Nghiên cứu biểu hiện protein insulin glagine tái tổ hợp từ tế bào vi khuẩn escherichia coli

BỘ CƠNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP THÀNH PHĨ HỒ CHÍ MINH ĐÀO ANH KIỆT NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN INSULIN GLARGINE TÁI TÔ HỢP TỪ TẾ BÀO VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã ngành: 8420201 LUẬN VĂN THẠC sĩ THÀNH PHỔ HỊ CHÍ MINH NĂM 2023 Cơng trình hồn thành Trường Đại học Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh Người hướng dẫn khoa học: TS.Đồn Chính Chung & TS Bùi Hồng Qn Luận văn thạc sĩ bảo vệ Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh ngày 06 tháng 10 năm 2023 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: Tiến sĩ Nguyễn Thị Kim Anh - Chủ tịch Hội đồng Tiến sĩ Lao Đức Thuận - Phản biện Tiến sĩ Phạm Tấn Việt - Phản biện Tiến sĩ Nguyễn Minh Nam - ủy viên Tiến sĩ Trần Thị Huyền - Thư ký (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ) CHỦ TỊCH HỘI ĐỊNG VIỆN TRƯỞNG VIỆN CƠNG NGHỆ SINH HỌC VÃ THựC PHẨM BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP THẢNH PHĨ HỊ CHỈ MINH CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC sĩ Họ tên học viên: Đào Anh Kiệt MSHV: 20125621 Ngày, tháng, năm sinh: 03/03/1998 Nơi sinh: TP.HCM Ngành: Công nghệ Sinh học Mã ngành: 8420201 I TÊN ĐỀ TÃI: Nghiên cứu biểu protein Insulin Glargine tái tồ hợp từ tế bào vi khuẩn E Coỉi NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: -Tổng hợp Gen mã hóa Insulin Glargine tạo dịng vector tái tổ hợp mang gen mã hóa Insulin Glargine (pENanogen-Insulin Glargine) -Nghiên cứu tối ưu hóa qui trình ni cấy tế bào E coỉi BL 2//DEJ/'P EN anogen-Insulin Glargine biểu protein Insulin Glargine quy mô phịng thí nghiệm -Kiểm tra, đánh giá sơ chất lượng protein Insulin Glargine II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 30/11/2022 III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 6/10/2023 IV NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS Đồn Chính Chung & TS Bùi Hồng Quân Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng 10 năm 2023 NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM Bộ MÔN ĐÀO TẠO (Họ tên chữ ký) (Họ tên chữ ký) Đồn Chính Chung NGƯỜI HƯỚNG DẪN (Họ tên chữ ký) Bùi Hồng Quân VIỆN TRƯỞNG VIỆN CÔNG NGHẸ SINH HỌC VÀ THựC PHẢM LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Đồn Chính Chung Thầy TS Bùi Hồng Quân tận tình hướng dẫn hỗ trợ suốt trình thực luận văn tốt nghiệp tơi Luận văn tiến hành phịng nghiên cứu phát triển, thuộc Xưởng Nguyên liệu Công ty Dược Nanogen Tôi chân thành cảm ơn TGĐ TS Hồ Nhân với đồng nghiệp phòng nghiên cứu phát triển, thành viên ban quản lý Công ty Dược Nanogen giúp tạo điều kiện thuận lợi cho trình thực đề tài Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến quý Thầy Cô giảng dạy truyền đạt nguồn cảm hứng cho suốt thời gian học tập Trường Đại học Công Nghiệp TP.HCM Nhờ dẫn quý Thầy Cô, em trang bị thêm kiến thức mở rộng khả tư duy, khám phá suốt trình nghiên cứu thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn tói tất bạn bè đồng nghiệp, người bên tôi, động viên khích lệ q trình hồn thành luận văn tốt nghiệp Cuối cùng, xin tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình ni dưỡng ln suốt quãng thời gian TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC sĩ Insulin Glargine, analog insulin, dạng insulin tác dụng kéo dài sử dụng để điều trị tăng đường huyết