật hỗ trợ sinh sản áp dụng cách có hiệu mang lại hạnh phúc cho hàng ngàn cặp vợ chồng vô sinh Cùng với phát triển chung lĩnh vực hỗ trợ sinh sản giới, kỹ thuật triển khai điều trị cho vô sinh nam vô sinh nữ kỹ thuật IVF, ICSI, kỹ thuật thu tinh trùng cho bệnh nhân tinh trùng tinh dịch (azoospermia) Trong điều trị vô sinh nam, có nhiều tiến bộ, bệnh nhân azoospermia, đặc biệt bệnh nhân azoospermia không tắc phải xin tinh trùng Xuất phát từ sở khoa học trên, tiến hành nghiên cứu phân lập, nuôi cấy biệt hoá tế bào gốc sinh tinh để điều trị vô sinh nam giới Trong phân lập tế bào gốc sinh tinh bước quan trọng, sở cho bước Đã có nhiều tài liệu công bố nhiều phương pháp phân lập tế bào dòng tinh khác Tuy nhiên, phương pháp có ưu nhược điểm khác Ngày nay, với thành tựu lĩnh vực hỗ trợ sinh sản, bệnh nhân azoospermia có tinh trùng thu từ mào tinh hay ống sinh tinh Tuy nhiên, trường hợp tinh trùng ống sinh tinh mào tinh chờ đợi gặp nhiều khó khăn để có đứa 28 Trước phát triển khoa học công nghệ giới, biến thành có thể, nhiều nước giới nghiên cứu phân lập nuôi cấy tế bào dòng tinh Từ nhờ kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm-tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (IVF-ICSI) mở hy vọng cho trường hợp tinh trùng không tắc (non-obstructive azoospermia) Nuôi cấy tế bào dòng tinh (In Vitro culture of Spermatogenesis cells): phương pháp điều trị có nhiều triển vọng tương lai cho bệnh nhân tinh trùng tinh dịch không tắc NOA (Non Obstructive Azoospermia) Hiện giới số tác giả tiến hành nuôi cấy có số thành công bước đầu Để nâng cao hiệu quả, tính an toàn phương pháp này, tiến hành phân lập, nuôi cấy tế bào gốc sinh tinh Kết bước đầu cho thấy tế bào gốc sinh tinh phát triển môi trường nuôi cấy, phân chia giảm nhiễm tạo thành tinh tử tròn, tinh tử kéo dài tinh tử kéo dài Tuy nhiên chất lượng tế bào vấn đề tiếp tục nghiên cứu Trữ lạnh tế bào dòng tinh nói chung tế bào gốc sinh tinh nói riêng giúp cho việc bảo tồn khả sinh sản cho nam giới trước điều trị bệnh ác tính phẫu thuật, hoá chất, tia xạ số bệnh lý mạn tính tiểu đường, rối loạn miễn dịch Ngoài trữ lạnh tinh trùng lấy từ mào tinh mô tinh hoàn giúp cho tránh khỏi sinh thiết tinh hoàn nhiều lần dế gây biến chứng tạo áp lực lớn tâm lý cho bệnh nhân [26] Việc trữ lạnh tinh trùng trở thành thường qui trung tâm hỗ trợ sinh sản, nhiên việc trữ lạnh tế bào gốc sinh tinh nhiều vấn đề tiếp tục nghiên cứu Ðây nghiên cứu có khoa học, tính nhân văn Kết hợp với trình phân lập, nuôi cấy bảo quản tế bào gốc sinh tinh, mở triển vọng cho bệnh nhân tinh trùng tinh dịch có hội có 29 QUI TRÌNH QUY TRÌNH NUÔI CẤY, BIỆT HÓA