Thiết kế vector biểu hiện mang gen scfv kháng CD47 và biểu hiện protein trong vi khuẩn e coli

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Vân Anh THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN MANG GEN scFv KHÁNG CD47 VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN TRONG VI KHUẨN E coli LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Vân Anh THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN MANG GEN scFv KHÁNG CD47 VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN TRONG VI KHUẨN E coli Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420101.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Quang Huy TS Lã Thị Huyền Hà Nội - 2019 LỜI CẢM ƠN Khơng có thành cơng học viên mà khơng có hỗ trợ, giúp đỡ đóng góp Thầy Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, em nhận đƣợc hƣớng dẫn giúp đỡ Thầy cô Trƣờng đặc biệt Thầy cô Khoa Sau đại học Lời em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Quang Huy – Trƣởng khoa Hoá sinh Trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên Hà Nội, TS Lã Thị Huyền – Phịng cơng nghệ động vật viện hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam tận tình hƣớng dẫn dìu dắt em suốt thời gian em học tập hoàn thành luận văn Tiếp theo, em xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy, cô Khoa Sinh học – Đại học Khoa học Tự nhiên nhiệt tình giảng dạy tạo điều kiện giúp đỡ để em hồn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn toàn thể GS, TS, cán nghiên cứu Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện, ln tận tình sát bảo, chia sẻ kinh nghiệm cho em lời khuyên quý báu công việc cung nhƣ sống Và cuối cùng, tình cảm chân thành yêu mến em xin đƣợc gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình ngƣời thân, ngƣời ủng hộ, động viên tạo cho em điều kiện tốt tinh thần nhƣ vật chất suốt thời gian học tập thực tập Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Học viên Nguyễn Thị Vân Anh MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan bệnh ung thƣ 1.1.1 Ung thư .3 1.1.2 Ảnh hưởng bệnh ung thư 1.1.3 Nguyên nhân gây ung thư 1.2 Protein kháng nguyên CD47 kháng thể kháng CD47 .7 1.2.1 Protein kháng nguyên CD47- đích điều trị ung thư 1.3.3 Các thành tựu sử dụng kháng thể kháng CD47 điều trị ung thư 1.3 Kháng thể kháng thể đơn chuỗi ứng dụng điều trị bệnh ung thƣ 10 1.4 Mảnh kháng thể đơn chuỗi (scFv) 11 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Vật liệu 13 2.1.1 Hóa chất sinh phẩm 13 2.2 Thiết bị 13 2.3.1 Nhân gen mã hóa scFv kháng CD47 phản ứng PCR .14 2.3.2 Điện di gel agarose 14 2.3.5 Gắn nối sản phẩm PCR vào vector pET22b+ 16 2.3.6 Biến nạp sản phẩm gắn nối vào tế bào khả biến E.coli DH5α phương pháp sốc nhiệt 16 2.3.7 Tách plasmid từ vi khuẩn E.coli theo phương pháp mini-prep Sambrook 17 2.3.8 Chọn dòng plasmid tái tổ hợp mang gen antiHer2 phương pháp PCR 17 2.3.9 Quy trình biểu