Tối ưu điều kiện biểu hiện AA9 polysaccharide Monooxygenase tái tổ hợp trong hệ thống escherichia coli.pdf

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH x BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ NĂM 2021 - 2022 Tên đề tài: Tối ưu điều kiện biểu AA9 polysaccharide monooxygenase tái tổ hợp hệ thống Escherichia coli Số hợp đồng: 2021.01.111 /HĐ-KHCN Chủ nhiệm đề tài: Ngô Thị Cẩm Nhung Đơn vị công tác: Viện Kỹ thuật Công nghệ cao NTT Thời gian thực hiện: 12 tháng TP Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 06 năm 2022 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc - BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ NĂM 2021 - 2022 Tên đề tài: Tối ưu điều kiện biểu AA9 polysaccharide monooxygenase tái tổ hợp hệ thống Escherichia coli Số hợp đồng: 2021.01.111/HĐ-KHCN Chủ nhiệm đề tài: Ngô Thị Cẩm Nhung Đơn vị công tác: Viện Kỹ thuật Công nghệ cao NTT Thời gian thực hiện: 12 tháng Các thành viên phối hợp cộng tác: STT Họ tên Chuyên ngành Cơ quan công tác Ngô Thị Cẩm Nhung Sinh học Viện Kĩ thuật Cơng nghệ cao NTT TP Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 06 năm 2022 Ký tên DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNh TĨM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỞ ĐẦU 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sinh khối lignocellulose sản xuất nhiên liệu sinh học 1.2 Polysaccharide monooxygenase (PMO) 1.2.1 Phân loại chế hoạt động 1.3 Enzyme AN3860 1.4 Hệ thống biểu PMO tái tổ hợp 1.4.1 Biểu PMO tái tổ hợp nấm sợi 1.4.2 Hệ thống biểu vi khuẩn E coli 1.4.3 Khảo sát điều kiện biểu protein tái tổ hợp VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 2.2 Vật liệu phương pháp nghiên cứu 10 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 10 2.2.2 Hóa chất 10 2.2.3 Thiết bị 10 2.2.4 Phương pháp nghiên cứu 11 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 15 3.1 Khảo sát môi trường biểu E coli BL21 tái tổ hợp mang vector pET22b-AN3860 15 3.2 Khảo sát nồng độ IPTG trình cảm ứng biểu protein AN3860 17 3.3 Khảo sát điều kiện nhiệt độ tối ưu cho biểu AN3860 19 Kết luận kiến nghị 21 TÀI LIỆU THAM KHẢO 23 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ 26 PHỤ LỤC HỢP ĐỒNG, THUYẾT MINH ĐỀ CƯƠNG 27 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT - AA Auxiliary Activities - APS Ammonium Persulfate - CAZy Carbohydrate-Active enzymes - E coli Escherichia coli - FPKM Fragments Per Kilobase Million - IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside -LB Luria Bertani medium - M9 M9 Minimal medium - mg Milligram - PMO Polysaccharide Monooxygenase -TB Terrific Broth -SB Super Broth - SDS Sodium dodecyl sulfate - SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hiệu thủy phân sinh khối tăng lên phản ứng hiệp lực Hình 1.2 Cơ chế hoạt động enzyme PMO chất cellulose Hình 3.1 Kết định lượng protein tổng số nuôi cấy môi trường khác phương pháp Bradford Kết trình bày trung bình cộng ba lần lặp lại độ lệch chuẩn, phân tích phương pháp one-way ANOVA, Tukey test 16 Hình 3.2 Kết khảo sát mức độ biểu protein AN3860 môi trường nuôi cấy khác gel SDS-PAGE số liệu phân