VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài NGHIÊN CỬU VÀ so SÁNH ĐẶC ĐIẾM SINH HÓA CỦA COLLAGENASE TÁI TÓ HỌP TỪ CHỦNG Lysinibacillus sphaericus Người hướng dẫn TS Bạch.
VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CỬU VÀ so SÁNH ĐẶC ĐIẾM SINH HÓA CỦA COLLAGENASE TÁI TÓ HỌP TỪ CHỦNG Lysinibacillus sphaericus : TS Bạch Thị Mai Hoa Người hướng dẫn Sinh viên : Nguyễn Thị Hà Lớp : 1302 Hà Nội-2017 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở LỜI CẢM ƠN Để thực tốt đề tài nghiên cứu này, nhận nhiều quan tâm giúp đỡ tận tình từ phía gia đinh, thầy bạn bè Trước hết xin gửi lời càm ơn tới TS Bạch Thị Mai Hoa người hướng dẫn chính, người thầy tận tâm định hướng nghiên cứu, trực tiếp hướng dần chi bào tận tình cho tơi suốt thời gian học tập nghiên cứu Tôi mong muốn gửi lời càm ơn chân thành tới cán bộ, nhân viên, sinh viên thực tập phịng Cơng nghệ Lên men, Viện Cơng nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu đề tài Tơi xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học, Viện đại học Mờ Hà Nội giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập thực khóa luận tốt nghiệp Cuối xin cảm ơn người thân gia đình, cảm ơn anh chị em, bạn bồ ln động viên, khích lệ tạo động lực cho tơi suốt q trình thực khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, ngày 15 tháng năm 2017 Sinh viên Nguyền Thị Hà Nguyễn Thị Hà 13-02 Khoa Cơng nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở MỤC LỤC ĐẶT VẨN ĐỀ TÔNG QUAN 1.1 Giới thiệu vê Lysinibacilỉus Lysinihaciỉlus sphaericus 1.1.1 Lysinibacillus 1.1.2 Lysinibaciỉlus sphaericus 1.2 Giới thiệu collagen 1.2.1 Collagen 1.2.2 ửng dụng collagen 1.3 Collagenase 12 1.3.1 Đặc diêm cúa collagenase 12 1.3.2 Những nghiên cứu Việt Nam giới collagenase 14 1.3.3 ứng dụng collagenase 17 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 19 2.1 Vật liệu 19 2.1.1 Chúng vi sinh vật 19 2.1.2 Hóa chất sử dụng 19 2.1.3 Môi trường 20 2.1.4 Các thiết bị sừ dụng nghiên cứu 21 2.2 Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Nghiên cứu đặc điếm sinh học cùa chủng tái tổ hợp 21 2.2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ, pH thời gian lên khả sinh tổng hợp collagenase chủng tái tổ hợp 22 2.2.3 Tách DNA plasmid 22 2.2.4 Biến nạp E coli phương pháp sốc nhiệt 23 2.2.5 Phương pháp khuếch đại gen col 23 2.2.6 Tinh collagenase tái tổ hợp 24 2.2.7 Phương pháp định hoạt tính enzyme 25 Nguyễn Thị Hà 13-02 Khoa Cơng nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở 2.2.8 Phương pháp zymogram gelatine 27 2.2.9 Phương pháp sắc ký protein polyacrylamid 27 CHƯƠNG 3: KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Đặc điểm sinh học chủng tái tổ hợp 29 3.2 Nghiên cứu điều kiện ni cấy thích hợp đế thu nhận collagenase từ chủng vi khuẩn BL21(DE3) pIN III ompA- col 31 3.2.1 Ánh hưởng cùa pH 31 3.2.2 Ảnh hưởng cúa nhiệt độ lên hoạt động collagenase 32 3.2.3 Động thái sinh tồng hợp collagenase chúng vi khuẩn 34 3.3 Tinh collagenase 36 3.4 Nghiên cứu đặc điểm hóa sinh collagenase tái tổ hợp 41 3.5 Nghiên cứu ânh hướng