Tạo dòng và biểu hiện interferon alpha 2b của người trên hệ thống tế bào vi khuẩn escherichia coli

Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN THỊ CẨM TIÊN TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN INTERFERON ALPHA 2B CỦA NGƯỜI TRÊN HỆ THỐNG TẾ BÀO VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI Chuyên ngành: Niên khóa: Mã số học viên: CƠNG NGHỆ SINH HỌC 2005 03105632 LUẬN VĂN THẠC SỸ TP HỒ CHÍ MINH, tháng 12 năm 2007 ABSTRACT This study focuses on the cloning and expression of recombinant human interferon alpha 2b in Escherichia coli A 498 bp fragment coding for human interferon alpha 2b was amplified from human genomic DNA by PCR, using the sense 5'GGGAATTCTGTGATCTGCCTCAAACCCACAG-3' and the antisense 5' AAGCGGCCGCTCATTCCTTACTTCTTAAAC 3', oligonucleotides This fragment was cloned into cloning vector pJET (pJET – IFNα2b) in E.coli DH5α The transformed E.coli having IFN-α2b was selected by colonie PCR The human interferon alpha 2b fragment was cut from pJET – IFNα2b by EcoRI/ NotI digested enzymes and cloned into pGEX 4T-1 expression vector This vector was propagated in E.coli BL 21 The human interferon alpha 2b clone was selected and sequenced The correct nucleotide sequence was compared with the known gene sequences deposited at the NCBI Gene Bank database The expression of fusion protein was verified in polyacrylamide gel western blotting detection using polyclonal antibodies against GST was shown a right mini band and another lower band, suggesting the quick degradation of fusion protein in E.coli MỤC LỤC I ĐẶT VẤN ĐỀ Trang 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Tên đề tài II MỤC TIÊU ĐỀ TÀI III TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3.1 Tổng quan Interferon IV 3.1.1 Lịch sử nghiên cứu Interferon 3.1.2 Phân loại Interferon 3.1.3 Nguồn gốc Interferon 3.1.4 Cơ chế hoạt động Interferon 10 3.1.5 Cơ chế truyền tín hiệu tế bào Interferon 11 3.1.6 Tính chất vai trị Interferon 14 3.1.7 Ứng dụng Interferon 15 3.1.8 Các loại Interferon lưu hành thị trường 17 3.1.9 Interferon alpha 2b tái tổ hợp 18 3.2 Tổng quan tạo dòng gen E.coli 19 3.3 Tổng quan biểu gen E.coli 24 3.3.1 Biểu gen hệ thống tế bào vi khuẩn 24 3.3.2 Biểu gen hệ thống tế bào Eukaryote 26 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: 27 4.1 Sơ đồ chung 27 4.2 Vật liệu hóa chất nghiên cứu 29 4.2.1 Chủng vi khuẩn 29 4.2.2 Plasmid 29 4.2.3 Enzyme cắt nối 30 4.2.4 Primers 31 4.2.5 Thang chuẩn 31 4.2.6 Hóa chất mơi trường 31 4.2.7 Dụng cụ, thiết bị 32 4.3 Các phương pháp thí nghiệm 33 4.3.1 Phương pháp tách chiết DNA người từ tế bào niêm mạc má 33 4.3.2 Phương pháp điện di DNA gel agarose 33 4.3.3 Phương pháp PCR phân lập gen Interferon alpha 2b 33 4.3.4 Phương pháp tinh DNA tủa Ethanol 34 4.3.5 Phương pháp tinh đoạn gen từ gel agarose 34 4.3.6 Phương pháp chèn đoạn gen vào plasmid 35 4.3.7 Phương pháp tạo tế bào E.coli khả nạp CaCl2 35 4.3.8 Phương pháp hóa biến nạp 36 4.3.9 Phương pháp chọn lọc dòng tế bào tái tổ hợp 36 4.3.10 Phương pháp PCR khuẩn lạc 36 4.3.11 Phương pháp tách chiết plasmid tư E.coli 37 4.3.12 Phương pháp cắt plasmid RE 38 4.3.13 Phương pháp thực phản ứng nối 38 4.3.14 Phương pháp kiểm tra diện gen plasmid 38 4.3.15 Phương pháp cảm ứng biểu protein E.coli 38 4.3.16 Phương pháp điện di SDS-PAGE 39 4.3.17 Phương pháp Western blot 40 V THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN 43 VI NHÂN SỰ THỰC HIỆN 44 VII KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 45 7.1 Phân lập đoạn gen mã hóa Interferon alpha 2b 45 7.2 Nhân dòng gen IFN alpha 2b E.coli 47 7.3 Kết giải trình tự đoạn gen IFN alpha 2b 49 7.4 Tạo dòng tế bào biểu có mang gen IFN alpha 2b 56 7.4.1 Chuyển gen IFN vào plasmid biểu biến nạp vào tế bào E.coli nhân dòng 56 7.4.2 Tách chiết plasmid biểu từ tế bào nhân dòng chuyển vào tế bào E.coli biểu 59 7.4.3 Kết giải trình tự gen IFN plasmid biểu 61 7.5 Biểu protein mục tiêu 7.5.1 Kiểm tra biểu protein SDS-PAGE 67 67 7.5.2 Kiểm định diện protein mục tiêu Western blot 69 VIII KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 73 IX 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH Trang TỔNG QUAN TÀI LIỆU: Hình 1: Mơ tả thí nghiệm Isaacs Lindenmann Hình 2: Cơ chế truyền tín hiệu Type II Interferon receptor Hình 3: Cơ chế truyền tín hiệu Type I Interferon receptor Hình 4: Hoạt động kháng virus Interferon Hình 5: Interferon alpha 2b Hình 6: Hình thái vi khuẩn E.coli Hình Cấu trúc plasmid pJET 1.2 Hình 8: Cấu trúc plasmid pGEX-4T1 12 13 15 19 25 29 30 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN: Hình 7.1 Kết điện di gel agagrose sản phẩm PCR phân lập đoạn gen mã hóa Interferon từ DNA tế bào người với Pfu turbo DNA polymerase 46 Hình 7.2 Kết điện di gel agarose sản phẩm tinh đoạn gen mã hóa Interferon từ gel, sử dụng QIA quick gel extraction kit 46 Hình 7.3 Kết điện di gel agarose sản phẩm PCR khuẩn lạc dòng tế bào E.coli DH5α biến nạp 48 Hình 7.4 Kết điện di gel agarose sản phẩm cắt plasmid nhân dòng pJET 1.2 tách từ dòng DH5α tái tổ hợp với EcoRI NotI để kiểm tra đoạn gen Interferon chèn 49 Hình 7.5 Kết giải trình tự đoạn plasmid pJET1.2 có chứa đoạn gen Interferon alpha 2b chèn 50 Hình 7.6 Trình tự đoạn gen IFNalpha 2b phân lập so sánh với liệu NCBI công cụ nucleotide blast 52 Hình 7.7 So sánh trình tự protein gen IFN apha 2b phân lập với liệu NCBI công cụ blastx 54 Hình 7.8 So sánh trình tự nucleotide đoạn nằm gen IFN apha 2b (reverse) với liệu NCBI cơng cụ nucleotide blast 55 Hình 7.9 Kết điện di gel agarose sản phẩm cắt plasmid nhân dòng với EcoRI NotI để thu nhận đoạn gen Interferon chèn 56 10 Hình 7.10 Kết điện di gel agarose đoạn gen Interferon thu nhận từ gel 57 11 Hình 7.11 Kết điện di gel agagrose sản phẩm plasmid sau cắt với EcoRI NotI tủa loại bỏ đoạn nhỏ 57 12 Hình 7.12 Kết điện di gel agarose sản phẩm PCR khuẩn lạc tế bào DH5α sau hóa biến nạp 58 13 Hình 7.13 Kết điện di gel agarose sản phẩm PCR khuẩn lạc tế bào E.coli BL21 sau hóa biến nạp 59 14 Hình 7.14 Trình tự đoạn gen IFNalpha 2b plasmid biểu so sánh với liệu NCBI công cụ nucleotide blast 63 15 Hình 7.15 So sánh trình tự protein gen IFN apha 2b plasmid biểu với liệu NCBI cơng cụ blastx 65 16 Hình 7.16 So sánh trình tự nucleotide đoạn plasmid biểu nằm gen IFN apha 2b (reverse) với liệu NCBI công cụ nucleotide blast 66 17 Hình 7.17 Kết điện di protein tổng số gel polyacrylamide 12.5 % 68 18 Hình 7.18 Kết phát Western blot với kháng thể kháng GST phát protein màng lai 70 19 Hình 7.19 Kết xác định protein biểu nằm phần tan hay không tan 71 Trang I ĐẶT VẤN ĐỀ: 1.1 Tính cấp thiết đề tài: Interferon protein kháng virus tế bào sống sinh ra, tổng hợp từ thể sinh interferon gọi interferonogen Interferon thể tạo thể bị nhiễm virus có chức bảo vệ thể chống lại xâm nhiễm virus Hiện nay, Interferon loại thuốc sử dụng hầu hết điều trị bệnh viêm gan siêu vi B, viêm gan siêu vi C (Có thể sử dụng đơn lẻ kết hợp với loại thuốc kháng sinh) Ngồi ra, Interferon cịn sử dụng điều trị bệnh như: ung thư vú, ung thư buồng trứng, u lympho bào, u hắc tố, ung thư máu , bệnh có liên quan đến virus herpes, cúm, bệnh thủy đậu, Theo thống kê, có 3% dân số giới bị nhiễm virus viêm gan siêu vi C, tỷ người bị nhiễm virus viêm gan siêu vi B [39] Năm 2004, tổng doanh thu ngành dược giới cho sản phẩm Interferon 5,9 tỷ USD dự đoán tăng lên 8,8 tỷ USD vào năm 2010 [32] Hơn 20 năm trở lại đây, sản xuất Interferon trở thành chạy đua khốc liệt tập đoàn dược phẩm giới Các công ty dược phẩm, trung tâm công nghệ liên tục nghiên cứu chủng giống vi sinh vật mới, vật liệu sinh học để hồn thiện cơng nghệ sản xuất interferon Tuy nhiên, nay, giới có khoảng 10 công ty dược phẩm sản xuất Interferon công nghệ sản xuất Interferon tiếp tục nghiên cứu Ở Việt Nam, theo thông tin từ Bộ Y Tế, có 25% dân số nhiễm bệnh viêm gan virus B virus C [31] , vậy, trung bình – người có người bị nhiễm virus gây viêm gan B C Trong đó, Việt Nam, chưa có nơi sản xuất interferon Tất loại thuốc interferon bán thị trường Việt Nam phải nhập từ nước ngồi Mặt khác, chi phí cho liều điều trị interferon nhập ngoại khoảng từ đến triệu đồng, tuần Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ Học viên: Nguyễn Thị Cẩm Tiên Trang điều trị từ – liều vòng – tháng [14,16] Chi phí q cao so với mức sống trung bình người dân Việt Nam Hiện có Viện Vaccine Sinh phẩm Nha Trang nhập đóng gói chế phẩm Interferon alpha 2b với tên gọi Superferon, ứng dụng thuốc nhỏ mũi dùng để điều trị cảm cúm bệnh virus đường hô hấp Hiện nay, Interferon sản xuất hầu hết Interferon tái tổ hợp, FDA chứng nhận cho phép sử dụng điều trị bệnh người [36] Phần lớn thuốc Interferon sản xuất từ công nghệ protein tái tổ hợp vi khuẩn Escherichia coli nấm men Pichia Trong đó, Interferon alpha 2b dạng ứng dụng điều trị nhiều quy trình sản xuất Interferon hết hạn quyền Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn cấp thiết trên, nằm định hướng chiến lược Trung tâm Cơng nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh, chúng tơi tiến hành thực đề tài: “Tạo dịng biểu gen mã hóa cho Interferon alpha 2b người tế bào vi khuẩn Escherichia coli“, nhằm góp phần tham gia vào việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm Interferon có giá thành phù hợp để ứng dụng điều trị bệnh cho người dân Việt Nam 1.2 Tên đề tài: Tạo dòng biểu gen mã hóa cho Interferon alpha 2b người hệ thống tế bào vi khuẩn Escherichia coli Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ Học viên: Nguyễn Thị Cẩm Tiên Trang II MỤC TIÊU ĐỀ TÀI:  Phân lập đoạn gen mã hóa interferon alpha 2b người  Tạo dòng tế bào vi khuẩn Escherichia coli mang gen mã hóa Interferon alpha 2b người  Tạo dịng tế bào vi khuẩn Escherichia coli mang vector biểu protein dung hợp  Biểu protein mục tiêu Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ Học viên: Nguyễn Thị Cẩm Tiên Trang 63 Hình 7.15 So sánh trình tự protein gen IFN apha 2b plasmid biểu với liệu NCBI công cụ blastx: pdb|1RH2|A Chain A, Recombinant Human Interferon-Alpha 2b pdb|1RH2|B Chain B, Recombinant Human Interferon-Alpha 2b pdb|1RH2|C Chain C, Recombinant Human Interferon-Alpha 2b pdb|1RH2|D pdb|1RH2|E Chain