kháng thể kháng CD47 hệ thống biểu E.coli 18 2.3.10 Quy trình điện di protein SDS-PAGE 18 2.3.11 Tinh kháng thể anti-CD47 tái tổ hợp phương pháp sắc ký lực với Ni-NTA resin 19 2.3.12 Ni cấy dịng tế bào Jurkat 19 2.3.13 Phương pháp miễn dịch huỳnh quang 20 3.1 Kết nhân gen mã hóa kháng thể kháng CD47 22 3.2 Kết thiết kế vector biểu tái tổ hợp pET22b+ mang gen anti-CD47 22 3.2.1 Cắt vector pET22b+ sản phẩm PCR enzyme cắt giới hạn 22 3.2.2 Kết gắn tạo thành công vector tái tổ hợp mang gen anti-CD47 23 3.3 Kết biểu gen mã hóa kháng thể kháng CD47 hệ thống biểu E coli 28 3.4 Kết tinh kháng thể anti-CD47 29 3.5 Xác định khả liên kết đặc hiệu kháng thể anti-CD47 với kháng nguyên CD47 30 KẾT LUẬN 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Liệu pháp nhắm đích CD47/SIRPα Bảng 1.2 Các kháng thể nhắm đích CD47/SIRPα 10 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Bản đồ ung thƣ giới Hình 1.2 Bản đồ ung thƣ Việt Nam Hình 1.3: Đột biến bất hoạt gen ức chế khối u gây ung thƣ Hình 1.5: Mơ hình cấu trúc thụ thể CD47 .7 Hình 1.6 Các chế nhắm trúng đích đƣờng CD47- SIRPα ung thƣ .8 Hình 3.1 Kết nhân gen anti-CD47 phản ứng PCR 22 Hình 3.2 Cắt vector pET22b+ enzyme cắt giới hạn 23 Hình 3.3 Kết biến nạp sản phẩm gắn nối gen sản phẩm PCR (khuếch đại gen antiCD47) 24 Hình 3.4 Kiểm tra sơ dòng plasmid tái tổ hợp mang gen anti-CD47 25 Hình 3.5 Kiểm tra dịng plasmid mang gen anti-CD47 26 Hình 3.7 Kiểm tra biểu kháng thể kháng CD47 tế bào vi khuẩn E.coli 28 Hình 3.8 Kiểm tra độ tinh kháng thể anti-CD47 30 Hình 3.9 Khả liên kết đặc hiệu kháng thể anti-CD47 với kháng nguyên CD47 biểu bề mặt tế bào Jurkat 31 DANH SÁCH C Amp Am AML Tế Bp Ba CD47 Cl DNA De E coli Es EDTA Eth EtBr Eth HEK Tế HSC Tế IPTG Iso MCS Mu LB Lu LSC Tế NHL No OKT3 Or PEG Po RNA Ri V/p Vò Fc Kh SIRPα Sig ScFv Mả Fab Fra MỞ ĐẦU CD47 glycoprotein chuyển màng thuộc siêu họ globulin miễn dịch CD47 có khối lƣợng phân tử 50 kDa bao gồm vùng IgV ngoại bào chứa đầu N, vùng chuyển màng đuôi nội bào ngắn chứa đầu C CD47 liên kết đặc hiệu với số protein bao gồm integrins, thrombospondin-1, liên quan đến trình sinh lý tế bào nhƣ di tế bào, hoạt hóa tế bào T tế bào tua, phát triển sợi trục thần kinh [16] Ngồi ra, CD47 cịn phối tử đặc hiệu SIRPα Protein biểu bề mặt tế bào đại thực bào Tƣơng tác CD47-SIRPα ức chế trình thực bào đại thực bào tế bào tua [44] CD47 đƣợc xác định kháng nguyên ung thƣ buồng trứng ngƣời lần vào năm 1980 [17] Sau đó, CD47 đƣợc xác định biểu nhiều loại khối u ngƣời bao gồm AML, CML [11], ALL [7], bạch cầu không liêu quan đến lympho bào NHL [8], đa uy tủy [21], ung thƣ bàng quang [32] khối u rắn khác [11] Điều đặc biệt là, CD47 biểu yếu tế bào bình thƣờng biểu mạnh tế bào khối u Xác định mức độ biểu CD47 hai mẫu tế bào HSC tế bào LSC phƣơng pháp flow cytometry cho thấy mật độ kháng nguyên CD47 tế bào LSC cao tế bào HSC [10; 7] Định lƣợng CD47 mRNA mẫu máu ngoại vi nhóm