tích từ phần mềm ImageJ 17 Hình 3.3 Ảnh hưởng nồng độ IPTG cảm ứng lên tổng hợp protein tổng số Kết trình bày trung bình cộng ba lần lặp lại độ lệch chuẩn, phân tích phương pháp one-way ANOVA, Tukey test 18 Hình 3.4 Kết SDS-PAGE kiểm tra lượng protein mục tiêu biểu chủng E coli BL21/AN3860 nồng độ IPTG khác sau cảm ứng phân tích tỉ lệ imageJ 19 Hình 3.5 Ảnh hưởng nhiệt độ cảm ứng tới tổng hợp protein tổng số chủng E coli BL21 tái tổ hợp Kết trình bày trung bình cộng ba lần lặp lại độ lệch chuẩn, phân tích phương pháp one-way ANOVA, Tukey test .20 Hình 3.6 Mức độ biểu protein mục tiêu mốc nhiệt độ cảm ứng khác gel SDS-PAGE số liệu phân tích từ phần mềm ImageJ .21 TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU STT Kết quà đạt Công việc thực Khảo sát môi trường nuôi cấy Xác định loại môi trường nuôi cấy chủng E coli tái tổ hợp mang gen tối ưu AN3860 Khảo sát nồng độ IPTG cảm ứng Giá trị nồng độ IPTG cảm ứng tối ưu biểu gen AN3860 chủng E coli tái tổ hợp Khảo sát nhiệt độ cảm ứng chủng Giá trị nhiệt độ cảm ứng biểu E coli tái tổ hợp mang gen phù hợp AN3860 STT Sản phẩm đăng ký Sản phẩm đạt Dạng III: 01 báo đăng tạp Dạng III: 01 báo đăng tạp chí chí ISSN-ISBN ISSN-ISBN Thời gian đăng ký: từ 03/2021 đến 03/2022 Thời gian nộp báo cáo: 20/03/2022 MỞ ĐẦU Hiện nay, sử dụng nhiên liệu hóa thạch gặp phải nhiều khó khăn cạn kiệt tài nguyên gây ô nhiễm môi trường Do đó, nguồn lượng sinh học quan tâm phát triển Mặc dù nguồn sinh khối thực vật dồi để sản xuất ethanol trình phân giải cấu trúc phức tạp lignocellulose thành đường đơn lại tốn nhiều chi phí, dẫn đến giá thành sản phẩm tăng lên nhiều lần Để giải vấn đề này, enzyme PMO tìm kiếm nghiên cứu nhằm cải thiện hỗn hợp enzyme tham gia phân giải chất theo chế oxy hóa khử phân cắt cầu nối β-1,4-glucoside bề mặt tinh thể cellulose, nhờ bổ trợ tăng cường hoạt tính enzyme thủy phân truyền thống cellulase Enzyme AN3860 PMO thuộc phân nhóm AA9 loại 3, có khả xúc tác linh hoạt vị trí C1 C4 Với tiềm enzyme cải thiện khả thủy phân tinh thể cellulose, AN3860 dịng hóa hệ thống biểu E coli BL21 (DE3) nhằm thu nhận protein phục vụ cho nghiên cứu chuyên sâu cấu trúc, khối phổ khảo sát hoạt tính phân giải chất lignocellulose quy mơ phịng thí nghiệm quy mô công nghiệp Để tăng cường hiệu biểu protein mục tiêu, thông số điều kiện nuôi cấy tiến hành tối ưu Với mong muốn tạo nguồn enzyme chủ động số lượng lớn để cung cấp cho thí nghiệm mơ tả protein AN3860 thu nhận từ chủng E coli BL21 (DE3) tái tổ hợp, thực đề tài: “Tối ưu điều kiện biểu AA9 polysaccharide monooxygenase tái tổ hợp hệ thống Escherichia coli” với nội dung bao gồm: - Khảo sát môi trường nuôi cấy tối ưu cho trình biểu AN3860 - Khảo sát nồng độ IPTG cảm ứng cho trình biểu AN3860 - Khảo sát nhiệt độ cảm ứng tối ưu cho trình biểu AN3860 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sinh khối lignocellulose sản xuất nhiên liệu sinh học Nhiên liệu sinh học biết đến giải pháp thay nhiều triển vọng cho nguồn nhiên liệu hóa thạch Sự chuyển đổi từ sử dụng nhiên liệu hóa thạch thành lượng sinh học giảm thiểu tác động tiêu cực tới môi trường phát thải khí nhà kính, trái đất