D, Recombinant Human Interferon-Alpha 2b Chain E, Recombinant Human Interferon-Alpha 2b pdb|1RH2|F Length=165 Chain F, Recombinant Human Interferon-Alpha 2b Score = 330 bits (846), Expect = 1e-91 Identities = 164/165 (99%), Positives = 164/165 (99%), Gaps = 0/165 (0%) Frame = -1 Query 498 CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMI 319 CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMI Sbjct CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMI 60 Query 318 QQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVR 139 QQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLM EDSILAVR Sbjct 61 QQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMNEDSILAVR 120 Query 138 KYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE KYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE Sbjct 121 KYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE 165 Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ Học viên: Nguyễn Thị Cẩm Tiên Trang 64 Hình 7.16 So sánh trình tự nucleotide đoạn plasmid biểu nằm ngồi gen IFN apha 2b (reverse) với liệu NCBI công cụ nucleotide blast: > gb|U13853.1|XXU13853 pGEX-4T1 cloning vector, complete sequence Length=4969 Score = 115 bits (62), Expect = 1e-23 Identities = 62/62 (100%), Gaps = 0/62 (0%) Strand=Plus/Minus Query CGGGGATCCACGCGGAACCAGATCCGATTTTGGAGGATGGTCGCCACCACCAAACGTGGC 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 938 CGGGGATCCACGCGGAACCAGATCCGATTTTGGAGGATGGTCGCCACCACCAAACGTGGC 879 Query 61 TT 62 || Sbjct 878 TT 877 Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ Học viên: Nguyễn Thị Cẩm Tiên Trang 65 Kết cho thấy mức độ tương đồng gen Interferon chèn plasmid biểu pGEX-4T1 với trình tự gen Interferon alpha 2b người NCBI 100%, đồng thời cho thấy đoạn gen chèn vàp plasmid hướng khung đọc protein Như vậy, đến giai đoạn này, thực thành công việc phân lập đoạn gen Interferon alpha 2b từ gen người, nhân dòng chúng E.coli DH5α tạo chủng tế bào biểu E.coli BL21 có mang gen Interferon alpha 2b người Chủng tế bào tiếp tục đem cảm ứng biểu protein để xác định khả biểu gen 7.5 Biểu protein mục tiêu: 7.5.1 Kiểm tra biểu protein phương pháp điện di SDS-PAGE: Với kết giải trình tự trên, tiến hành tăng sinh cảm ứng biểu protein chủng E.coli BL21 có mang gen interferon alpha 2b với chất cảm ứng IPTG nồng độ cuối 1mM Sinh khối tế bào thu nhận trước sau cảm ứng thời điểm khác đồng thời ly giải mẫu sinh khối sóng siêu âm để xác định protein mục tiêu nằm phần tan hay phần cặn Thành phần protein tổng số phân tích gel polyacrylamide Protein tái tổ hợp Interferon alpha 2b phát thông qua kháng thể kháng protein GST Protein GST có kích thước 26 kDa, protein tái tổ hợp Interferon alpha 2b có kích thước khoảng 19.3 kDa (19269 Da) Như vậy, protein dung hợp cần tìm có kích thước khoảng 45.3 kDa Kết thu sau: Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ Học viên: Nguyễn Thị Cẩm Tiên Trang 66 1a 1b 1c 2a 2b 2c 2d M 45kDa 31kDa 26 kDa 21.5kDa 2b’ 1b’ Hình 7.17 Kết điện di protein tổng số gel polyacrylamide 12.5% Giếng 1a: BL21-pGEX 4T-1 trước cảm ứng Giếng 1b: BL21-pGEX 4T-1 sau cảm ứng IPTG Giếng 1c: BL21-pGEX 4T-1 sau cảm ứng IPTG Giếng 2a: BL21- pGEX-4T1-IFN 2b.1BL trước cảm ứng IPTG Giếng 2b: BL21- pGEX-4T1-IFN 2b.1BL sau cảm ứng IPTG Giếng 2c:BL21- pGEX-4T1-IFN 2b.1BL sau cảm ứng IPTG Giếng 2d: BL21- pGEX-4T1-IFN 2b.1BL sau 20 cảm ứng