TẾ BÀO GỐC SINH TINH TỪ ỐNG SINH TINH Trang bị , hóa chất - Trang thiết bị + Phòng vô trùng có máy lọc khí + Buồng thao tác vô trùng + Máy ly tâm + Tủ ấm nuôi cấy Forma + Máy lắc, Giếng nuôi cấy Nunc (loại giếng) + Các dụng cụ thủy tinh: lam kính đồng hồ, lam kính thường - Hóa chất, môi trường, dụng cụ tiêu hao + DMEM, Các amino acid không thiết yếu, Penicillin + Các enzyme: collagenase type 1A IV, Dnase, hyaluronidase, trypsin + EDTA, FBS, Laminin + Giếng nuôi cấy Nunc loại 24 giếng + Các dụng cụ tiêu hao: ống nghiệm, pipet, màng lọc - Các hóa chất: Puregon hay GonalF, testosterone Chuẩn bị bệnh nhân: - Các bệnh nhân lựa chọn người tinh trùng tinh dịch xác định theo tiêu chuẩn WHO (1999) tinh trùng từ mào tinh, xuất tinh ngược dòng - Trước đó, bệnh nhân tiến hành phương pháp PESA hay sinh thiết tinh hoàn, bệnh nhân xác định tinh trùng mào tinh ống sinh tinh - Bệnh nhân có xét nghiệm nhiễm sắc thể bình thường, không phát vi đứt đoạn NST Y Loại trừ bệnh nhân có bệnh cấp tính, có bệnh xã hội, dùng thuốc, hoá chất có ảnh hưởng đến trình sinh tinh, có bệnh nội tiết, bệnh nhân có hội chứng có tế bào Sertoli (Sertoli cell-only syndrome - SCOS) Các bước tiến hành: - Loại bỏ hồng cầu khỏi mô tinh hoàn Mẫu mô rửa PBS lần, cho vào erythrocyte-lysing buffer phút (bao gồm 155mmol/l NH4CL, 10 mmol/l KHCO3 2mmol.l EDTA KOH cho PH 7,2 - Phân lập tế bào dòng tinh: Quá trình tiến hành thông qua bước, sử dụng emzyme bao gồm: collagenase type 1A (1mg/ml) ; Dnase (0,5mg/ml), hyaluronidase 0,5mg/ml - Chuẩn bị màng laminin: Chuẩn bị màng laminin (màng laminin màng giống màng collagen nhằm hỗ trợ tế bào có khả phát triển kiên kết với nhau): lấy 40µl laminin 960µl PBS trộn lẫn với Sau giếng nuôi cấy cho vào 150µl Sau khoảng 20-30 phút dùng pipet hút dịch laminin hút cho vào vùng giếng nuôi cấy nhằm dàn laminin Sau để tất tủ ấm 370C qua đêm - Nuôi cấy tế bào Các tế bào dòng tinh nuôi cấy môi trường Gamate 100 đĩa Nunc Môi trường nuôi cấy bổ sung FSH 50IU/L, testosterone 1µmol/L, nuôi cấy nhiệt độ 320 C, bóng tối, thời gian 21 ngày Đặc biệt phương pháp nuôi cấy này, tế bào dòng tinh nuôi cấy với - Đánh giá tế bào dòng tinh điều kiện nuôi cấy Tế bào gốc sinh sau phân lập, nuôi cấy môi trường tích hợp, tế bào sinh sản phát triển Quan sát hính hiển vi soi hình thái tế bào + Đánh giá số lượng tế bào dòng tinh điều kiện nuôi cấy dựa kích thước tế bào, đặc điểm nhân bào tương Tinh tử tròn (round spermatid): kích thước 8-10µm, nhân tròn, đậm, nằm lệch phía màng, xuất acrosome nằm sát nhân Tinh tử kéo dài (enlongating spermatid): đuôi bắt đầu hình thành, đường kính từ 4-6µm, có hình oval, nhân lồi vùng ngoại vi Tinh tử kéo dài (enlongated spermatid): đuôi hình thành, bào tương giảm thể tích chuyển sau, nhân có hình dạng trưởng thành + Xác định số lượng tế bào: Tại thời điểm nuôi cấy, giếng nuôi cấy đếm 20 vi trường x400, vi trường đếm loại tế bào, sau tính số trung bình loại tế bào cho nhóm nghiên cứu QUI TRÌNH 10 QUY TRÌNH NUÔI CẤY, BIỆT HÓA TẾ BÀO DÒNG TINH TỪ MÀO TINH Trang bị , hóa chất - Trang thiết bị + Phòng vô trùng có máy lọc khí + Buồng thao tác vô trùng + Máy ly tâm + Tủ ấm nuôi cấy Forma + Máy lắc, Giếng nuôi cấy Nunc (loại giếng) + Các dụng cụ thủy tinh: lam kính đồng hồ, lam kính thường - Hóa chất, môi trường, dụng cụ tiêu hao + DMEM, Các amino acid không thiết yếu, Penicillin + EDTA, FBS, Laminin + Giếng nuôi cấy Nunc loại 24 giếng + Các dụng cụ tiêu hao: ống nghiệm, pipet, màng lọc - Các hóa chất: Puregon hay GonalF, testosterone Chuẩn bị bệnh nhân: - Các bệnh nhân lựa chọn người tinh trùng tinh dịch xác định theo tiêu chuẩn WHO (1999) có tinh trùng từ mào tinh, xuất tinh ngược dòng - Trước đó, bệnh nhân tiến hành phương pháp PESA hay sinh thiết tinh hoàn, bệnh nhân xác định có tinh trùng mào tinh 11 - Bệnh nhân có xét nghiệm nhiễm sắc thể bình thường, không phát vi đứt đoạn NST Y Loại trừ bệnh nhân có bệnh cấp tính, có bệnh xã hội, dùng thuốc, hoá chất có ảnh hưởng đến trình sinh tinh, có bệnh nội tiết Các bước tiến hành: - Lấy tế bào dòng tinh từ mào tinh chọc hút qua da: Sau vệ sinh chỗ, bệnh nhân tiến hành gây tê thừng tinh lidocain 1% Tiếp theo, mào tinh hoàn xác định cố định ngón ngón trỏ bàn tay Dùng bơm tiêm 1ml với kim có kích thước 19-gauge hút dịch mào tinh Dịch thu từ mào tinh quan sát tìm tinh trùng kính hiển vi quang học vật kính 10X 40X Phương pháp tiến hành bệnh nhân azoospermia có tinh trùng mào tinh hoàn lượng tinh trùng thu đủ số lượng chất lượng - Loại bỏ hồng cầu khỏi mô tinh hoàn Mẫu mô rửa PBS lần, cho vào erythrocyte-lysing buffer phút (bao gồm 155mmol/l NH4CL, 10 mmol/l KHCO3 2mmol.l EDTA KOH cho PH 7,2 - Nuôi cấy tế bào Các tế bào từ mào tinh nuôi cấy môi trường Gamete 100, nhiệt độ từ 30-320C, 5% CO2, bổ sung 24 U/l FSH, µmol/l testosterone, thời gian nuôi cấy 36 - Đánh giá tế bào dòng tinh điều kiện nuôi cấy Tế bào gốc sinh sau phân lập, nuôi cấy môi trường quan sát hính hiển vi soi hình thái tế bào theo thời điểm định 12 + Đánh giá số lượng tế bào dòng tinh điều kiện nuôi cấy dựa kích thước tế bào, đặc điểm nhân bào tương Tinh tử tròn (round spermatid): kích thước 8-10µm, nhân tròn, đậm, nằm lệch phía màng, xuất acrosome nằm sát nhân Tinh tử kéo dài (enlongating spermatid): đuôi bắt đầu hình thành, đường kính từ 4-6µm, có