Thiết kế vector nhị thế mang gen mã hóa hemagglutinin từ virus cúm gia cầm để chuyển hóa vào bèo tấm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - HÀ HỒNG HẠNH ĐỀ TÀI: THIẾT KẾ VECTOR NHỊ THẾ MANG GEN MÃ HÓA HEMAGGLUTININ TỪ VIRUS CÚM GIA CẦM ĐỂ CHUYỂN HÓA VÀO BÈO TẤM LUẬN VĂN THẠC SỸ NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TRẦN THỊ PHƯƠNG LIÊN HÀ NỘI – 2010 LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Trần Thị Phương Liên – phòng Công nghệ ADN Ứng dụng – Viện Công nghệ Sinh học tận tình hướng dẫn dìu dắt trình hoàn thành luận văn Luận văn thực Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen với hỗ trợ kinh phí Đề tài nhánh “Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen H5N1 để chuyển vào bèo tấm” thuộc đề tài Nghiên cứu tạo giống bèo mang gen kháng nguyên H5N1 phòng chống bệnh cúm gia cầm thuộc Chương trình Công nghệ Sinh học Nông nghiệp 2007-2010 Tôi xin chân thành cảm ơn lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học thầy cô giáo Viện Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội giảng dạy tạo điều kiện cho học tập thực luận văn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể cán Phòng Công nghệ ADN Ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học, đặc biệt PGS TS Nông Văn Hải, TS Lê Thị Thu Hiền – Trưởng ,phó phòng Công nghệ ADN Ứng dụng nhiệt tình giúp đỡ cho lời khuyên góp ý quý báu trình thực luận văn Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình bạn bè động viên, giúp đỡ suốt trình học tập nghiên cứu Hà Nội, tháng 10 năm 2010 Tác giả luận văn Hà Hồng Hạnh LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chƣa đƣợc công bố công trình khác Hà nội, tháng 10 năm 2010 Tác giả luận văn Hà Hồng Hạnh CÁC TỪ VIẾT TẮT Amp Bp Car ddNTP DNA dNTP EDTA EtOH HA Kan Kb kDa LB PCR pJET pBT Rif RNA SDS TAE Tm v/p Ampicillin Cặp base (base pair) Carbenicillin Dideoxynucleoside triphosphate Deoxyribonucleotide acid Deoxynucleoside triphosphate Ethylenediaminetetraacetic acid Cồn (Ethanol) Hemagglutinin Kanamycin Kilo base (1kb=1000bp) Kilo Dalton Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn Luria Broth Phản ứng khuếch đại chuỗi polymerase(Polymerase Chain Reaction) Vector pJET 1.2/blunt Vector pBT Rifamycin Ribonucleic acid Sodium Dodecyl Sulphate Tris-Acetate-EDTA Nhiệt độ nóng chảy (melting temperature) vòng/phút TÊN VIẾT TẮT CÁC AMINO ACID Tên viết tắt Tên amino acid Ba chữ Một chữ Ala A Alanine Arg R Arginine Asn N Asparagine Asp D Aspartic acid (Aspartate) Cys C Cysteine Gln Q Glutamine Glu E Glutamic acid Gly G Glycine His H Histidine Ile I Isoleucine Lys K Lysine Met M Methionine Phe F Phenylalanine Pro P Proline Ser S Serine Thr T Threonine Trp W Tryptophan Tyr Y Tyrosine Val V Valine DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng Codon ƣu tiên sử dụng bèo tấm, thực vật (một, hai mầm) virus H5N1 24 Bảng Các chủng vi khuẩn đƣợc sử dụng 30 Bảng Môi trƣờng nuôi cấy chủng vi sinh vật 30 Bảng Các loại vector tách dòng vector biểu 31 Bảng Trình tự cặp mồi nhân gen HA, HA1 31 Bảng Trình tự cặp mồi kiểm tra gen nhân promoter 32 Bảng Trình tự cặp mồi cải biến đoạn gen HA1 34 Bảng Các vị trí đƣợc cải biến gen HA1 56 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Trang Hình Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (A), mô hình (B) virus cúm Hình Cấu trúc protein Hemagglutinin 12 Hình Bản đồ cấu trúc Ti-plasmid 16 Hình Sơ đồ vector nhị thể 18 Hình Cấu trúc hệ thống điều khiển gen Ubiquitin thực vật 20 Hình Sơ đồ minh họa phƣơng pháp Megaprimer 27 Hình Sơ đồ thí nghiệm thiết kế vector mang gen HA 33 Hình Sơ đồ minh họa vị trí cải biến phƣơng pháp Megaprimer 35 gen HA1 Sơ đồ cải biến gen HA1 theo phƣơng pháp Quickchange 36 Hình 10 Sơ đồ cải biến gen HA1 theo phƣơng