IPTG M: Thang protein Giếng 1b’: Dịch môi trường nuôi cấy BL21-pGEX 4T-1 sau cảm ứng IPTG giờ, ly tâm loại sinh khối Giếng 2b’: Dịch môi trường nuôi cấy BL21-pGEX-4T1-IFN 2b.1BL sau cảm ứng IPTG giờ, ly tâm loại sinh khối Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ Học viên: Nguyễn Thị Cẩm Tiên Trang 67 Kết điện di SDS-PAGE hình 7.17 cho thấy:  Đối với tế bào BL21 mang plasmid pGEX, khơng mang gen IFN alpha 2b thời điểm sau cảm ứng với IPTG, xuất vạch đậm vị trí tương đương 26kDa , chứng tỏ protein GST cảm ứng biểu tốt (giếng 1b, 1c, hình 7.17)  Đối với dịng tế bào BL21 có chứa plasmid có mang gen Interferon alpha 2b ta thấy: Trước cảm ứng với IPTG, khơng có khác với pGEX thường Sau cảm ứng với IPTG, có xuất band protein đậm tương đương với kích thước 26kDa 45 kDa, mức độ đậm so với plasmid pGEX khơng chứa gen Interferon Điều có nghĩa quy trình cảm ứng biểu thực Tuy nhiên, có khả protein GST-Interferon alpha 2b biểu mức độ thấp 7.5.2 Khẳng định protein mục tiêu Western-blot: Để kiểm tra xác khẳng định có hay khơng diện protein GST-Interferon apha 2b, chúng tiếp tục thực phản ứng Western blot Sau điện di SDS-PAGE, gel chuyển lên màng lai phương pháp điện chuyển Màng lai ủ với kháng thể đơn dòng kháng GST sau ủ với kháng thể cộng hợp có gắn peroxidase Với diện chất DAB/NiCl2 H2O2, sau vài phút, vạch protein xuất màng lai Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ Học viên: Nguyễn Thị Cẩm Tiên Trang 68 1a 1b 1c 1d 2a 2b 2c 2d 45.3 kDa 26 kDa Hình 7.18 Kết Western blot với kháng thể kháng GST phát protein màng lai Giếng 1a: BL21-pGEX 4T-1 trước cảm ứng Giếng 1b: BL21-pGEX 4T-1 sau cảm ứng IPTG Giếng 1c: BL21-pGEX 4T-1 sau cảm ứng IPTG Giếng 1d: BL21-pGEX 4T-1 sau 20 cảm ứng IPTG Giếng 2a: BL21- pGEX-4T1-IFN 2b.1BL trước cảm ứng IPTG Giếng 2b: BL21- pGEX-4T1-IFN 2b.1BL cảm ứng IPTG Giếng 2c:BL21- pGEX-4T1-IFN 2b.1BL cảm ứng IPTG Giếng 2d: BL21- pGEX-4T1-IFN 2b.1BL sau 20 cảm ứng IPTG Kết Western blot hình 7.18 cho thấy, Protein dung hợp GST-Interferon có biểu hiện, nhiên hàm lượng biểu tương đối thấp Ngoài vạch tương đương với 45.3kDa, cịn thấy có số vạch bên tương đương với kích thước 26-30kDa Điều giải thích protein GST-IFN bị phân cắt protease, kết giếng 2d cho thấy, sau 20 nuôi cấy, hầu hết protein bị phân hủy Như vậy, kết cho thấy, biểu protein Interferon alpha 2b dạng GST- Interferon Tuy nhiên, mức độ biểu thấp protein bị phân hủy nhiều Trong thời gian tới, lựa chọn thí nghiệm số chủng tế bào host khác thay đổi điều kiện nuôi cấy nhằm mục đích biểu protein mức độ cao giảm tối đa phân cắt protease Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ Học viên: Nguyễn Thị Cẩm Tiên Trang 69 Ngoài ra, để xác định protein dung hợp nằm phần tan hay không tan, nhằm phục vụ cho mục đích thu nhận protein sau này, tiến hành phá vỡ tế bào ly tâm, thu phần dịch phần cặn riêng Phần dịch tan phần cặn tiếp tục chạy điện di thực Western blot Kết thu sau: M 1a 1a 1b 1b 2a 2b 3a 3b 31 kDa 21.5 kDa M 2a 2b 3a 3b 45.3 kDa 31kDa 26 kDa Hình 7.19 Kết xác định protein biểu nằm phần tan hay không tan nhuộm Ponceur S Western blot Giếng 1: BL21-pGEX-4T1-IFN 2b.1BL trước cảm ứng Giếng 1a: BL21-pGEX-4T1-IFN 2b.1BL trước cảm ứng- Phần tan Giếng 1b: BL21-pGEX-4T1-IFN 2b.1BL trước cảm ứng- Phần cặn Giếng 2: BL21-pGEX 4T-1 sau cảm ứng IPTG Giếng 2a: BL21-pGEX 4T-1 sau cảm ứng IPTG - Phần tan Giếng 2b: BL21-pGEX 