sổ yếu to pH, nhiệt độ, ion kim loại chất ức che lên hoạt động enzyme tinh 42 3.5.1 Ảnh hưởng pH 42 3.5.2 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt động collagenase 43 3.5.3 Ánh hưởng cúa ion kim loại chất ức chế lên hoạt động collagenase tinh .44 KÉT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 Kết Luận 46 Kiến Nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 PHỤ LỤC 52 Nguyễn Thị Hà 13-02 Khoa Cơng nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Một số collagenase từ nguồn khác nghiên cứu 13 Bàng 2: Danh mục xuất xứ hóa chất sử dụng nghiên cứu 19 Báng 3: Danh mục thiết bị sừ dụng nghiên cứu 21 Bảng 4: Ảnh hưởng pH lên khà sinh trưởng sinh tổng hợp collagenase cúa chúng vi khuẩn BL21(DE3) pIN III ompA- col 32 Bàng 5: Ảnh hưởng nhiệt độ lên sinh trưởng tổng họp collagenase chủng vi khuẩn BL21(DE3) pIN III ompA- col 33 Báng 6: Giá trị Km V max cúa collagenase chất khác 42 Nguyễn Thị Hà 13-02 Khoa Công nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở DANH MỤC HÌNH Hình 1: Hình ánh nhuộm Gram cùa L Sphaericus Hình 2: cấu trúc collagen Hình 3: cấu trúc tropocollagen Hình 4: Đường chuẩn protein 25 Hình 5: Đường chuẩn Lcucinc 26 Hình 6: Hình ảnh điện di vector pIN III ompA, col pIN III ompA coỉ agarose 1% Băng 1: pIN III ompA; Băng 2: col; Băng 3: col cắt với enzym giới hạn BamHI Notl; Băng 4: pIN III ompA- col 29 Hình 7: Đặc điếm ni cấy cùa cùa chúng tái tồ hợp chúng vi khuấn mang vector pIN III ompA mơi trường LB có bố sung 1% casein, gelatin collage 30 Hình 8: Khả thúy phân chất casein, gelatin collagen cùa dịch phá vỡ tế bào BL21(DE3) pIN III ompA- coỉ 31 Hình 9: Định tính collagenase cúa dịch phá tế bào chúng tái tổ hợp điều kiện nhiệt độ nuôi cấy khác 34 Hình 10: Động thái lên men cùa chủng BL2Ỉ Pinlỉl ompiA-col 35 Hình 11 : Định tính collagenase dịch phá tế bào chủng tái tố hợp thời gian nuôi cấy khác 36 Hình 12 Kiểm tra biếu COL SDS-PAGE Giếng 1: 10 pg protein cùa BL21(DE3) PIN III ompA Giếng 2: 20 pg protein cùa pha không tan BL21(DE3) PIN III ompA- col Giếng 3: 10 pg protein cúa pha tan BL21(DE3) PIN III ompA- coỉ Giếng 4: Broad ranger protein marker 37 Hình 13: Quy trinh tinh collagenase 38 Hình 14: Định tính phân đoạn tinh collagenase tái tổ hợp 40 Hình 15: Kct quà zymogram gelatin cùa phân đoạn tinh collagenase tái tổ hợp 41 Hình 16 : Ánh hưởng cúa pH đến hoạt động cùa collagenase 43 Hình 17: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt động collagenase .44 Hình 18: Ánh hướng ion kim loại chất ức chế đến hoạt động cùa collagenase 45 Nguyễn Thị Hà 13-02 Khoa Công nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở ĐẬT VẤN ĐỀ Collagen chiếm 30% thành phần protein cấu trúc động vật đến 70% cấu trúc da, chất bền khó phân giải số protein Chi có collagenase enzyme có khả phân giải collagen chất trạng thái siêu xoắn Bởi enzyme có hoạt tính protease, gelatinase biểu khả phân cắt procollagen gelatin Trong nhiều protease, gelatinase nghiên cứu lại phân cắt bó sợi collagen dạng hịa tan khơng hịa tan Việc nghiên cứu sán xuất collagenase trớ nên