hình oval, nhân lồi vùng ngoại vi Tinh tử kéo dài (enlongated spermatid): đuôi hình thành, bào tương giảm thể tích chuyển sau, nhân có hình dạng trưởng thành + Xác định số lượng tế bào: Tại thời điểm nuôi cấy, giếng nuôi cấy đếm 20 vi trường x400, vi trường đếm loại tế bào, sau tính số trung bình loại tế bào cho nhóm nghiên cứu 13 QUI TRÌNH NGHIÊN CỨU TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ TẾ BÀO GỐC SINH TINH VÀ TINH TRÙNG SAU NUÔI CẤY Hóa chất thiết bị sử dụng nghiên cứu 1.1 Thiết bị - Tủ ấm 37 0C, 6% CO2 (Forma, Mỹ) - Kính hiển vi soi ngược có gắn hệ thống kính tương phản Hoffman, máy ảnh Canon vi thao tác Narishige (Olympus IX 70, Nhật) - Kính hiển vi soi (Olympus 30, Nhật) - Hood vô trùng (Sanyo, Nhật) - Bàn nhiệt (Kitazato, Nhật) - IVF Chamber (Emcell, Úc) - Máy ly tâm lạnh (Mỹ) - Micropipet, pipette pump - Hộp chứa ni tơ lỏng, hộp chứa dụng cụ chứa noãn (cassette), đồng hồ bấm giờ, tank lưu trữ - Dụng cụ tiêu hao: hộp cấy nunc, pipette 1ml, 5ml, 10ml, đĩa petri đường kính 30mm, 60mm, 100mm, pipette pasteur, kim thực kỹ thuật ICSI 1.2 Hóa chất - Môi trường nuôi cấy: collagenase Type I (SIGMA Chemical Co); DNase I(Gibco); soybean trypsin inhibitor (Gibco), hyaluronidase (Sigma) môi trường PBS; huyết fetal bovine serum (Gibco); acid amin không cần thiết (Gibco) 14 - Thuốc nội tiết: Gonal-F 75 IU (Serono, Thụy Sỹ), Pregnyl 1000 IU (Organon, Hà Lan) - Môi trường nuôi phôi chuột: M16, Bovine Serum Albumin (Sigma, Mỹ) - Môi trường rửa giao tử: G-MOPS (Vitrolife, Thụy Điển) - Môi trường nuôi cấy phôi: G-IVF, G1 pus, G2 plus (Vitrolife, Thụy Điển) - PVP, Hyase, OVOIL (Vitrolife, Thụy Điển) - Các hóa chất: hóa chất dùng cho hiển vi quang học hiển vi điện tử, Gamete 100, dd IVF, Puregon, testosterone, collagenase IV Các hóa chất sử dụng, thiết bị đạt tiêu chuẩn kỹ thuật, đại Đánh giá tế bào dòng tinh 2.1 Đánh giá hình thái kính hiển vi quang học Tế bào gốc sinh sau phân lập, nuôi cấy môi trường tích hợp, tế bào sinh sản phát triển Quan sát hính hiển vi soi hình thái tế bào Đánh giá số lượng tế bào dòng tinh điều kiện nuôi cấy: + Xác định tế bào dòng tinh dựa kích thước tế bào, đặc điểm nhân bào tương - Tinh tử tròn (round spermatid): kích thước 8-10µm, nhân tròn, đậm, nằm lệch phía màng, xuất acrosome nằm sát nhân - Tinh tử kéo dài (enlongating spermatid): đuôi bắt đầu hình thành, đường kính từ 4-6µm, có hình oval, nhân lồi vùng ngoại vi - Tinh tử kéo dài (enlongated spermatid): đuôi hình thành, bào tương giảm thể tích chuyển sau, nhân có hình dạng trưởng thành + Xác định số lượng tế bào: 15 Tại thời điểm nuôi cấy, giếng nuôi cấy đếm 20 vi trường x400, vi