Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện đoạn gen mã hóa độc tố apx IA từ actinobacillus pleuropneumoniae​

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HOÀNG THỊ HUYỀN TRANG TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN ĐOẠN GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ APXIA TỪ ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên, 2018 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HOÀNG THỊ HUYỀN TRANG TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN ĐOẠN GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ APXIA TỪ ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM MÃ SỐ: 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Cán hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Thu Ngà PGS TS Dương Văn Cường Thái Nguyên, 2018 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tôi, hướng dẫn TS Nguyễn Thị Thu Ngà PGS.TS Dương Văn Cường Các số liệu trích dẫn rõ ràng, kết luận văn trung thực Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm kết nghiên cứu luận văn Thái Nguyên, ngày 20 tháng năm 2018 Tác giả luận văn Hoàng Thị Huyền Trang i LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới TS Nguyễn Thị Thu Ngà PGS.TS Dương Văn Cường tận tình hướng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô, cán Bộ môn Di truyền & Sinh học đại, khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên, cảm ơn cán phòng Sinh học phân tử & Công nghệ tế bào - Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên, cảm ơn Công ty thuốc thú y Đức Hạnh Marphavet tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình học tập, thực thí nghiệm đề tài Tơi xin bày tỏ lời cảm ơn đến gia đình, bè bạn động viên khuyến khích giúp đỡ trình làm đề tài Tác giả luận văn Hồng Thị Huyền Trang ii MỤC LỤC Trang TRANG BÌA PHỤ LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG ĐỀ TÀI iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi MỞ ĐẦU 1 Lí chọn đề tài Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh viêm màng phổi lợn vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae 1.1.1 Bệnh viêm màng phổi lợn 1.1.2 Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae 1.2 Độc tố Apx chế gây bệnh 1.2.1 Ngoại độc tố Apx 1.2.2 Các yếu độc lực khác 10 1.2.3 Cơ chế gây bệnh 11 1.2.4 Gen mã hóa protein ApxIA 12 1.3 Vaccine phòng bệnh viêm màng phổi A pleuropneumoniae gây .12 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Vật liệu, địa điểm, thời gian nghiên cứu 14 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 14 2.1.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 15 iii 2.2 Phương pháp nghiên cứu 15 2.2.1 Nghiên cứu thông tin gen thiết kế cặp mồi nhân gen 15 2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 15 2.2.3 Phương pháp PCR 16 2.2.4 Phương pháp gắn gen vào vector tách dòng biểu .17 2.2.5 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến 18 2.2.6 Phương pháp cắt kiểm tra 19 2.2.7 Phương pháp xác định phân tích trình tự DNA 20 2.3 Hóa chất trang thiết bị nghiên cứu 20 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 23 3.1 Kết tách dịng xác định trình tự đoạn gen ApxIA A.pleuropneumoniae 23 3.1.1 Kết PCR nhân đoạn gen ApxIA 23 3.1.2 Kết biến nạp đoạn gen ApxIA vào vector tách dịng