gồm 132 bệnh nhân AML phƣơng pháp real-time PCR cho thấy hàm lƣợng CD47 mRNA bệnh nhân AML cao so với nhóm chứng [40] Các kết công bố cho thấy CD47 marker hữu dụng để nhận dạng LSC, AML số tế bào khối u khác mà đích để phát triển loại thuốc đặc hiệu liệu pháp miễn dịch tiêu diệt tế bào ung thƣ biểu kháng nguyên CD47 Ung thƣ máu cấp tính có tốc độ phát triển nhanh tủy xƣơng với biểu số kháng nguyên bề mặt bao gồm CD19, CD22, CD33, CD123, CD47 Trong đó, CD47 biểu mạnh tế bào ung thƣ máu tế bào gốc ung thƣ máu Tế bào gốc ung thƣ máu nhân tố tiềm tàng khiến cho bệnh ung thƣ máu dai dẳng, khó điều trị dứt điểm dễ tái phát Do đó, CD47 đích để cơng nhằm tiêu diệt tận gốc bệnh ung thƣ bạch cầu cấp tính Mảnh kháng thể scFv định dạng phổ biến mảnh kháng thể tái tổ hợp Mặc dù chúng đại diện nhỏ dạng kháng thể tái tổ hợp (26-28 kDa) nhƣng chúng cung cấp đầy đủ đặc tính kháng thể vị trí gắn kết kháng nguyên không bị thay đổi So với kháng thể đầy đủ chúng phức tạp hơn, bao gồm miền biến đổi chuỗi nặng kháng thể (VH) vùng biến đổi chuỗi nhẹ kháng thể (VL), VH VL đƣợc liên kết polypeptide linh hoạt Với đời công nghệ DNA tái tổ hợp từ năm 1970, protein bắt đầu đƣợc biểu nhiều dạng tái tổ hợp tế bào vi sinh vật cách nhanh thuận tiện so với nguồn tự nhiên Trong năm gần đây, kỹ thuật sản xuất protein tái tổ hợp hệ thống sinh học ngày đƣợc ứng dụng rộng rãi Trong đó, ―nhà máy‖ vi khuẩn đƣợc lựa chọn sử dụng nhiều ƣu điểm nhƣ chi phí thấp, sinh khối lớn tốc độ sản xuất nhanh Chủng biểu Escherichia coli chủng đƣợc sử dụng rộng rãi nghiên cứu nhƣ sản xuất protein tái tổ hợp Do đó, tác giả lựa chọn đề tài: ―Thiết kế vector biểu mang gen scFv kháng CD47 biểu protein vi khuẩn E.coli‖ với mục tiêu: Thiết kế thành công vector biểu mang gen scFv đặc hiệu CD47 biểu đƣợc protein vi khuẩn E.coli KẾT LUẬN Từ kết thu đƣợc cơng trình nghiên cứu này, chúng tơi đƣa số kết luận sau: Đã đƣa gen mã hóa kháng thể antiCD47 có kích thƣớc khoảng 900 bp vào vector biểu pET-22b+ Đã tạo đƣợc chủng biểu BL21 (DE3) có khả biểu kháng thể tái tổ hợp antiCD47 kích thuớc 39 kDa điện di SDS – PAGE xác định đuợc số điều kiện thích hợp để biểu protein tái tổ hợp scFv antiCD47 là: nồng độ o chất cảm ứng IPTG 0,5 mM; nhiệt độ nuôi cấy 37 C thu mẫu sau cảm ứng Đã buớc đầu tinh thành công protein tái tổ hợp scFv antiCD47 bƣớc đầu thử nghiệm tƣơng tác đặc hiệu với kháng nguyên đích CD47 dòng tế bào Jurkat phƣơng pháp miễn dịch huỳnh quang KIẾN NGHỊ Dựa vào kết thu đƣợc từ nghiên cứu này, mong muốn tiến hành thêm nghiên cứu: Tối ƣu hóa điều kiện biểu tinh kháng thể anti-CD47 quy mơ lớn Thử nghiệm sâu hoạt tính sinh học protein tái tổ hợp thu đƣợc 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo Tiếng Việt Bộ môn Ung thƣ (2005), Ung thư học đại cương, Đại học Y Hà Nội, Hà Nội PGS TS Nguyễn Bá Đức (2009), Bài giảng ung thư học, Nhà xuất Y học, Hà Nội Lê Quang Huấn, Lã Thị Huyền (2012), Kháng