pháp kéo dài đoạn gối lên 37 Hình 11 Hình ảnh điện di kết tách dòng gen HA 46 Hình 12 Hình ảnh điện di kết tách dòng gen HA1 47 Hình 13 Hình ảnh điện di kết cải biến vị trí MD2 48 Hình 14 Hình ảnh điện di kết cải biến vị trí MD5 50 Hình 15 Hình ảnh điện di kết cải biến vị trí MD3 51 Hình 16 Hình ảnh điện di kết cải biến vị trí MD4 52 Hình 17 Hình ảnh điện di kết cải biến vị trí M2 54 Hình 18 So sánh trình tự nucleotide amino acid gen HA1 HA1M 55 Hình Hình 19 Sơ đồ thiết kế vector pPAM mang gen HA1 57 Hình 20 Hình ảnh điện di kết thiết kế pPAM-HA1 59 Hình 21 Hình ảnh điện di sản phẩm pPAM-HA, pPAM- HA1M 60 Hình 22 Hình ảnh điện di sản phẩm SpUbiquitin 61 Hình 23 Hình ảnh điện di plasmid pPAM-Sp-HA1 62 Hình 24 Hình ảnh điện di plasmid pPAM-Sp-HA1M 63 Hình 25 Sơ đồ thiết kế vector pCAMBI-HA1 pCAMBIA-Sp-HA1 65 Hình 26 Sơ đồ cấu trúc SHA1N plasmid pJET-SHA1N 68 Hình 27 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt pJET-SHA1N, pJET-SHA1MN 68 Hình 28 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt pCAMBIA-HA1, pCAMBIAHA1M 70 Hình 29 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt pCAMBIA-Sp-HA1, pCAMBIA-SpHA1M 73 MỞ ĐẦU Cúm gà (avian influenza-AI) bệnh truyền nhiễm cấp tính loại gia cầm, thủy cầm, loại chim bị gây virus cúm týp A-một nhóm virus thuộc họ Orthomyxoviridae gây nên Cúm A/H5N1 virus có độc lực cao gây bệnh ngƣời năm 1996-2008 với biến đổi sâu sắc, gây chết gia cầm mà thích ứng gây chết ngƣời Đặc biệt, từ năm 2003 virus H5N1 gây dịch cúm gia cầm Hồng Kông, Trung Quốc lây lan sang hàng chục quốc gia giới châu Á, châu Âu châu Phi, có Việt Nam [8] Trong mƣời năm qua, giới có hàng trăm triệu gia cầm bị tiêu hủy, gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi kinh tế Một kháng nguyên bề mặt quan trọng cúm A/H5N1 Hemagglutinin (HA) Protein HA glycoprotein thuộc protein màng týp I (lectin), có khả gây ngƣng kết hồng cầu gà ống nghiệm Kháng thể đặc hiệu với HA phong tỏa ngƣng kết [72] Protein HA kháng nguyên chủ chốt virus cúm A, kích thích thể sinh đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với týp HA tham gia vào phản ứng trung hòa virus, đích bảo vệ miễn dịch học nhằm ngăn chặn xâm nhiễm virus thể nhiễm, sở điều chế vaccine phòng cúm [51], [59], [70] Đứng trƣớc nguy đại dịch cúm lớn việc phòng bệnh vaccine chiến lƣợc hữu hiệu cấp thiết Hiện nay, có số vaccine khác đƣợc sản xuất, nhƣng nhà khoa học giới tiếp tục phát triển loại vaccine có tính ƣu việt hơn, rẻ hơn, dễ bảo quản phân phối hơn, an toàn hiệu Vaccine thực vật loại vaccine dƣới đơn vị hay protein tái tổ hợp, đƣa vào thể theo đƣờng tiêu hóa, sản xuất hệ thống thực vật [20] Vaccin thực vật hạn chế đƣợc phá hủy ổn định bền vững thể, dễ dàng sản xuất khối lƣợng lớn có độ an toàn cao, dễ bảo quản, sử dụng thuận tiện có hiệu kinh tế Vaccine ăn đƣợc có khả kích thích thể sản xuất kháng thể hiệu nhƣ loại vaccine tiêm [22], [45] Nhƣ vậy, công nghệ gen thực vật mở hƣớng chế tạo vaccine với vấn đề cấp thiết đƣợc đặt ra: thiết kế vector hữu hiệu mang gen kháng nguyên virus, tìm đối tƣợng thực vật để chuyển gen tạo lƣợng protein tái tổ hợp lớn… Nhằm nâng cao khả biểu gen tái tổ hợp, nghiên cứu phân lập sử dụng đoạn điều khiển biểu gen đặc hiệu từ trồng vấn đề nghiên cứu đƣợc đặc biệt ý công nghệ gen thực vật Trong loại thực vật, bèo thực vật mầm, đối tƣợng nghiên cứu tƣơng đối mới, có hàm lƣợng protein polysaccharide cao Với đặc thù cấu trúc trình trao đổi chất, bèo đƣợc sử dụng công nghệ gen thực vật nhƣ nhà máy sản xuất protein tái tổ hợp Hiện nay, số nhóm giới tiến hành nghiên cứu thiết kế vector biểu kháng nguyên HA (H5N1) vịt, ngan để chuyển vào đậu tƣơng Tuy nhiên, việc tối ƣu codon gen HA virus cúm gà để biểu thực vật, nhƣ thiết kế vector mang promoter đặc thù để phục vụ chuyển gen