pGEM 24 3.1.3 Phân tích trình tự đoạn gen ApxIA 25 3.2 Kết thiết kế vector biểu đoạn gen mã hóa độc tố ApxIA .28 3.2.1 Kết sàng lọc dòng plasmid mang vector biểu chứa đoạn gen ApxIA 28 3.2.2 Kết chọn lọc vector pET– ApxIA PCR cắt kiểm tra enzyme giới hạn 29 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 31 Kết luận 31 Đề nghị 31 01 CÔNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 iv CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG ĐỀ TÀI App Actinobacillus pleuropneumoniae bp Base pair DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP Deoxynucleotide triphosphate Kb Kilo base LPS Lipopolysaccharide NAD Nicotinamide Adenine Dinucleotide PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi TAE Tris - Acetate - EDTA Taq Thermus aquaticus iv DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Tỷ lệ lợn bị viêm màng phổi số nước châu Âu Bảng 2.1 Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng 17 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng gắn gen vào vector biểu 17 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng cắt plasmid BamHI HindIII .19 Bảng 2.4 Danh mục loại hóa chất sử dụng nghiên cứu 20 Bảng 2.5 Trang thiết bị sử dụng nghiên cứu 21 Bảng 3.1 Vị trí sai khác trình tự nucleotide gen ApxIA A.pleuropneumoniae serotype 5a ApxIA (GQ369732.1) .28 v DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Phổi lợn bị nhiễm trùng Actinobacillus pleuropneumoniae Hình 1.2 Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae Hình 2.1 Sơ đồ vector pGEM®-T Easy Promega 14 Hình 2.2 Sơ đồ vector biểu pET-28a (+) 14 Hình 2.3 Sơ đồ thí nghiệm thiết kế vector biểu pET - ApxIA 22 Hình 3.1 Kết nhân gen ApxIA từ App serotype 5a 23 Hình 3.2 Khuẩn lạc mang plasmid mơi trường chọn lọc 24 Hình 3.4 Kết cắt vector pGEM- ApxIA enzyme BamHI HindIII 25 Hình 3.5 Kết so sánh trình tự nucleotide ApxIA A.pleuropneumoniae serotype 5a phân lập ApxIA (GQ369732.1) Genbank 26 Hình 3.6 Kết so sánh trình tự amino acid suy diễn từ đoạn gen ApxIA A pleuropneumoniae serotype 5a phân lập ApxIA (GQ369732.1) Genbank 27 Hình 3.7 Kết tách plasmid dịng có khả mang pET-ApxIA .29 Hình 3.8 Kết chọn lọc dòng vi khuẩn mang vector pET-ApxIA PCR với cặp mồi đặc hiệu Apx 29 Hình 3.9 Kết chọn lọc dòng vi khuẩn mang vector pET-ApxIA cắt enzyme BamHI HindIII 30 vi MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Lợn vật nuôi chiếm tỷ trọng cao ngành chăn nuôi Việt Nam Tuy nhiên, với phát triển ngành chăn ni dịch bệnh phát sinh, lây lan gây thiệt hại lớn kinh tế Bệnh viêm màng phổi lợn số bệnh thuộc hội chứng hô hấp phức hợp, ghi nhận nhiều nước giới, nơi có ngành chăn ni lợn phát triển Bệnh có ảnh hưởng lớn đến suất đàn lợn với tỷ lệ chết lên đến 20% có dịch cấp tính xảy Tuy nhiên, thiệt hại gián tiếp bệnh thể mãn tính gây tăng trọng ngày giảm 50 gram chí phí thuốc cho điều trị cao nhiều so với tỷ lệ chết Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae từ lâu nghiên cứu nhiều xác định nguyên nhân gây nên bệnh viêm màng phổi lợn Nhiều công bố cho thấy, mức độ độc lực khác serotype vi khuẩn A pleuropneumoniae phần lớn có liên quan đến ngoại độc tố (Apx) sản sinh từ vi khuẩn đóng vai trị q trình gây bệnh cho lợn Độc lực vi khuẩn A.pleuropneumoniae có liên quan đến bốn