thể tái tổ hợp ứng dụng, Nội Lê Đình Sáng (2010), Bệnh học ung thư, Nhà xuất Y học, Hà dục PSG TS Phạm Văn Ty (2008), Miễn dịch học, Nhà xuất giáo Tài liệu tiếng Anh Huang Y, Ma Y, Gao P, Yao Z(2017) Targeting CD47: the achievements and concerns of current studies on cancer immunotherapy J Thorac Dis:E168 – E174 JaiswalS,JamiesonCH,PangWW(2009)CD47isupregulatedoncirculat ing hematopoietic stem cells and le ukemia cells to avoid phagocytosis Cell; 138:271 – 285 Pang WW(2013), Pluvinage JV, Price EA, et al Hematopoietic stem cell and progenitor cell mechanisms in myelodysplastic syndromes Proc Natl Acad Sci USA; 110:3011 – 3016 Chao MP (2011), Alizadeh AA, Tang C, Jan M, Weissman- Tsukamoto R, Zhao F, Park CY, Weissman IL, Majeti R Therapeutic antibody targeting of CD47 eliminates human acute lymphoblastic leukemia Cancer Res;71 (4):1374–1384 10 Chao MP, Alizadeh AA, Tang C(2010) Anti-CD47 antibody synergizes with rituximab to promote phagocytosis and eradicate nonHodgkin lymphoma Cell; 142:699–713 34 11 Chao MP (2012), Weissman IL, Majeti R The CD47-SIRP alpha pathway in cancer immune evasion and potential therapeutic implications Curr Opin Immunol 24:225–232 12 Willingham SB, Volkmer JP, Gentles AJ, etal.(2012)The CD47- signal regulatory protein alpha (SIRPa) interaction is a therapeutic target for human solid tumors Proc Natl Acad Sci U S A; 109:6662–6667 13 BetancurPA,AbrahamBJ,YiuYY,etal(2017).ACD47-associatedsuper- enhancer links pro-inflammatory signalling to CD47 upregulation in breast cancer Nat Commun; 8:14802 14 Wernig G, Chen S-Y, Cui L, et al(2017) Unifying mechanism for different fibrotic diseases Proc Natl Acad Sci U S A; 114:4757–4762 15 Kojima Y, Volkmer JP, McKenna K, et al(2016) CD47 blocking antibodies restore phagocytosis and prevent atherosclerosis Nature; 536:86 – 90 16 Yoshida K, Tsujimoto H, Matsumura K et al(2015) CD47 is an adverse prognostic factor and a therapeutic target in gastric cancer Cancer Med 4(9), 1322–1333 17 Liu R, Wei H, Gao P et al(2017) CD47 promotes ovarian cancer progression by inhibiting macrophage phagocytosis Oncotarget 8(24), 39021–39032 18 Li Y, Lu S, Xu Y et al (2017).Overexpression of CD47 predicts poor prognosis and promotes cancer cell invasion in high-grade serous ovarian carcinoma Am J Transl Res 9(6), 2901–1910 19 Tong, B., & Wang, M (2018) CD47 is a novel potent immunotherapy target in human malignancies: current studies and future promises Future Oncology doi:10.2217/fon-2018-0035 (bài gốc) 20 Jefferis, R Recombinant antibody therapeutics(2009): The impact of glycosylation on mechanisms of action Trends Pharmacol Sci, 30, 356– 362 21 Li, F.; Vijayasankaran, N.; Shen, A.; Kiss, R.; Amanullah, A(2010) Cell culture processes for monoclonal antibody production MAbs, 2, 466– 479 35 22 Striedner, G.; Pfaffenzeller, I.; Markus, L.; Nemecek, S.; Grabherr, R.; Bayer, K Plasmid-free(2010)T7-based