4T-1 sau cảm ứng IPTG - Phần cặn Giếng 3: BL21-pGEX-4T1-IFN 2b.1BL sau cảm ứng IPTG Giếng 3a: BL21-pGEX-4T1-IFN 2b.1BL sau cảm ứng IPTG- Phần tan Giếng 3b: BL21-pGEX-4T1-IFN 2b.1BL sau cảm ứng IPTG- Phần cặn Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ Học viên: Nguyễn Thị Cẩm Tiên Trang 70 Kết cho thấy, vạch xuất phần tan phần cặn Kết cho thấy, Protein dung hợp E.coli nằm chủ yếu phần tan Tuy nhiên, kết ly giải tế bào sóng ly tâm khơng tối ưu Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ Học viên: Nguyễn Thị Cẩm Tiên Trang 71 VIII KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ: Như vậy, đề tài “Tạo dòng biểu gen mã hóa interferon người hệ thống tế bào vi khuẩn Escherichia coli”, đạt mục tiêu ban đầu đề phân lập đoạn gen mà hóa protein Interferon alpha 2b người, tạo dòng tế bào E.coli mang gen Interferon alpha 2b biểu thành công protein interferon alpha 2b người tế bào vi khuẩn E.coli Tuy nhiên, khoảng thời gian hạn hẹp đề tài, kết biểu protein chưa tốt Lượng protein biểu thấp dễ bị phân hủy Chúng chưa thực bước thu nhận tinh protein, … Nhưng nhìn chung, đề tài hồn thành kết có ý nghĩa ứng dụng cho hướng nghiên cứu Trung tâm công nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh Trong thời gian tới, đề nghị hướng nghiên cứu sau:  Chọn lựa chủng tế bào E.coli biểu khác, phù hợp hơn, khảo sát điều kiện cảm ứng biểu hiện, từ chọn lọc dịng tế bào E.coli có mang gen interferon alpha 2b có khả biểu protein cao ổn định  Lên men sản xuất interferon alpha 2b quy mơ phịng thí nghiệm  Tinh thu nhận sản phẩm Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ Học viên: Nguyễn Thị Cẩm Tiên Trang 72 IX TÀI LIỆU THAM KHẢO: Patents: Lohray; Braij Bhushan (Ahmedabad, IN); Shah; Sarvagna; (Amedabad, IN); Pandit; Hemal (Ahmedabad, IN); Patel; Megha (Ahmedabad, IN) Method for producing recombinant human interferon alpha 2b polypeptide in pichia pastoris US Patent 20060223145 Patten Philip A.(Portola Valley, CA); Viawananthan, Sridhar (Menlo Park, CA); Nissen, Torben Lausegaard (Sanfracisco, CA); Voht ; Anne (Loerrach, DE); Kropshofer, Harald (Loerrach, DE); Schumacher, Ralf (Penzberg, DE); Fisher, Stephan (Polling, DE); Seeber Stephan; (Penzberg, DE); Grossmann, Adelbert (Eglfing, DE); Hess, Friederike (Muenchen, DE); Schaubmar, Andreas; (Penzberg, DE); Falkenstein, Roberto (Muechen, DE); Koll, Hans (Oberoth, DE); Dembowski, Markus (Muechen, DE); Adam, Stephan Scott (Phoenix, AZ) Interferon alpha polypeptides and conjugates US patent 20050266465 De Frees, Shawn; (North Wales, PA) ; Zopf, David; (Wayne, PA) ; Bayer, Robert; (San Diego, CA) ; Bowe, Caryn; (Doylestown, PA) ; Hakes, David; (Willow Grove, PA) ; Chen, Xi; (Lansdale, PA) Interferon alpha: remodeling and glycoconjugation of interferon alpha US patent 20040082026 Liu; Chih-Ping; (San Francisco, CA) ; Villarete; Lorelie H.; (Alameda, CA) ; Kirnon; Stephen N.; (San Ramon, CA Treatment using an interferon US patent 20060257363 Desjarlais; John R.; (Pasadena, CA) ; Filikov; Anton; (Woburn, MA) ; Steed; Paul Michael; (Chapel Hill, NC) ; Zalevsky; Jonathan; (Riverside, CA) ; Szymkowski; David Edmund; (Monrovia, CA) Protein based TNFalpha variants for the treatment of TNF-alpha related disorders US Patent 20060257360 Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ Học viên: Nguyễn Thị Cẩm Tiên Trang 73 Tài liệu: Tiếng Anh: C./A Valente, D.M.F Prazeres, J.M.S Cabral, and G.A.Monterio Translational features of human interferon alpha 2b production in Escherichia coli Applied and enviromental microbiology 2004 Sidney Pestka, MD Interferons 2007 Y Luo, X Chen, R Han, M.A.O’Donnel Division of Urology, Beth Israel Deaconess Medical Center, Havard Medical School, Boston, MA, USA Recombinant BCG expressing human interferon alpha 2b demonstrates enhanced immunogenicity Clin Exp Immunol 2001 Luigi Aurisicchio, Paola Delmastro, Valentina Sallucci, Odalys Gonzalez Paz, Patrizia Rovere, Gennaro Ciliberto, Nicola La Monica, Fabio Palombo Liver specific alpha interferon gene expression results in protection from induced hepatitis American society for microbiology, 2000 10 Departamento de Bioqui’mica y Biologi’a Molecular, Facultad de Qui’mica Universidad Complutense Madrid, Spain Recombinant pronapin precusor in Pichia pastoris displays structural and immunologic equivalent properties to its mature product isolated from rapeseed 11 Theppanya Charoenrat Process design for production of Thai rosewood beta-glucosidase in Pichia pastoris School of biotechnology Royal Insitute of Technology Stockholm, Sweeden 12 C.A Valente, D M F Prazers, J.M.S Cabral, and G.A.Monteiro Translational features of human alpha 2b interferon production in E coli Centro de Engenharia Biologica e Quimica, Instituto Superio Tecnico, 1049-001 Lisbon, Portugal 13 Daniel Kephart, Promega Coporation Rapid Isolation of RNA from small quantities of human whole blood 14 Yu-Seng Wang, Stephen Youngster, Michael Grace, James Bausch, Ronald Bordens, Daniel F Wyss Structural and biological characterization pf pegylated recombinant interferon alpha 2b and its therapeutic implications Advaced Drug Delivery reviews 54, 2002 pages 47-570 Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ Học viên: Nguyễn Thị Cẩm Tiên Trang 74 15 Interferon alpha-2b proven to be the first effective drug treatment for malignant melanoma; Journal of Clinical Oncology; 2001 16 Nazan Çetingül, MD, Kaan Kavakli, MD, Canan Vergin, MD, Senay Öztop, MD, Güngưr Nili, MD, Sema Aydodu, MD, Tijen Ưzacar, MD, Altinay Bilgiỗ, MD, Gỹl Yỹce, MD and Rait Yaci, MD; Alpha-Interferon-2b Treatment for Chronic Hepatitis-B Infection in Children with Cancer; Journal of Tropical Pediatrics, 1996 42(5):262-266 17 Recombinant Protein Systems Copyright@ Molecular Staion 2006) 18 Emmet B Keeffe; Treatment of Chronic Hepatitis C Virus Infection 19 H Kirchner; Interferons, A Group of Multiple Lymphokines; Springer Semin Immunopathol,7:347-374; 1984 20 Interferon-α-2b: low-dose twice-daily enough in renal cancer; Inpharma, Volume 1, Number 1567, 2006-12-09, pp 9-9(1) 21 A dance between interferon-a/β and p53 demonstrates collaborations in tumor suppression and antiviral activities; Cancer cell; 2003 22 Lachgar A, Bizzin B; Involvement of alpha-interferon in HIV-1 induced immunosuppression A potential target for AIDS prophylaxis and treatment; 1994 23 Philip T Liu, Tuan V Ta, and Lorelie H Villarete; High-Yield expression and purification of Human Interferon alpha-1 in Pichia pastoris; Protein expression and purification 22, 381-387; 2001 24 Natasa Skoko, Barbara Argamante, Natasa Kovacevic Grujicic, Sergio Gabriel Tisminetzky, Vladimir Glisin and Goran Ljubijankic; Expression and characterization of human interferon-beta-1 