loại protein độc tố, độc tố ApxI có độc lực cao, gây dung huyết có hoạt tính gây độc tế bào mạnh hướng đại thực bào phế nang bạch cầu trung tính Hiện để phịng bệnh viêm màng phổi vi khuẩn A pleuropneumoniae gây chủ yếu sử dụng vaccine nhược độc Đây loại vaccine có giá thành cao, miễn dịch bảo hộ chuột lợn thí nghiệm thất thường không ổn định Trong năm gần đây, việc ứng dụng kỹ thuật di truyền sản xuất vaccine quan tâm, tạo vaccine hệ khắc phục nhược điểm loại vaccine truyền thống vaccine nhược độc 3.1.2 Kết biến nạp đoạn gen ApxIA vào vector tách dòng pGEM Sản phẩm PCR đoạn gen ApxIA tinh sử dụng cho phản ứng gắn nối vào vector pGEM (kích thước 3015 bp) để tạo vector tái tổ hợp pGEM – ApxIA Kết biến nạp thể hình 3.2 cho thấy thu khuẩn lạc trắng khuẩn lạc xanh đĩa biến nạp vector pGEM – ApxIA Hình 3.2 Khuẩn lạc mang plasmid môi trường chọn lọc Tế bào chứa plasmid phát triển mơi trường có chứa kháng sinh Ampicillin Các tế bào mang plasmid tái tổ hợp có chứa đoạn chèn xen vào gen LacZ không tạo protein LacZ để chuyển hóa chất Xgal, tế bào phát triển thành khuẩn lạc trắng Trái lại, tế bào mang plasmid tự đóng vịng, có khả chuyển hóa chất X-gal, với có mặt chất cảm ứng IPTG phát triển thành khuẩn lạc xanh Sáu khuẩn lạc trắng khuẩn lạc xanh (làm đối chứng) lựa chọn để nuôi tăng sinh tách plasmid Kết tách chiết plasmid trình bày hình 3.3 Hình 3.3 Kết tách plasmid dịng có khả mang đoạn gen ApxIA (ĐC: plasmid tách từ khuẩn lạc xanh; 1-3, 4-6 : plasmid tách từ dòng khuẩn lạc trắng) 24 Kết hình 3.3 cho thấy, tách chiết plasmid dòng khuẩn lạc Vector pGEM gốc (3015 bp) gắn đoạn gen ApxIA (~ 0,8kb) nên kích thước lớn vector gốc (tự đóng vịng - khơng mang đoạn xen) Vì vậy, khoảng cách di chuyển gel điện di thể hình 3.3 plasmid tách từ khuẩn lạc xanh xa plasmid tách từ khuẩn lạc trắng Plasmid dòng số lựa chọn để cắt hai loại enzyme hạn chế BamHI HindIII cho hai phân đoạn DNA có kích cỡ khoảng kb 0,8 kb (Hình 3.4) Trong đó, phân đoạn DNA xấp xỉ 0,8 kb đoạn gen đích (ApxIA) cần thu nhận Sản phẩm cắt hạn chế có kích thước khoảng xấp xỉ 0,8 kb (Hình 3.4) thơi gel để thu nhận gen ApxIA phục vụ cho phân tích trình tự thiết kế vector biểu M kb kb Hình 3.4 Kết cắt vector pGEM- ApxIA enzyme BamHI HindIII (M: DNA GeneRuler TM kb Thermo Sientific; 1: sản phẩm cắt pGEM-ApxIA) 3.1.3 Phân tích trình tự đoạn gen ApxIA Đoạn gen ApxIA A pleuropneumoniae serotype 5a tách dịng có kích thước 801 bp Kết so sánh trình tự nucleotide gen ApxIA tách dịng ApxIA (GQ369732.1) chương trình BLAST NCBI cho thấy mức độ tương đồng gen 99% Sự tương đồng gen vị trí nucleotide tương ứng với vị trí nucleotid 2269 đến 3069 bp gen ApxIA có mã số GQ369732.1 (Hình 3.5) 25 Hình 3.5 Kết so sánh trình tự nucleotide ApxIA A pleuropneumoniae serotype 5a phân lập ApxIA (GQ369732.1) Genbank 26 Trình tự amino acid suy diễn đoạn gen mã hóa cho 266 amino acid tương ứng từ vị trí amino acid 755 đến 1022 protein ApxIA gen ApxIA (GQ369732.1) mã hóa (Hình 3.6) Hình 3.6 Kết so sánh trình tự amino acid suy diễn từ đoạn gen ApxIA A pleuropneumoniae serotype 5a phân lập ApxIA (GQ369732.1) Genbank Phân tích trình tự nucleotide tương đồng gen cho thấy, có vị trí sai khác thể bảng 3.1 Sự sai khác nucleotide tương ứng với vị trí nucleotide 2318 gen ApxIA (GQ369732.1) không dẫn đến thay đổi amino aicd, sai khác tương ứng với vị trí nucleotide 2321 2322 dẫn đến thay đổi amino acid Pro thành Gln (Hình 3.5 3.6) Tuy nhiên amino acid bị thay đổi acid amin 774 không nằm vùng RTX C-terminal domain 27 Bảng 3.1 Vị trí sai khác trình tự nucleotide gen ApxIA A.pleuropneumoniae serotype 5a ApxIA (GQ369732.1) STT Như vậy, đoạn gen phân lập mã hóa cho 119 amino acid thuộc vùng peptidase_M10_C trọn vẹn 147 amino acid thuộc vùng RTX C - terminal domain protein ApxIA, đủ điều kiện để tiến hành nghiên cứu tiếp Theo 3.2 Kết thiết kế vector biểu đoạn gen mã hóa độc tố ApxIA 3.2.1 Kết sàng lọc dòng plasmid mang vector biểu chứa đoạn gen ApxIA Khi phân lập trình tự mã hóa độc tố ApxIA có kích thước 801 bp từ DNA tổng số A pleuropneumoniae serotype 5a sử dụng cặp mồi thiết kế mang vị trí nhận biết BamHI HindIII Do đó, để đưa trình tự gen đoạn ApxIA vào vector biểu pET28a, hai vector pGEM-ApxIA pET28a xử lý đồng thời với BamHI HindIII Sau tinh sản phẩm cắt giới hạn từ gel agarose, trình tự mã hóa ApxIA chèn vào vị trí đa điểm cắt vector biểu pET28a tác dụng enzyme T4 ligase biến nạp vào tế bào khả biến E coli chủng BL21 Sau biến nạp sản phẩm gắn nối gen ApxIA vào vector pET-28a ( mở vòng thu khuẩn lạc,chọn ngẫu nhiên dòng khuẩn lạc để tách chiết plasmid, thu kết quảƯ hình 3.7 28 Hình 3.7 Kết tách plasmid dịng có khả mang pET-ApxIA ( 1-5: plasmid tách từ khuẩn lạc) Kết điện di cho thấy dòng khuẩn lạc, dòng 1, 2, 3, 4, xuất băng sáng cao so với đối chứng, dịng vector pET-28a (+) mang đoạn gene ApxIA 3.2.2 Kết chọn lọc vector pET– ApxIA PCR cắt kiểm tra enzyme giới hạn Plasmid dòng khuẩn lạc sử dụng để PCR kiểm tra với cặp mồi đặc hiệu, kết thu hình 3.8 M kb Hình 3.8 Kết chọn lọc dòng vi khuẩn mang vector pET-ApxIA PCR với cặp mồi đặc hiệu Apx (1-5: Sản phẩm PCR dòng khuẩn lạc pETTN-ApxIA; M: DNA GeneRuler kb Thermo Sientific) TM Dựa kết hình 3.8 thấy plasmid dịng 1, khơng xuất band vị trí xấp xỉ kb plasmid dịng 1, khơng mang đoạn gen ApxIA, 29 dịng mang plasmid pET - 28a tự đóng vịng Trong đó, plasmid dòng 3, 4, xuất band xấp xỉ kb, điều chứng tỏ plasmid mang đoạn gen ApxIA Để khẳng định chắn plasmid 3,4,5 mang đoạn gen ApxIA, plasmid tiến hành cắt kiểm tra enyme BamHI HindIII Vector pET28a có kích thước 5493 bp gắn thêm đoạn gene ApxIA 801 bp, vector pET-ApxIA có kích thước 6294 bp, theo lý thuyết cắt enzyme BamHI HindIII thu đuợc đoạn có kích thước 5493 bp đoạn có kích thước 801 bp M3 kb Hình 3.9 Kết chọn lọc dịng vi khuẩn mang vector pET-ApxIA cắt enzyme BamHI HindIII (1-5: Sản phẩm cắt dòng khuẩn lạc trắng pETTN-ApxIA; M: DNA GeneRuler TM kb Thermo Sientific) Kết hình 3.9 cho thấy, có dịng plasmid giếng 3, 4, thu từ khuẩn lạc trắng pET-ApxIA bị cắt văng đoạn, đoạn 0,8 kb tương ứng với kích thước đoạn gen ApxIA đoạn khoảng 5,5 kb tương ứng với kích thước vector pET -28a (+), kết phù hợp với kết kiểm tra PCR Các dịng plasmid số 1, khơng mang đoạn gen ApxIA nên cắt kiểm tra không tạo band xấp xỉ kb Như khẳng định thu plasmid chứa vector biểu mang gen mã hóa độc tố ApxIA 30 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Khuếch đại đoạn gen ApxIA chủng vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 5a có chiều dài 801 bp mã hóa cho 119 amino acid vùng