vô hấp dẫn đặc biệt năm gần collagen ngày có nhiều ứng dụng lớn ngành cơng nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, y học, thấm mỹ, sản phẩm chăm sóc sức khỏe Collagenase có khả phân cắt đoạn collagen, thành đoạn có kích thước nhò, rút ngắn thời gian phân cắt, hiệu suất thu hồi cao, sản phẩm collagen có tính hịa tan cao, báo toàn đặc diem sinh học thân thiện với mơi trường Collagenase từ vi khuẩn có khả phân cắt hầu hết loại collagen nhiều vị trí sợi collagen Các collagenase hầu hết có nguồn gốc từ vi sinh vật gây bệnh cho người nên cần có thận trọng việc ứng dụng rộng rãi sàn phấm dành cho người LysinibaciUus sphaericus nhóm có sinh collagenase cao chưa nghiên cứu rộng rãi thơng tin trình tự gene mã hóa collagenase hệ gone công bố, đặc biệt chúng không mang trình tự mã hóa protein gây bệnh Đây ưu điếm sứ dụng enzyme từ vi khuân tạo sàn phẩm collagen không chứa tác nhân gây miền dịch hay dị ứng Nguyễn Thị Hà 13-02 Khoa Cơng nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Vì chúng tơi tiến hành đề tài : “ Nghiên cứu so sánh đặc điếm sinh hóa cllagenase tái tố hợp từ chủng Lysinibacilỉus sphaericus ”với mục tiêu : Nghiên cứu thu nhận tinh collagenase từ chúng vi khuấn Xác định đặc điềm sinh hóa cùa collagenase tái tố hợp Đồ tài thực Phịng Cơng nghệ Lên men, Viện Cơng nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam Lý lựa chọn nghiên cứu collagenase từ vi khuấn collagenase từ vi khuẩn có khả phân cắt loại collagen hịa tan khơng hịa tan với hiệu suất thu hồi cao Bên cạnh collagenase từ vi khuấn enzyme có khả phân cắt collagen type I, collagen type II mà collgcn type I collagen type II chiếm den 70% tổng số loại collagen nghiên cứu Trong prokaryote collagenase eukaryote collagen khơng có khả phân cắt hai loại collagen Nguyễn Thị Hà 13-02 Khoa Cơng nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp 1.1 Viện Đại học Mở TÓNG QUAN Giới thiệu Lysinibacillus Lysinibacillus sphaericus 1.1.1 Lysinibacillus Lysinibaciỉlus thuộc họ Baciỉỉaceae Trước coi thành viên chi Bacillus Nhưng đến năm 2007 dựa vào trình tự rARN đôi thành chi Lysinibacillus So với Bacillus sp thỉ Lysinibacillus sp chứa lysine aspartate peptidoglycan, khác với Bacillus sp diaminopimelic acid Lysinibacillus thường tìm thấy đất, nước bùn số mô thực vật Chững phân lập từ sản phẩm giống trồng lên men trí từ mầu gan cá [1], Lysinibacillus thường sống yếm khí tùy tiện, nhiên điều kiện định sống kỵ khí 1.1.2 Lysinibaclllus sphaericus Lysinibacillus sphaericus trực khuẩn Gram dương (hình 1), hình que sinh nội bào tử hình elip hình cầu, thuộc chi Lysinibacilỉus, cịn có tên khác Bacillus sphaericus ( NCBI genome project entez) Sự thay đối tên đề xuất bới Ahmet I năm 2007 dựa thành phần đặc biệt peptidoglycan cùa thành tế bào, phân tích đặc điểm sinh lý cùa L sphaericus [2], Nguyễn Thị Hà 13-02 Khoa Công nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hình 1: Hình ảnh nhuộm Gram L Sphaericus Trong điều kiện khắc nhiệt L sphaericus hình thành nội bào tử khơng hoạt động có chịu nhiệt, hóa chất tia cực tím Những