Escherichia coli expression systems Biotechnol Bioeng 23 Mairhofer, J.; Cserjan-Puschmann, M.; Striedner, G.; Nöbauer, K.; Razzazi-Fazeli, E.; Grabherr, R Marker-free(2010) plasmids for gene therapeutic applications—Lack of antibiotic resistance gene substantially improves the manufacturing process J Biotechnol 24 Sonoda, H.; Kumada, Y.; Katsuda, T.; Yamaji, H(2011) Effects of cytoplasmic and periplasmic chaperones on secretory production of singlechain Fv antibody in Escherichia coli J Biosci Bioeng 25 Yuan, J.; Zweers, J.C.; Van Dijl, J.M.; Dalbey, R.E.(2010) Protein transport across and into cell membranes in bacteria and archaea Cell Mol Life Sci, 67, 179–199 26 Levy, R.; Ahluwalia, K.; Bohmann, D.J.; Giang, H.M.; Schwimmer, L.J.; Issafras, H.; Reddy, N.B.; Chan, C.; Horwitz, A.H.; Takeuchi, T.(2013) Enhancement of antibody fragment secretion into the Escherichia coli periplasm by co-expression with the peptidyl prolyl isomerase, FkpA, in the cytoplasm J Immunol Methods 27 Costa S., Almeida A., Castro A., et al (2014) Fusion tags for protein solubility, purification and immunogenicity in Escherichia coli: the novel Fh8 system Front Microbiol, 28 Jalalirad, R(2013) Production of antibody fragment (Fab) throughout Escherichia coli fed-batch fermentation process: Changes in titre, location and form of product Electron J Biotechnol 29 Ecker, D.M.; Jones, S.D.; Levine, H.L (2015) The therapeutic monoclonal antibody market MAbs, 30 Müller, D.; Kontermann, R.E(2014) Bispecific Antibodies In Handbook of Therapeutic Antibodies, 2nd ed.; Wiley-Blackwell: Hoboken, NJ, USA; ISBN 9783527682423 36 31 Drake, P.M.; Rabuka, D(2015) An emerging playbook for antibody- drug conjugates: Lessons from the laboratory and clinic suggest a strategy for improving efficacy and safety Curr Opin Chem Biol, 28, 174–180 32 Nelson(2010), A.L Antibody fragments: Hope and hype MAbs, 2, 77–83 33 Fernandes,J.C(2018) Therapeutic application of antibody fragments in autoimmune diseases: Current state and prospects Drug Discov Today, 23, 1996–2002 34 Kholodenko, R.V.; Kalinovsky, D.V.; Doronin, I.I.; Ponomarev, E.D.; Kholodenko, I V(2017)Antibody Fragments as Potential Biopharmaceuticals for Cancer Therapy: Success and Limitations Curr Med Chem 35 Bird, R.E.; Hardman, K.D.; Jacobson, J.W.; Johnson, S.; Kaufman, B.M.; Lee, S.M.; Lee, T.; Pope, S.H.; Riordan, G.S.; Whitlow, M (1988)Single-chain antigen-binding proteins 36 Huston, J.S.; Levinson, D.; Mudgett-Hunter, M.; Tai, M.S.; Novotný, J.; Margolies, M.N.; Ridge, R.J.; Bruccoleri, R.E.; Haber, E.; Crea, R.(1988) Protein engineering of antibody binding sites: Recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli Proc Natl Acad Sci USA, 85, 5879–5883 37 Montoliu-Gaya,L.;Esquerda-Canals,G.;Bronsoms,S.;Villegas,S (2017)Production of an anti-Aβ antibody fragment in Pichia pastoris and in vitro and in vivo validation of its therapeutic effect PLoS ONE 38 Spadiut, O.; Capone, S.; Krainer, F.; Glieder,A.; Herwig,C.