peptidase_M10_C 147 amino acid vùng RTX C-terminal domain Thiết kế vector tách dòng pGEM – ApxIA mang đoạn gen mã hóa độc tố ApxIA Thiết kế vector biểu pET-ApxIA mang đoạn gen mã hóa độc tố ApxIA Đề nghị Tiếp tục thực nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, cảm ứng chủng E.coli mang vector biểu pET-ApxIA nhằm thu protein độc tố ApxIA vi khuẩn A.pleuropneumoniae serotype 5a 31 01 CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Hồng Thị Huyền Trang, Nguyễn Thị Thu Ngà, Dương Văn Cường, Phạm Bằng Phương (2018), “Tách dịng, phân tích trình tự đoạn gen mã hóa độc tố Apx IA từ Actinobacillus pleuropneumoniae”, Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ - ĐH Thái Nguyên, 180(04): tr 176 – 180 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO A TÀI LIỆU TRONG NƯỚC Lê Văn Dương (2013), Nghiên cứu số đặc tính sinh học vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida, Streptococcus suis gây viêm phổi hội chứng hô hấp sinh sản lợn Bắc Giang, biện pháp phòng trị, Luận án Tiến sĩ nông nghiệp, Đại học Thái Nguyên Nguyễn Thị Thu Hằng, Đỗ Ngọc Thúy, Cù Hữu Phú, Trương Văn Dung, Âu Xuân Tấn Lê Thị Minh Hằng (2009), “Ứng dụng kỹ thuật PCR để xác định độc tố (Apx) có vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae phân lập từ lợn bệnh số tỉnh phía Bắc Việt Nam” Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, 16 (4): 51-57 Trịnh Quang Hiệp, Cù Hữu Phú, Nguyễn Thu Hằng, Âu Xuân Tuấn (2004), “Xác định đặc tính sinh vật hoá học, độc lực vi khuẩn Actinobacillus, Pasteurella Streptocococcus gây bệnh viêm phổi lợn”, Tạp chí khoa học-cơng nghệ Bộ Nơng nghiệp Phát triền Nơng thơn, 4:476-477 B TÀI LIỆU NƯỚC NGỒI Bossé J.T., Janson H., Sheehan B.J., Beddek A.J., Rycroft A.N., Kroll J.S., Langford P.R (2002), “Actinobacillus pleuropneumoniae: pathobiology and pathogenesis of infection”, Microbes Infect, 4:225–235 Blackall P., Klaasen H., Van Den Bosch H., Kuhnert P., Frey J (2002), “Proposal of a new serovar of Actinobacillus pleuropneumoniae: serovar 15”, Veterinary Microbiology, 84: 47–52 Clinical and Laboratory Standards Institute (2014), “Performance Standards For Antimicrobial Susceptibility Testing”, Twenty-First Informational Supplement, M100-S24: 204pp Corina Pascu, Luminiia Costinar, V Herman, Ioana Vawduva, Sorina 33 Irimie (2010), “Assessment of biofilm formation in Actinobacillus pleuropneumoniae strains”, Veterinary Medicine Scientific Papers, 43(1):170-172 Dubreuil, Jacques, Mittal, & Gottschalk (2000), “Actinobacillus pleuropneumoniae surface polysaccharides: their role in diagnosis and immunogenicity”, Anim Health Res Rev, 1:73-93 Jäger H C., McKinley T J., Wood J L., Pearce G P., Williamson S., Strugnell B., Tucker A W (2012), “Factors associated with pleurisy in pigs: a case-control analysis of slaughter pig data for England and Wales”, PloS one, 7(2), e29655 10 Haimi-Hakala M., Hälli O., Laurila T., Raunio-Saarnisto M., Nokireki T., Laine T., & Oliviero C (2017), “Etiology of acute respiratory disease in fattening pigs in Finland, Porcine health management, 3(1), 19 11 Hiroya I T O., & SUEYOSHI M (2015), “The genetic organization of the capsular polysaccharide biosynthesis region of Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 