bào tử có the sống sót thời gian dài Bộ gen cùa chùng L sphaericus C3-4Ỉ dòng giải trình tự vào năm 2008 Trình tự gcn vi khuẩn có ích làm tăng kiến thức trực khuẩn cung cấp nhìn sâu sắc để thiện tương lai cùa tác nhân kiếm soát sinh học quan trọng [3], L sphaericus khơng có khả chuyển hóa polysaccharides, thiếu enzyme hệ thống vận chuyển cụ Sự phong phú enzyme phân giải protein hệ thống vận chuyển cho phép L sphaericus sừ dụng đường chuyển hóa độc quyền sừ dụng loạt hợp chất hữu axit amin Một đặc tính biết đến L sphaericus khơng có chuyển hóa cacbonhydratc chi tiết q trình chuyến hóa lượng chưa làm sáng tỏ [3] Chủng L sphaericus có thê sinh trướng pH từ 5.5 - 9.5 với phát triển tối ưu pH 7.5 ngừng phát triển pH 5.0 Dái nhiệt độ phát triền Nguyễn Thị Hà 13-02 Khoa Công nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Dịch protein tông thu nhận sau chùng E coli BL21(DE3) PIN III ompA- co! cảm ứng biểu ly giải sóng siêu âm Dịch protein sứ dụng làm nguồn nguyên liệu đế tinh co! tái tổ phương pháp phân tách protein dựa vào khích thước khối lượng phân tử chạy cột sắc ký Sephadex GI50 Khi lọc chiết dung dịch đệm tris HC1 pH 7.5 sứ dụng, phân tử có trọng lượng phân từ nhỏ (ở muối) khuếch tán chậm chạp qua lồ nhỏ cùa hạt Sephadex bị trương phồng, cịn chất có trọng lượng phân tứ lớn collagenase khơng có khả vào mà lách nhanh qua hạt scphadcx chiết nhanh khỏi cột Vì ta có the tách chất có trọng lượng phân tứ cao khỏi cột gel trước so với chất có phân tử lượng nhỏ Kết quà tinh enzyme the qua hình 14 15 Các phân đoạn từ đến 20 phân đoạn có hoạt tính collagenase Chúng tiến hành chạy zymogram gelatin từ phân đoạn 1-30 đề kiểm tra hoạt tính độ tinh cùa phân đoạn SDS PAGE Nhưng kết băn gel SDS PAGE không rõ ràng luận văn Tuy nhiên phân đoạn chạy cột phân đoạn 10-16 collagenase thu tinh khoảng 70% Enzyme phân đoạn dùng cho nghiên cứu Nguyễn Thị Hà 39 13-02 Khoa Công nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở 1% casein l°/ó gelatin 1% gelatin l°/o casein 1% collagen l°/ó collagen Hình 14: Định tính phân đoạn tinh collagenase tái tổ họp Nguyễn Thị Hà 40 13-02 Khoa Cơng nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hình 15: Kết zymogram gelatin phân đoạn tinh collagenase tái tổ họp 3.4 Nghiên cứu đặc điểm hóa sinh collagenase tái tổ họp Giá trị Km lực enzyme với chất, giá trị Ktn nhỏ lực liên kết enzyme với chất lớn, nghĩa vận tốc phán ứng enzyme xúc tác lớn Theo kết báng Km cúa collagenase với casein nhở lớn so với Km collagen gelatin; Vmax casein nhanh so với collagen gelatin Nguyên nhân khác biệt cấu trúc casein đơn giản, trọng lượng nhó 28 - 30 kDa; gelatin có trọng hượng khống 95 kDa collagen có cấu trúc siêu xoắn Tuy nhiên, Km collagen gelatin khác biệt nhiều trình tự axit amin collagen gelatin giúp enzyme nhận biết không khác Nguyễn Thị Hà 41 13-02 Khoa Công nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Bảng 6: Giá trị Kni V max collagenase đối vói CO’ chất khác Cơ chất Km (%) Vmax Collagen 11.347 ±4.675 0.0183 ±0.0037 Gelatin 11.122 ±3.865 0.0489 ±0.0065 Casein 1.434 ±0.142 0.1133 ±0.0003 3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố pH, nhiệt độ, ion kim loại chất ức chế lên hoạt động enzyme tinh 3.5.1 Ảnh hưởng pH Hoạt độ enzyme phụ thuộc vào pH mơi trường, pH ảnh hưởng đến trạng thái ion hóa gốc R amino acid phân tử collagenase, ion hóa nhóm chức trung tâm hoạt động, ion hóa chất Ket quà khảo sát hoạt động collagenase tinh điều kiện pH khác từ đến (5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 9) cho thấy enzyme hoạt động tốt khống pH từ 6.5 với hoạt tính 191,54 u/mg Ớ pH collagenase 98% hoạt tính pH pH 5,5 hoạt tính collagenase gần hoàn toàn Nguyễn Thị Hà 42 13-02 Khoa Cơng nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Ánh hưởng cùa pH đến hoạt động cúa collagenase Hình 16 : Ánh hưỏng pH đến hoạt động cùa collagenase 3.5.2 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt động collagenase Bán chất cùa collagenase protein, nên khác với phản ứng hóa học, hoạt độ collagenase tăng lên tăng nhiệt độ giới hạn định, mà nhiệt độ chưa làm ảnh hưởng đến cấu trúc collagenase Sau khảo sát ảnh hưởng cùa nhiệt độ lên hoạt động cúa enzyme điều kiện nhiệt độ khác (10, 20, 30, 37 45°C) cho thấy collagenase có the hoạt động khoảng nhiệt độ từ 10°C đến 45°c, hoạt động tối ưu 30°C với hoạt tính 156.3 u/mg Collagenase hoạt tính hồn tồn nhiệt độ < 4°c > 45°c (Hình 17) Nguyễn Thị Hà 43 13-02 Khoa Công nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Ánh hướng cùa nhiệt độ đến hoạt động cùa collagenase Hình 17: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt động collagenase 3.5.3 Ảnh hưởng ion kim loại chất ức chế lên hoạt động collagenase tinh Các ion kim loại chất ức chế có vai trị quan trọng hoạt tính xúc tác cùa enzyme Các ion kim loại chất ức chế làm thay đoi trung tâm hoạt động enzyme làm thay đổi cầu nối disunphit enzyme ánh hường đến bắt cặp chất enzyme Hoạt tính cùa enzyme tăng lên giảm chí bất hoạt tùy vào ion kim loại chất ức chế Sự diện ion Zn2+ hỗn hợp phản ứng giúp nâng cao hoạt tính cùa collagenase gấp 1,24 lần từ 100.5 u/mg lên 125,115 u/mg Sự diện ion Ca2+, Fe2+, EDTA làm giảm hoạt tính cùa collagenase từ 25% đến 66% Khi bồ sung Cu2+ cystcin vào hỗn hợp phản ứng ức chế hoàn toàn hoạt động collagenase Nguyễn Thị Hà 44 13-02 Khoa Công nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Ánh hướng cùa ion kim loại chất ức chế đến hoạt động cùa collagenase Hình 18: Ảnh hưởng ion kim loại chất ức chế đến hoạt động collagenase Nguyễn Thị Hà 45 13-02 Khoa Cơng nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ Kết Luận Đã lựa chọn điều kiện sinh tống hợp collagenase cúa chùng vi khuẩn E coli BL2I(DE3) PIN III ompA col mơi trường LB có bổ sung 1% collagen, pH 7.5 ampicillin nồng độ 100 pM, IPTG 50 pM, lên men nhiệt độ tối ưu 30°C, sau 28 h thu hồi sinh khối Đã nghiên cứu quy trinh thu nhận collagenase tái tố hợp từ chúng vi khuẩn E coỉi BL2I(DE3) PIN III ompA coỉ cột sắc ký Sephadex GI50, thu hồi collagenase có độ tinh khoảng 70% phân đoạn 10 - 16 Đã nghiên cứu đặc điếm hoá sinh cùa collagenase tái tố hợp Dung dịch đệm