nóng lên ô nhiễm ngành công nghiệp đốt nhiên liệu Trong loại lượng sinh học, ethanol loại lượng sinh học phổ biến thị trường giới sản xuất từ nguồn nguyên liệu tái tạo bắp, đường, mật rỉ hay phế phẩm sinh khối từ nông nghiệp Các quy trình sản xuất ethanol chủ yếu dựa trình lên men đường thu nhận từ loại tinh bột đường mía Do vậy, sản xuất ethanol gặp phải số lo ngại liên quan đến an ninh lương thực Giải pháp sử dụng nguồn sinh khối lignocellulose (LCB) đưa nhằm tận dụng lượng dồi loại lương thực sau vụ mùa, phần sinh khối thừa từ rừng khai thác, loại thực vật khác thủy phân đường phục vụ lên men mà không cạnh tranh với nguồn thực phẩm 1,2 Về cấu trúc, loại lignocellulose gồm thành phần polysaccharide lignin cấu trúc thành tế bào thực vật Ở thành tế bào thực vật, chuỗi polysaccharide cellulose hemicellulose liên kết chéo với tạo thành cấu trúc bền vững Hemicellulose bao phủ vi sợi cellulose hình liên kết cộng hóa trị với lignin Sự liên kết chặt chẽ vi sợi cellulose với thành phần polymer khác làm gia tăng độ cứng học thành tế bào thực vật Trọng lượng khô thành tế bào thực vật thường rơi vào khoảng 30 – 35% cellulose, 20 – 35% hemicellulose 10 – 25% lignin3 Để sử dụng nguồn lignocellulose, sinh khối giàu cellulose cần phá vỡ, nới lỏng cấu trúc thành tế bào trước sử dụng cho q trình chuyển hóa thành đường đơn thơng qua bước tiền xử lý phương pháp sinh học, vật lý, hay hóa học hoặc kết hợp phương pháp Chiến lược sử dụng enzyme thủy phân chất đánh giá khả thi nhiều mặt so với đường chuyển hóa hóa học khác suất cao hơn, lượng sản phẩm phụ tạo thấp, yêu cầu mức lượng thấp, quy trình vận hành nhẹ thân thiện với môi trường Các enzyme thủy phân tăng cường khả tiếp cận với vi sợi cellulose sau trình tiền xử lý chất, nhờ tăng hiệu suất thủy giải thành đơn phân cho trình lên men1 Tuy nhiên, enzyme truyền thống xử lý sinh khối hiệu thấp nên cần nhiều lượng enzyme bổ sung, dẫn đến giá thành phẩm tăng lên đáng kể Như vậy, tối ưu q trình chuyển hóa sinh khối hỗn hợp enzyme thủy giải xác định cần thiết kết hợp enzyme phổ rộng cellulase, hemicellulase số oxidoreductases hoạt động chất xử lý loại sinh khối khác Nhằm làm rõ chế thủy giải sinh khối số enyme, nghiên cứu thực phản ứng enzyme đơn lẻ phản ứng kết hợp loại enzyme khác Trong nghiên cứu Wood McCrae cellobiohydrolase (CBH) làm tăng trương nở cấu trúc sợi endoglucanases (EG) hoạt động Enzyme CBH EG ghi nhận có tác động tích cực lẫn trình thủy phân cellulose Hoạt động đồng thời Hình 1.1 Hiệu thủy phân sinh khối tăng lên phản ứng hiệp lực4 ... (DE3) tái tổ hợp, thực đề tài: ? ?Tối ưu điều kiện biểu AA9 polysaccharide monooxygenase tái tổ hợp hệ thống Escherichia coli” với nội dung bao gồm: - Khảo sát môi trường nuôi cấy tối ưu cho trình biểu. .. THÀNH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ NĂM 2021 - 2022 Tên đề tài: Tối ưu điều kiện biểu AA9 polysaccharide monooxygenase tái tổ hợp hệ thống Escherichia coli Số hợp đồng:... 1.4.3 Khảo sát điều kiện biểu protein tái tổ hợp Đối với hệ thống biểu để sản xuất protein tái tổ hợp, yếu tố truyền thống tối ưu nhằm nâng cao mức độ biểu tối ưu trình tự protein ngoại lại, trình