15”, The Journal of Veterinary Medical Science, 77(4), 483 12 Inzana T J., Todd, J., Ma, J., & Veit H., (1991), “Characterization of a non-hemolytic mutant of Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 5: role of the 110 kilodalton hemolysin in virulence and immunoprotection”, Microbial pathogenesis, 10(4), 281-296 13 Menzel A., Beyerbach M., Siewert C., Gundlach M., Hoeltig D., Graage R., & Hennig-Pauka I (2014), “Actinobacillus pleuropneumoniae challenge in swine: diagnostic of lung alterations by infrared thermography”, BMC veterinary research, 10(1), 199 34 14 Moon J Y., Kang J Y., Seo J W., Kim W K., Choi Y H., Choi M S.,Hur J (2017), “Efficacy Evaluation of Combination Vaccine of Recombinant C-Terminal Fragments of ApxIA, ApxIIA and ApxIIIA in Piglets”, Sains Malaysiana, 46 (2): 217-221 15 Tremblay Y D., Labrie J., Chenier S., & Jacques M (2017), “Actinobacillus pleuropneumoniae grows as aggregates in the lung of pigs: is it time to refine our in vitro biofilm assays?”, Microbial biotechnology, 10(4), 756-760 16 Rayamajhi, Shin, Kang, Lee, Ahn, Yoo (2005), “Development and use of a multiplex polymerase chain reaction assay based on Apx toxin genes for genotypeing of Actinobacillus pleuropneumoniae isolates”, J Vet Diagn Invest, 17 (4): 359-362 17 Ramjeet M., Deslandes V., Gouré J., & Jacques M (2008), “Actinobacillus pleuropneumoniae vaccines: from bacterins to new insights into vaccination strategies”, Animal Health Research Reviews, 9(1), 25-45 18 Sassu E L., Frömbling J., Duvigneau J C., Miller I., Müllebner A., Gutiérrez, A M., & Menzel, A (2016), “Host-pathogen interplay at primary infection sites in pigs challenged with Actinobacillus pleuropneumoniae”, BMC veterinary research, 13(1), 64 19 Shin M K., Kang M L., Cha S B., Lee W J., Sung J H., Yoo, H S (2011), “An immunosorbent assay based on the recombinant ApxIa, ApxIIa, and ApxIIIa toxins of Actinobacillus pleuropneumoniae and its application to field sera”, Journal of veterinary diagnostic investigation, 23 (4):736-742 20 Shin S J., Bae J L., Cho Y W., Yang M S., Kim D H., Jang Y S., & Yoo H S (2003), “Expression of apxIA of Actinobacillus 35 pleuropneumoniae in Saccharomyces cerevisiae”, Journal of veterinary science, 4(3), 225-228 21 Van Overbeke, I., Chiers K., Charlier G., Vandenberghe I., Van Beeumen, J., Ducatelle R., & Haesebrouck F (2002), “Characterization of the in vitro adhesion of Actinobacillus pleuropneumoniae to swine alveolar epithelial cells”, Veterinary microbiology, 88(1):59-74 22 https://www.msdvetmanual.com/respiratory-system/respiratory- diseases-of-pigs/pleuropneumonia-in-pigs cập nhật ngày 20/6/2018 36 ... acid vùng RTX C-terminal domain Thiết kế vector tách dòng pGEM – ApxIA mang đoạn gen mã hóa độc tố ApxIA Thiết kế vector biểu pET-ApxIA mang đoạn gen mã hóa độc tố ApxIA Đề nghị Tiếp tục thực nghiên... lập tách dịng đoạn gen ApxIA mã hóa độc tố ApxIA vi khuẩn A pleuropneumoniae Nội dung 2: Thiết kế vector biểu pET -Apx IA mang đoạn gen mã hóa độc tố Apx IA vi khuẩn A pleuropneumoniae Chương TỔNG... gen ApxIA vào vector tách dịng pGEM 24 3.1.3 Phân tích trình tự đoạn gen ApxIA 25 3.2 Kết thiết kế vector biểu đoạn gen mã hóa độc tố ApxIA .28 3.2.1 Kết sàng lọc dòng plasmid mang vector