(2014) Microbials for the production of monoclonal antibodies and antibody fragments Trends Biotechnol, 32, 54–60 39 Yokota, T.; Milenic, D.E.; Whitlow, M.; Schlom, J.(1992) Rapid Tumor Penetration of a Single-Chain Fv and Comparison with Other Immunoglobulin Forms Cancer Res 37 40 Li, Z.; Krippendorff, B.F.; Sharma, S.; Walz, A.C.; Lavé, T.; Shah, D.K.(2016) Influence of molecular size on tissue distribution of antibody fragments Mabs 41 Cumber, A.J.; Ward, E.S.; Winter, G.; Parnell, G.D.; Wawrzynczak, E.J (1992)Comparative stabilities in vitro and in vivo of a recombinant mouse antibody FvCys fragment and a bisFvCys conjugate J Immunol, 149, 120– 126 42 Sanz, L.; Cuesta, Á.M.; Compte, M.; Álvarez-Vallina, L (2005)Antibody engineering: Facing new challenges in cancer therapy Acta Pharmacol Sin, 26, 641–648 43 Jain, A.; Jain, S PEGylation(2008): An approach for drug delivery A review Crit Rev Drug Carr Syst 44 Müller, D.; Karle, A.; Meißburger, B.; Hưfig, I.; Stork, R.; Kontermann, R.E(2007) Improved pharmacokinetics of recombinant bispecific antibody molecules by fusion to human serum albumin J Biol Chem 45 Poiron, C.; Wu, Y.; Ginestoux, C.; Ehrenmann, F.; Duroux, P.; Lefranc, M ® ® (2008)IMGT , the international ImMunoGeneTics information system Nucleic Acids Res , 37 (Suppl S1), D1006–D1012 46 Brinkmann, U.; Kontermann, R.E.(2017)The making of bispecific antibodies MAbs , 9, 182–212 47 Holt, L.J.; Basran, A.; Jones, K.; Chorlton, J.; Jespers, L.S.; Brewis, N.D.; Tomlinson, I.M.(2008) Anti-serum albumin domain antibodies for extending the half-lives of short lived drugs Protein Eng Des Sel 38 PHỤ LỤC 1.2 Phụ lục 1.3 Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn 1.4 Phụ lục Các dung dịch tách plasmid Dung dịch Dung dịch I Dung dịch II Dung dịch III (100 ml) 39 Thành phần gel Polyacrylamide Gel phân tách Gel cô Thành phần H2 O Tris-HCl (pH 6,8; M) Acrylamide APS 10% SDS 10% Temed Các dung dịch nhuộm, tẩy gel SDS-PAGE 40 5X Sample (loading) buffer Thành phần SDS Tris (pH 6.8) 0.5 M Sucrose β- Mercaptoethanol EDTA (pH 7.0) 0.1M Bromphenol blue 1% Nước khử ion Dung dịch đệm PBS 1X, pH 7.0 – 7.3 Dung dịch đệm TAE 50X 41 ... pET22b+ nhằm tạo vector tái tổ hợp mang gen anti -CD47 3.2 Kết thiết kế vector biểu tái tổ hợp pET22b+ mang gen anti -CD47 3.2.1 Cắt vector pET22b+ sản phẩm PCR enzyme cắt giới hạn Vector pET22b+ sản... biểu Escherichia coli chủng đƣợc sử dụng rộng rãi nghiên cứu nhƣ sản xuất protein tái tổ hợp Do đó, tác giả lựa chọn đề tài: ? ?Thiết kế vector biểu mang gen scFv kháng CD47 biểu protein vi khuẩn E. coli? ??... Therapeutics Inc cao Kháng thể lƣỡng tính Alexo Therapeutics kháng đầy đủ CD47/ CD19 Kháng thể Novimmune đầy đủ kháng CD47/ Tioma Therapeutics mesothelin Kháng thể Surface Oncology kháng CD47 Kháng