trường đếm loại tế bào, sau tính số trung bình loại tế bào cho nhóm nghiên - Hình thái, kích thước tế bào, hình thái cấu trúc nhân, cực đầu kính hiển vi quang học - Sự biến đổi số lượng loại tế bào sau nuôi cấy: nuôi cấy tốt, sau trình nuôi cấy số lượng tế bào tăng từ 2-5 lần 2.2 Đánh giá hình thái kính kiển vi điện tử : - Bước 1: Vật phẩm cố định dung dịch glutaraldehyt 4% dung dịch đệm cacodylat thời gian 40 C - Bước 2: Rửa dung dịch đệm cacodilat lần sau cố định mẫu dung dịch cacodylat để qua đêm nhiệt độ 40 C - Bước 3: Thấm khô mẫu vật cố định dung dịch osmic 2% 60 phút - Bước 4: Rửa dung dịch Palade lần lần 2-3 phút - Bước 5: Rửa nước cồn có nồng độ từ thấp đến cao theo thứ tự : Cồn 300 30 phút Cồn 400 30 phút Cồn 700 30 phút Cồn 900 30 phút Cồn 1000 lần 30 phút Cồn 1000 lần 30 phút Cồn 1000 lần - Bước : Chuyển mẫu vật qua cồn + Propylen oxyt tỷ lệ 1/ 15 - Bước : Để mẫu vật propylen oxyt 15 phút - Bước : Chuyển propylen oxyt + hỗn hợp Epon 812 tỷ lệ 1/1 16 - Bước : Cho mẫu vật vào hỗn dịch đúc để nhiệt độ phòng thời gian 24 - Bước 10 : Cho mẫu vật vào khuôn đúc, đổ hỗn dịch vào khuôn để tủ ấm 300C thời gian 24 giờ, sau 450C thời gian 24 giờ, sau lại 600C 72 Các block sau chuyển đúc theo quy trình, cắt tiêu máy Powertome USA độ dày lát cắt 500 – 700A0 Mỗi block làm tiêu Nhuộm tiêu uranyl acetate 10% citrat chì 4% Đọc tiêu kính hiển vi truyền qua JEOL - 1011 (Nhật)có độ phân giải 2A0, điện áp 100kv - Cấu trúc đầu, cổ, đuôi kính hiển vi điện tử Hình ảnh phóng đại 3-10.000 lần cho phép quan sát, đánh giá phân chia phát triển tế bào gốc sinh tinh Tinh tử tròn điển hình phát triển môi trường nuôi cấy, có nhân tụ đặc phần đầu, túi cực đầu xuất 2.3 Đánh giá khả thụ tinh phương pháp ICSI qua hình thái phôi Quan sát hình thái phôi kính hiển vi đảo ngược Olympus IX 70 (Nhật), độ phóng đại 200 lần Phôi ngày ngày phân loại theo tiêu chuẩn phân loại hình thái phôi Andres Salumets (2001) [8] Theo hệ thống phân loại này, phôi chia thành độ dựa vào đặc điểm số phôi bào, độ đồng phôi bào tỷ lệ mảnh vỡ bào tương so với thể tích toàn phôi: - Phôi độ 4: phôi ngày có phôi bào đồng đều, phôi ngày có 6-8 phôi bào đồng đều, có (không đáng kể) mảnh vỡ bào tương - Phôi độ 3: phôi có số phôi bào không đồng và/hoặc có tỷ lệ mảnh vỡ bào tương < 20% thể tích phôi 17 - Phôi độ 2: phôi có tỷ lệ mảnh vỡ bào tương từ 20% đến < 50% thể tích phôi - Phôi độ 1: phôi có tỷ lệ mảnh vỡ bào tương ≥ 50% thể tích phôi Trong công trình nghiên cứu đánh giá khả thụ tinh tinh tử kéo dài nuôi cấy bệnh nhân chẩn đoán azoospermia có tinh tử tròn lòng ống sinh tinh Kết khả thụ tinh tinh tử sau nuôi cấy 64% Kết phát triển