bệnh tiểu đường loại loại gây Trong nghiên cứu này, trình tự nucleotide gen Insulin Glargine tham khảo từ ngân hànggen GENBANK(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AWO14628.1 ) Sau tạo dòng vector tái tổ hợp pENanogen mang gen mã hóa protein Insulin Glargine vào té bào E COỈỈBL21 (DE3), tiến hành lên men chủng K coỉi cảm ứng biểu protein Insulin Glargine Ma trận Placket-Burman Phưong pháp đáp ứng bề mặt Phưong án cấu trúc có tâm sử dụng để tối ưu hóa điều kiện lên men cảm ứng biểu nhằm thu lượng sinh khối lượng protein cao Số liệu được xử lý phần mem Design Expert 13 Điều kiện tối ưu hóa xác định: nồng độ IPTG (0.987mM), nhiệt độ cảm ứng (25°C) pH môi trường lên men (5.5) Mơi trường điều kiện tối ưu hóa sử dụng cho lên men, biểu ỏ quy mô pilot dung tích 20L lặp lại lần Kết thực nghiệm so sánh với dự đốn mơ hình Phân phối student trắc nghiệm t-test với độ tin cậy p > 0,05 Kết cho thấy khác biêt mơ hình thực nghiệm dự đốn mơ hình tối ưu Q trình ly giải tinh protein Insulin Glargine thu nhận từ trình lên men gửi mẫu thực dựa theo qui trình chuẩn từ cơng ty CNSH Dược Nanogen Sản phẩm protein Insulin Glargine sau tinh có nồng độ tưong đưong (— 0,31 g/L) so với sản phẩm từ nghiên cứu Satish cộng (2021) (0,3 g/L) cao hon sản phẩm trước từ công ty CNSH Dược Nanogen (0,2 g/L) Protein IG thu đáp ứng thành công tiêu chuẩn nguyên liệu đặc tính, độ tạp, định tính đánh giá với phưong pháp chạy HPLC hoạt tính làm giảm nồng độ glucose máu Kết từ thí nghiệm trình bày nghiên cứu 11 ABSTRACT Insulin Glargine, an insulin analog, is a long-acting form of insulin used to treat hyperglycemia caused by type and type diabetes In this study, the nucleotide sequences of the Insulin Glargine Gen were referenced from the GENBANK Gen bank (https://www.ncbi.nlm.nih.gOv/protein/AWO14628.l ) After creating the recombinant vector pENanogen carrying the Gen encoding the IG protein into E coll BL2Ỉ (DE3) cells, this E coll strain was fermented and the IG protein expression was induced Placket-Burman matrix and Response Surface Method - Centered structural scheme were used to optimize the fermentation and expression induction conditions to obtain the highest biomass and protein content Data were processed using Design Expert 13 software Optimization conditions were determined: IPTG concentration (0.987mM), induction temperature (25°C) and fermentation medium pH (5.5) Optimized media and conditions were used for the fermentation, expressed at a pilot scale of 20L and replicated three times The experimental results are compared with the prediction of the model by student t-test distribution with confidence p > 0,05 The results show that there is no difference between the experimental model and the prediction of the optimal model The process of lysing and purifying the insulin Glargine protein obtained from the fermentation process was sent to the sample and performed according to the standard procedure from Nanogen Pharmaceutical Biotechnology The protein product Insulin Glargine after purification has an equivalent concentration (~ 0.31 g/L) compared to the product from the study of Satish et al (2021) (0.3 g/L) and higher than the previous product from Biotechnology Pharmaceutical Company Nanogen (0.2 g/L) The Insulin Glargine protein product after purification has a higher concentration than the product from the study by Satish et al and the previous product from the pharmaceutical biotechnology company Nanogen The obtained IG protein successfully met the raw material criteria for characterization, purity, and quality as assessed with HPLC run method and blood glucose lowering activity The results from these experiments are presented in this study iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu từ thân hỗ trợ công ty CNSH Dược Nanogen Các kết nghiên cứu kết luận đề tài cam kết trung thực, khơng có hình thức chép từ nguồn tài liệu Các nguồn tài liệu tham khảo trích dẫn quy định, đảm bảo tính xác minh bạch Học viên (Chữ ký) Đào Anh Kỉệt IV MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC sĩ ii ABSTRACT iii LỜI CAM ĐOAN iv MỤC LỤC V DANH MỤC HÌNH ẢNH viii DANH MỤC BẢNG BIỂU X DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT xi MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung bệnh đái tháo đường 1.1.1 Tình hình bệnh đái tháo đường giớivà Việt Nam 1.1.2 Thuốc điều trị ĐTĐ 1.2 Insulin Glargine 1.2.1 Nguồn gốc 1.2.2 Chức sinh học Insulin Glargine 1.3 Tổng quan tạo dòng biểu protein ngoạilai E Coli 1.3.1 Tổng quan tạo dòng hệ thống biểu trongtế bào E coỉi 1.3.2 Biểu protein ngoại lai E coli 1.4 Phưong pháp sàng lọc tối ưu hóa 11 1.4.1 Ma trận Plackett-Burman 11 1.4.2 Phưong pháp đáp ứng bề mặt - thiết kế cấu trúccó tâm (RSM-CCD) 12 1.5 Tình hình nghiên cứu nước 12 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 14 V 2.1 Vật liệu 14 2.1.1 Chủng vi sinh vật 14 2.1.2 Vector 14 2.1.3 Gen mục tiêu 14 2.1.4 Các thang chuẩn dùng cho điện di 16 2.1.5 Hóa chất sử dụng nghiên cứu 16 2.1.6 Dụng cụ thiết bị sử dụng nghiêncứu 18 2.1.7 Động vật thí nghiệm 19 2.2 Nội dung phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Tạo dòng vector biểu protein InsulineGlargine 19 2.2.2 Tạo dòng té bào biểu 21 2.2.3 Tối ưu hóa điều kiện lên men tế bào E.coli BL21 (DE3) biểu protein Insulin Glargine quy mơ phịng thí nghiệm 23 2.2.4 Lên men E coli BL2ỉ(DE3)/pENanogen-Insulin Glargine quy mô pilot với điều kiện tối ưu 28 2.2.5 Tinh protein Insulin Glargine từ tế bào E coli BL2l(DE3)/pENanogenIG 28 2.2.6 Đánh giá chất lượng sản phẩm 28 2.2.7 Xử lý số liệu thống kê 34 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 35 3.1 Tạo dòng vector biểu protein Insuline Glargine 35 3.1.1 Chuẩn bị Gen cắt mở vòng vector PENanogen 35 3.1.2 Kết tạo dòng tế bào chọn lọc (E colỉ TOP ỉ OF) 36 VI 3.2 Tạo dòng E.coỉi BL21 fDEJJ/pENanogen-Insulin Glargine biểu protein Insulin Glargine 39 3.2.1 Tạo dòng E.coli BL21(DE3) chứa vector tái tổ hop pENanogen-IG 39 3.2.2 Cảm ứng biểu protein Insulin Glargine dòng E coỉỉ BL21 (E)E3)/pENanogen-IG 40 3.3 Tối ưu hóa điều kiện lên men tế bào E coỉi BL2Ỉ (DE3) biểu protein Insulin Glargine quy mơ phịng thí nghiệm 41 3.3.1 Sàng lọc điều kiện lên men E coli BL21(DE3) biểu protein Insulin Glargine ma trận Plackett - Burman 41 3.3.2 Tối ưu hóa điều kiện lên men thu sinh khối E.coỉi BL21 (DE3)/pENanogen- Insuỉin Gỉargine protein Insulin Glargine ma trận RSM - CCD 46 3.4 Lên men E coỉi BL2ỉ(DE3)ịpENanogen-Insulin Glargine quy mô pilot với điều kiện tối ưu 47 3.5 Đánh giá sơ chất lượng protein Insulin Glargine 48 3.5.1 Đặc tính 48 3.5.2 Độ tạp 49 3.5.3 Định tính 51 3.5.4 Hoạt tính 57 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 4.1 Kết luận 60 4.2 Kiến nghị 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 PHỤ LỤC 66 LÝ LỊCH TRÍCH NGANG CỦA HỌC VIÊN 73 vii