Tris HC1 pH 6.5 nhiệt độ phản ứng 30°C điều kiện tối ưu cho phân cắt chất cùa collagenase tái tố hợp Sự diện ion Zn2+ hồn hợp phàn ứng giúp nâng cao hoạt tính collagenase Kiến Nghị Tối ưu codon để làm tăng khả biểu tế bào E coli collageanase tái tố hợp Sử dụng collagenase tái tổ họp để phân cắt collagen từ phụ phẩm công nghiệp nhằm tách chiết collagen type I, II dùng ứng dụng y học Nguyễn Thị Hà 46 13-02 Khoa Cơng nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Wang J, Fan Y, Yao z (2010), “Isolation of a Lysinibacillus fusiformis strain with tetrodotoxin-producing ability from puffer fish Fugu obscurus and the characterization of this strain”, Toxicon, 56(4), 640-3 [2] Ahmet I A Yokota Ayamazoe and T Fujiwara (2007), “Proposal of Lysinibacillus boronitolerans gen nov sp nov., and transfer of Bacillus fusiformis to Lysinibacillus fusiformis comb Now And Bacillus sphaericus to Lysinibacillus sphaericus comb, nov.", Int J Syts Evol Microbiol, 57( pt5) pp 1117-1125 [3] Hu X., w Fan , B Han , H Liu., D Zeng., Q Li., w Dong., J Yan., M Gao., c Berry an z Yuan (2008), “Complete genome sequence of the mosquitocidal bacterium Bacillus sphaericus C3-4 and comparison with those of closely ralated Bacillus species”, J Bacterial, 190 (8), pp.28922902 [4], Priest F G., M Goofellow and c Todd (1988), “A numerical classification of genus Bacillus”, J Gen Microbiol, 134(7),pp 1847-1882 [5] Pena- Montenegro T D., J Dusan (2013), “Genome sequence and description of the heavy metal tolerant bacterium Lysinibacillus sphaericus strain OT4b.31”, Stand Genomic Sci, 9(l),pp.42-56 [6] Haper E., Seifter s and Hospelhom V.D.(1965), "Evidence for subunits in bacterial collagenase", Biochcm Biophys Res Commun, 18,pp.627-632 [7] Schaub B.C., Strauch L 1965), Evidence for a new bacterial collagenolytic enzyme, Biochem Biophys Res Commun, 21(l),pp.34-39 [8] Sugasawara R.Bond M.D and Van Wart H.E (1985), “Substrate specificity of beta-collagenase from Clostridium histolyticum”, J Biol Chern, 206(5),pp 2771-2775 Nguyen Thị Hà 47 13-02 Khoa Cơng nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp [9] Viện Đại học Mở R., Sugasawara characterization of three Harper forms E “Purification (1984), of collagenase from and Clostridium histolyticum”, Biochemistry, 23(22), pp 5175-5181 [IO] Carrick L Jr., and characterization of R.s (1975), “Purification Berk acollagcnolytic enzyme from and Pseudomonas aeruginosa” Biochimica and Biophysica Acta (391), pp.422-434 [11] Merkel J R„ Drcisbach J H and Ziegler H B (1975), “Collagenolytic activity of some marine bacteria”, Appl Microbiol, 29(2), pp.145-15 [12] Merkel J.Ra., Drcisbach J.H (1978), “Purification and characterization of a marine bacterial collagenase”, Biochemistry, 17(14), pp.2857-2863 [13] Demina N s., Lysenko s V 1996), “Collagenolytic enzymes synthesized by microorganisms”, Mikrobiologiia, 65(3), pp.293-304 [14] Nagano H., To K A (2000), Purification of collagenase and specificity of its related enzyme from Bacillus subtilis FS-2, Biosci Biotechnol Biochcm, 64(1), pp 