phôi ngày với tỉ lệ hình thái phôi bình thường 66,02% Chất lượng phát triển phôi ổn định, tỉ lệ hình thái phôi bình thường 49,11% 2.4 Nhuộm FISH tế bào dòng tinh FISH (Fluorescence in situ hybridisation) kỹ thuật cho phép nhìn thấy đoạn gen tế bào, lai ghép mồi với DNA tế bào phát kính hiển vi huỳnh quang Trong vòng ngày đầu trình nuôi cấy có tinh nguyên bào tinh bào 1, tế bào có 46 NST thân NST giới tính XY Trên kính hiển vi huỳnh quang tế bào phân biệt NST 18 bắt màu xanh lam, NST giới tính X (màu xanh thẫm) Y ( màu hồng vàng) * Kỹ thuật thu thập số liệu - Trong trình nuôi cấy, theo dõi phát triển tế bào gốc sinh tinh, đếm số lượng tế bào 20 vi trường lấy trung bình cho loại tế bào - Chụp ảnh tế bào gốc sinh tinh trước thời gian nuôi cấy, phôi 1-3 ngày độ phóng đại 100, 200 400 lần qua kính hiển vi đảo ngược Olympus IX 70 có gắn máy ảnh Canon (thời gian chụp ảnh khống chế phút) 18 - Nhuộm GPF xác định tế bào gốc sinh tinh - Nhuộm FISH xác định phân chia giảm nhiễm tế bào gốc sinh tinh - Làm tiêu mô học kính hiển vi điện tử 19 QUI TRÌNH NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH BẢO QUẢN CÁC TẾ BÀO GỐC SINH TINH Hóa chất thiết bị sử dụng nghiên cứu - Thiết bị: - Tủ ấm 37oC, 6% CO2 (Forma, Mỹ) - Kính hiển vi quang học - Kính hiển vi điện tử truyền qua JEOL - 1011, độ phân giải 2A0, điện áp 100KV - Bình chứa Ni tơ lỏng, máy hạ nhiệt độ Nicool 10 - Máy hạ nhiệt độ - Dụng cụ tiêu hao: típ bảo quản Nunc 1,8ml; đĩa pettri 30mm, - Hóa chất: - Glycerol (Sperm Freeze - Fertipro, Bỉ) - DMSO (D2650; Sigma; Đức) - ASP (Vitrolife - Thuỵ Điển) - G IVF (Vitrolife - Thuỵ Điển - Các hoá chất cần thiết cho nhuộm mô học Các bước tiến hành 2.1 Qui trình trữ lạnh tinh trùng từ mào tinh - Chọc hút mào tinh lấy mẫu tinh trùng - Xác định mật độ, độ di động, hình thái, tỉ lệ sống 20 - Cho mẫu tinh trùng cho vào tube ml, nhỏ giọt chất bảo quản Sperm Freeze (FertiPro - Bỉ) tích tương đương thể tích tinh trùng - Cho vào ống Nunc 1,8ml đánh mã số, để nhiệt độ phòng 10- 15 phút trước đưa vào trữ lạnh máy hạ nhiệt độ Nicool 10 - Hạ nhiệt độ: + Từ nhiệt độ phòng 24oC xuống -10oC: phút + Từ - 10oC xuống - 120oC: 5,5oC/ phút x 20 phút Nhúng vào ni tơ lỏng phút gắn vào ngăn giữ bảo quản bình ni tơ lỏng - Rã đông mẫu tinh trùng thu nhận từ mào tinh: + Tube trữ lạnh lấy để nhiệt độ phòng 10 phút + Lọc rửa + Kiểm tra mã số, đánh giá độ di động, tỉ lệ sống, hình thái tinh trùng + Nuôi cấy mẫu tinh trùng sau rã đông 2 Qui trình trữ lạnh mô tinh hoàn - Mẫu mô tinh hoàn rửa PBS cho hết máu bám chuyển vào tube bảo quản Nunc 1,8ml nhỏ giọt chất bảo quản lạnh (DMSO), để nhiệt độ 4oC 15 phút - Hạ nhiệt độ: Bắt đầu 40C Tốc độ -10C/ phút đến 00C Giữ 00C phút Tốc độ -0,50C/phút đến -80C Giữ -80C 15 phút Tốc độ -0,50C/phút đến -400C 21 Giữ Trong 10 phút Tốc độ -70C/phút đến -800C Ni tơ lỏng -1960C - Rã đông mẫu mô tinh hoàn: + Tube trữ mô trữ lạnh lấy khỏi bình ni tơ lỏng để nhiệt độ phòng 10 - 15 phút cho tan băng + Chuyển mẫu mô sang đĩa Pettri có chứa sẵn môi trường nuôi cấy, đĩa 10 phút + Phân lập tế bào gốc sinh tinh + Lọc rửa, loại bỏ tạp chất DMSO + Đánh hình thái, mật độ tế bào + Nuôi cấy tế bào gốc sinh tinh 22 [...]... giá tế bào gốc sinh tinh và tinh trùng được biệt hoá từ tế bào gốc sinh tinh Mục tiêu cụ thể là xây dựng các qui trình và tiêu chí đánh giá tế bào như sau: 1 Qui trình thu gom, phân lập tế bào gốc sinh tinh từ ống sinh tinh, 2 Qui trình thu gom, phân lập các tế bào dòng tinh từ mào tinh, 3 Qui trình nuôi cấy, biệt hóa tế bào gốc sinh tinh từ ống sinh tinh, 4 Qui trình nuôi cấy, biệt hóa các tế bào. .. mình Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài với 3 mục tiêu như sau: 1 Xây dựng qui trình phân lập tế bào gốc sinh tinh từ ống sinh tinh và các tế bào dòng tinh từ mào tinh ở bệnh nhân nam giới vô sinh do không có tinh trùng, 2 Xây dựng qui trình bảo quản, nuôi cấy và biệt hoá tế bào gốc sinh tinh từ ống sinh tinh và các tế bào dòng tinh từ mào tinh thành tinh trùng, 3 Xây dựng... rốn và đặc biệt là trong các ống sinh tinh làm nguồn tế bào có nhiều ứng dụng Những tế bào này có thể biệt hoá thành tế bào sụn, tế bào tạo mỡ, tế bào tạo xương, nguyên bào cơ, tế bào cơ tim, tế bào thần kinh đệm hình sao, tế bào gân và tinh tử, thậm chí tinh trùng trong điều kiện in vitro và trải qua quá trình biệt hoá in vivo và điều đó làm cho các tế bào gốc này được coi là những nguồn tế bào đầy triển... Ống sinh tinh gồm các thành phần sau: 32 + Lớp áo xơ bao phủ ống sinh tinh gồm vài lớp nguyên bào sợi và nguyên bào sợi - cơ + Thành ống tạo nên bởi 2 loại tế bào: tế bào Sertoli và các tế bào dòng tinh, các tế bào dòng tinh xếp thành 4 - 8 lớp kể từ màng đáy cho đến lòng ống sinh tinh, bao gồm: tinh nguyên bào, tinh bào I, tinh bào II, tinh tử và tinh trùng * Các tế bào dòng tinh Tinh nguyên bào nằm... quan sinh dục trong giai đoạn phôi thai Đặc biệt, tế bào Sertoli có vai trò rất lớn quyết định đến quá trình sinh tinh của tinh hoàn 2.1.3 Quá trình sinh tinh Quá trình sinh tinh trải qua 3 giai đoạn sau: + Sinh tinh bào: là quá trình tinh nguyên bào phân chia, tạo ra tinh bào + Giảm phân: sản xuất ra các tế bào tiền tinh trùng hay còn gọi là tinh tử + Tạo tinh trùng: là quá trình biệt hoá tiền tinh. .. bào gốc sinh tinh từ ống sinh tinh, 4 Qui trình