in the methylotrophic yeast Pichia pastoris; Biotechnol Appl Biochem 38, 257-265; 2003 25 T.A.Brown Gene cloning and DNA analysis Blackwell publishing Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ Học viên: Nguyễn Thị Cẩm Tiên Trang 75 Tiếng Việt: 26 Nguyễn Thị Lang Phương pháp nghiên cứu công nghệ sinh học NXB Nông nghiệp-2002 27 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương Sinh học phân tử đại cương NXB Gíao dục 28 Nguyễn Tiến Thắng Hóa học protein ĐH KHTN 2005 29 Võ Thị Thương Lan Giáo trình sinh học phân tử tế bào ứng dụng NXB Giáo Dục 30 Quyền Đình Thi Cơng nghệ sinh học NXB Khoa học Kỹ thuật Websites: 31 http://moh.gov.vn 32 http://www.researchandmarkets.com 33 19 www.wikimedia.com/history of immunology/ 34 www.ncbi.com 35 www.vetintergeron.com 36 http://www.hepatitis-c.de 37 http://www2.umdnj.edu 38 http://en.wikipedia.org 39 www.drthuthuy.com 40 www.cytoshop.com 41 http://wwwchem.csustan.edu/chem4400/SJBR/amarjit.htm 42 http://encycl.opentopia.com/term/Interferon 43 http://www.hgsi.com/news/press/05-115_Albuferon_Phase_2_Combo_RBV.htm 44 http://www.bioscreening.net/2006/05/19/the-next-generation-of-interferonsneeds-improvement-in-efficacy-and-safety/ Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ Học viên: Nguyễn Thị Cẩm Tiên PHỤ LỤC KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ ĐOẠN PLASMID NHÂN DỊNG PJET 1.2 CĨ CHỨA GEN INTERFERON ALPHA 2B: 3F CAGCCTGGGTAGCANGAGGACCTTGATGCTCCTGGCACAGATGAGGAGAAT CTCTCTTTTCTCCTGCTTGAANGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAG GAGTTTGGCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGA TGATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTG GGATGAGACCCTCCTAGACAAATTCTACACTGAACTCTACCAGCAGCTGAAT GACCTGGAAGCCTGTGTGATACAGGGGGTGGGGGTGACAGAGACTCCCCTG ATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCAAAGAATCACTC TCTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGC AGAAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAGA AGTAAGGAATGAGCGGCCGCTTATCTTTCTAGAAGATCTCCTACAATATTCT CAGCTGCCATGGGAAATCGATGTTCTTTCTTTTATTCTCTCAAGATTTCCAGG CTGTATATTAAAACTTATATTAAGAACTATGCTAACCCCTCATCAGGAACCG TTGTAAGTGCGT 3R TTCCTTACTTCTTAAACTTTCTTGCAAGTTTGTTGACAAAGAAAAAGATCTCA TGATTTCTGCTCTGACAACCTCCCAGGCACAAGGGCTGTATTTCTTCTCTTTC AGATAGAGAGTGATTCTTTGGAAGTATTTCCTCACAGCCAGAATGGAGTCCT CCTTCATCAGGGGAGTCTCTGTCACCCCCACCCCCTGTATCACACAGGCTTC CAGGTCATTCAGCTGCTGGTAGAGTTCAGTGTAGAATTTGTCTAGGAGGGTC TCATCCCAAGCAGCAGATGAGTCCTTTGTGCTGAAGAGATTGAAGATCTGCT GGATCATCTCATGGAGGACAGGGATGGTTTCAGCCTTTTGGAACTGGTTGCC AAACTCCTCCTGGGGAAATCCAAAGTCATGTCTGTCCTTCAAGCAGGAGAAA AGAGAGATTCTCCTCATCTGTGCCAGGAGCATCAAGGTCCTCCTGCTACCCA GGCTGTGGGTTTGAGGCAGATCACAGAATTCCCATCTTGCTGAAAAACTCGA GCCATCCGGAAGATCTGGCGGCCGCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAC ... hóa Interferon alpha 2b từ tế bào người  Tạo dịng vector có mang gen mã hóa Interferon alpha 2b tế bào E .coli DH5  Tạo dòng tế bào vi khuẩn E coli mang vector biểu protein dung hợp  Biểu interferon. .. alpha 2b 49 7.4 Tạo dịng tế bào biểu có mang gen IFN alpha 2b 56 7.4.1 Chuyển gen IFN vào plasmid biểu biến nạp vào tế bào E .coli nhân dòng 56 7.4.2 Tách chiết plasmid biểu từ tế bào nhân dòng. .. Học vi? ?n: Nguyễn Thị Cẩm Tiên Trang II MỤC TIÊU ĐỀ TÀI:  Phân lập đoạn gen mã hóa interferon alpha 2b người  Tạo dòng tế bào vi khuẩn Escherichia coli mang gen mã hóa Interferon alpha 2b người