181-183 [15] Takeuchi H., Shibano Y., Morihara K., Fukushima J., Inami s., Keil B., Gilles AM., Kawamoto s and Okuda K (1992), “Structural gene and complete amino acid sequence of Vibrio alginolyticus collagenase”, Biochem J, 281 (pt3), pp.703-708 [16] Juarez z E., Stinson M w (1999), “An extracellular protease of Streptococcus gordonii hydrolyzes IV type collagen and collage analogues”, Infect Immun, 67 (1), pp 271-278 [17] Petrova D H.Shishkov s A and Vlahol ss (2006), “Novel thermostable serine collagenase from Thermoactinomyces sp 2IE: purification and some properties”, J Basic Microbiol, 46(4), pp.275-285 Nguyen Thị Hà 48 13-02 Khoa Cơng nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở [18] Grab D J., Kennedy R and Philipp M T (1996), “Borrelia burgdorferi possesses a collagenolytic activity”, FEMS Microbiol Lett, 144(1),pp.39-45 [19] Krepel c J., Gohr c M., Walker A p., Farmer s G and Edmiston CE (1992), “Enzymatically active Peptostreptococus magnus: association with site of infection”, J Clin Microbiol, 30(9),pp.2330-2334 [20] Despres s., Metivier FI and Weill R (1980), "Degradation of collagen by the cariogenic bacteria, Streptococcus mutans", c R Seances Acad Sci D, 290 (1) pp.41 - 44 [21] Molla A., Matsumoto K., Oyamada I., Katsuki T and Maeda H (1986), “Degradation of protease inhibitors, immunoglobulins, and other scrum proteins by Scrratia protease and its toxicity to fibroblast in culture”, Infect Immun, 53(3), pp 522-529 [22] Hausmann E., Kaufman E (1969), "Collagenase activity in a particulate fraction from Baderoides melaninogenicus" Biochim Biophys Acta, 194(2), pp.612-615 [23] Liu L., Ma M., Yu X and Wang w (2010), “Screening of collagenase-producing strain and purification of Bacillus cereus collagenase”, Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao, 2602), pp 194-200 [24] Matsushita o., Yoshihara K., Katayama s., Minami J and Okabe A (1994), “Purification and characterization of Clostridium perfringens 120- kilodalton collagenase and nucleotide sequence of the corresponding gene” , J Bacteriol, 176(1), pp 149-156 [25] Sakurai Y., Inoue H Nishii w., Takahashi T lino Yamamoto M and Takahashi K (2009), “Purification and characterization of a major collagenase from Streptomyces parvulus”, Biosci Biotechno! Biochem, 73(1),pp 21-28 [26] Teramura N., Tanaka K., Iijima K., Hayashida o., Suzuki K., Hattori s and Irie s (2011), “Cloning of a novel collagenase gene from the Nguyen Thị Hà 49 13-02 Khoa Cơng nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở gram-negative bacterium Grimontia (Vibrio) hollisae 1706B and its efficient expression in Brevibacillus choshinensis”, J Bacterio!, 193(12), pp.3049-3056 [27] Yu M s., Lee c Y (1999), “Expression and characterization of the prtv gene encoding a collagenase from Vibrio parahaemolyticus in Escherichia coll”, Microbiology, 145(ptl), pp.143-150 [28] Yhakoda, Y Ito, A Nagate, K Utssumi, M Aoshima and K Ohyashiki, 2002, “Increased collagenase activity in maccrophages From bronchial lavage as a diagnostic marker