nuôi cấy, biệt hóa các tế bào dòng tinh từ mào tinh, 5 Tiêu chuẩn đánh giá tế bào gốc sinh tinh và các tế bào dòng tinh sau nuôi cấy, 6 Qui trình bảo quản các tế bào gốc sinh tinh 30 CHƯƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về phân lập tế bào dòng tinh 2.1.1 Vô sinh Vô sinh là tình trạng một cặp vợ chồng không có khả năng có thai sau 1 năm quan hệ vợ... Đặc biệt việc phân lập và nuôi cấy các tế bào gốc sinh tinh sẽ mở ra hy vọng mới cho các bệnh nhân azoospermia không do tắc và các bệnh nhân ung thư nam trẻ tuổi sau điều trị hóa chất và tia xạ Ở người và động vật nhóm linh trưởng, Tinh nguyên bào có 2 loại là tinh nguyên bào A và tinh nguyên bào B Tinh nguyên bào A phân chia để tạo thành tinh nguyên bào Apale và tinh nguyên bào Adark Tinh nguyên bào. .. chức Y tế thế giới (WHO) đã tiến hành nghiên cứu và xác định: trong số bệnh nhân vô sinh có 20% nguyên nhân do nam giới, 38% do nữ giới và 27% do cả nam và nữ, 15% không rõ nguyên nhân Như vậy, trên thế giới có hàng triệu bệnh nhân có nhu cầu điều trị vô sinh, trong số đó vô sinh nam chiếm một tỷ lệ rất lớn Có rất nhiều nguyên nhân dẫn đến vô sinh nam Trong đó, vô sinh do không có tinh trùng trong tinh. .. nuôi cấy tế bào Sertoli với các tế bào dòng tinh đã chỉ ra rằng, các yếu tố có thể trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua các tế bào sinh dưỡng đồng nuôi cấy để điều chỉnh số lượng, sự phát triển và tồn tại của tế các tế bào dòng tinh (Tesarik, 2001) Các nuôi cấy tế bào dòng tinh lên lớp tế bào sinh dưỡng phù hợp (đặc biệt là tế bào Sertoli) cho thấy các quá trình tế bào và đặc điểm cấu trúc bên trong... * Về số loại tế bào nuôi cấy, có nhiều phương pháp nuôi cấy khác nhau như: + Chỉ nuôi cấy duy nhất 1 loại tế bào dòng tinh trong môi trường nuôi cấy như Sousa và CS, 2001 [97] 54 + Nuôi cấy nhiều loại tế bào dòng tinh khác nhau trong cùng một môi trường nuôi cấy như Tesarik và CS, 1998 [108] + Nuôi cấy tế bào dòng tinh với tế bào thân như: Nuôi cấy các tế bào dòng tinh với các tế bào thân (somatic cell) ... gc sinh tinh t ng sinh tinh, Qui trỡnh thu gom, phõn lp cỏc t bo dũng tinh t mo tinh, Qui trỡnh nuụi cy, bit húa t bo gc sinh tinh t ng sinh tinh, Qui trỡnh nuụi cy, bit húa cỏc t bo dũng tinh. .. sinh tinh v cỏc t bo dũng tinh t mo tinh bnh nhõn nam gii vụ sinh khụng cú tinh trựng, Xõy dng qui trỡnh bo qun, nuụi cy v bit hoỏ t bo gc sinh tinh t ng sinh tinh v cỏc t bo dũng tinh t mo tinh. .. trng hp vụ sinh nam gii, tr nhng trng hp hon ton khụng cú tinh trựng ng sinh tinh ICSI cú th thc hin vi tinh trựng t tinh dch, tinh trựng hỳt t mo tinh hay tinh trựng sinh thit t tinh hon Hin