if non-small cell lung cancer” [29] Hiroko Nagano and Kim Anh To “ Purification and collagenase and Specificity of its Related Enzyme from Bacillus subtilis FS-2” Bioci Biotcchnol Biochcm, 182-183, 2000 [30] Methods in enzymeology, 1982, vol 28 [31] 10 Yhatodan Y Ito, A Nagate, K Utssumi, M Aoshima and K ohyashiki, 2002, “Increased collagenase activity in maccrophages From bronchial lavage as a diagnostic marker if non-small cell lung cancer” [32] , Yoshikiyo Sasagawa, Kazuo Izaki, Yuko Matsubara, Koki Suzuki, Hisao Kofima and Yoshiyuki Kamio 1995 “Molecular cloning and sequence analysis of the giene encoding the collagenase from Cytophage sp L43-I strain ” [33] Hiroaki Takeuchi, Yuji Shibano, Kazuyuki Morihara, Jun Fukushima, sumako Inami, Borivoj Keil, Anne-marie Gilles, Susumu Kawamoto and Kenji okuda “Structural giene and complete amino acid sequence a vibrio alginolyticus collagenase” Biochcm J (1992) 281 703- 708 [34] Osamu Marsushita Chang-Min Jung, Junzaburo Minami Seiichi Katayama, Nozomu Nishi, and Akinobu Okabe “ A study the collagen binding Domain of a 116-kDa Clostridium histolycum collagenase” J Bio Chern, Vol.273, 1998 Nguyen Thị Hà 50 13-02 Khoa Cơng nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở [35] Berry c (2012), “The bacterium, LysinibacHlus sphaericus, as an insect pathogen”, J Invertabr Panthoỉ, 109( ),pp 1-10 [36] Sarath G, De La Motte R, Wagner FW Proteolytic Enzymes, A Practical Approach New York: IRL Press; 1989 Protease assay methods; p 25 Nguyen Thị Hà 51 13-02 Khoa Cơng nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở PHỤ LỤC Các loại môi trường nuôi cấy lên men vi sinh vật 1.1 Môi trường MPA: (g/1) Pepton 10 Cao thịt NaCl Agar 18-20 Nước cất 1000ml pH 7-7.2 Môi trường casein: (g/1) Pepton 10 Cao thịt NaCl Agar 18- 20 Nước cất 1000ml pH 7- 7.2 10 Casein 1.3 Môi trường gelatin: (g/1) Pepton 10 Cao thịt NaCl Agar 18-20 Nước cất 1000ml pH 7- 7.2 gelatine Nguyễn Thị Hà 10 52 13-02 Khoa Công nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở 1.4 Mơi trường khống ISP9 : (g/1) (NH4)2SO4 2,64 kh2po4 2,38 K2HPO4 5.65 MgSO4.7H2O Muối vi lượng Iml Agar 15 Nước cất 1000ml pH 6.8-7 1.4.1 Các nguồn muối vi lượng: (g/1) CuSO4.5H2O 1.5 0,64 FcSO4.7H2O 0,11 MnCl2.4H2O 0,79 ZnSO4.7H2O 0,15 Nước cất 100ml Mơi trường khống ISP9 có bồ sung collagen: (g/1) (NH4)2SO4 2,64 KH2PO4 2,38 K2HPO4 5.65 MgSO4.7H2O Collagen 10 Muối vi lượng Iml Agar 15 Nước cất 1000ml pH 6.8-7 Nguyễn Thị Hà 53 13-02 Khoa Công nghệ sinh học ... Nghiên cứu so sánh đặc điếm sinh hóa cllagenase tái tố hợp từ chủng Lysinibacilỉus sphaericus ”với mục tiêu : Nghiên cứu thu nhận tinh collagenase từ chúng vi khuấn Xác định đặc điềm sinh hóa. .. Hàn Quốc Pipetman Gilson, Mỹ Máy siêu âm Vibracell, Mỹ Tú lạnh Nhật Bản Máy PCR Mỹ 2.2 2.2.1 Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng tái tổ họp Chủng tái tổ hợp BL2I(DE3) pIN III-... nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đặc điểm sinh học chủng tái tổ họp Gcn mã hóa collagenase từ chúng Lysinibacillus sphaericus VN3 khuếch đại từ