vào bèo chƣa đƣợc nghiên cứu Với mục đích tạo sở ban đầu cho việc sản xuất vaccine cúm A/H5N1 ăn đƣợc từ bèo tấm, tiến hành nghiên cứu đề tài “Thiết kế vector nhị thể mang gen mã hóa Hemagglutinin từ virus cúm gia cầm để chuyển vào bèo tấm” với nội dung sau: Cải biến 4-5 vùng gen mã hóa Hemagglutinin từ virus cúm gà HG4 (mã số EF051513 từ chủng A/chicken/Vietnam/HG4/2005 (H5N1) sử dụng phƣơng pháp đột biến điểm Megaprimer, Quickchange, kéo dài đoạn gối lên Thiết kế vector nhị thể pPAM mang cấu trúc gen mã hóa Hemagglutinin (chƣa cải biến, cải biến) với promoter CAMV35S promoter gen Ubiquitin từ giống bèo Spirodela polyrrhiza để chuyển gen trực tiếp vào bèo Thiết kế vector nhị thể pCAMBIA1300 chứa gen mã hóa Hemagglutinin (chƣa cải biến, cải biến) với promoter CAMV35S promoter gen Ubiquitin từ giống bèo Spirodela polyrrhiza) biến nạp vào Agrobacterium để chuyển vào bèo thông qua vi khuẩn Agrobacterium Tài liệu tham khảo 16 Back E., Dunne W., Schneiderbauer A., De Framond A., Rasogi R., Tein S J (1991), "Isolation of the spinach nitrite redutase gene promoter which confer nitrate inducibility on GUS gene expression in transgenic tobacco”, Plant Mol Biol 17, pp 9-18 17 Bauer T T., Ewig S., Rodloff A C., Muller E E (2006), “Acute respiratory distress syndrome and pneumonia, a comprehensive review of clinical data”, Clin Infect Dis 43(6), pp 748-756 18 Bender C., Hall H., Huang J., Klimov A., Cox N., Hay A., Gregory V., Cameron K., Lim W., Subbarao K (1999), “Characterization of the surface proteins of influenza A (H5N1) viruses isolated from humans in 1997-1998”, Virology 254(1), pp 115-123 19 Bernard R G., Jack J P (2006), Molecular biotechnology Principles and applications of recombinant DNA Department of Biology, University of Waterloo, Waterloo, Ontario, Canada 20 Biemelt S S U., Galmbacher P, Wilmitzer L, Mueller M (2003), “Production of human pappillomavirus type 16 virus-like particles in transgenic plants”, J Virol 77, pp 9211-9220 21 Binet M N., Lepetit M., Weij J H., Tessier L H (1990), “Analysis of a sunflower polyubiquitin promoter by transient expression”, Plant Sci 79, pp 87-94 22 Bolivar FM W R., Funk V, Sentz D, Barrroso L, Wilkins TD, Petri W, Cramer CL (2003), “A non- toxic lectin for antigen delivery of plant – based mucosal vaccine”, Vaccine 21, pp 997-1005 23 Bosch F X., Garten W., Klenk H D., Rott R (1981), “Proteolytic cleavage of influenza virus Hemagglutinins, primary structure of the connecting peptide between HA1 and HA2 determines proteolytic cleavability and pathogenicity of Avian influenza viruses”, Virology 113(2), pp 725-735 24 Bruchmüller A, Marthe C, Hensel G, Sode B, Goedeke S, Borisjuk N, Brodzik R, Koprowski H, Jumlehn J (2007), “Expression of influenza A (H5N1) 80 Tài liệu tham khảo vaccine in barley grains for oral bird immunization”, J Consumer Protect Food Safety 1(2), pp 118 25 Callis J., Raasch J A., Vierstra R D (1990), “Ubiquitin extension proteins of Arabidopsis thaliana – structure, localization, and expression of their promoters in transgenic tobacco”, J Biol Chem 265, pp 12486-12493 26 Capua I., Alexander D J (2008), “Ecology, epidemiology and human health implications of avian influenza viruses, why we need to share genetic data”, Zoonoses Public Health 55(1), pp 2-15 27 Carol O., Tacket M (2007), “Plant-based vaccines against diarrheal diseases”, Trans Am Clin Climatol Assoc 118, pp 79–87 28 Carter P (1986), "Site-directed mutagenesis", Biochem J 237(1), pp 1-7 29 Chen H., Deng G., Li Z., Tian G., Li Y., Jiao P., Zhang L., Liu Z., Webster R G., Yu K (2004), “The evolution of H5N1 influenza viruses in ducks in southern China”, Proc Natl Acad Sci U S A 101(28), pp 10452-10457 30 Chih-Tung Tsai, Chih-Hung Lin, Chang C-Y (2007), “Analysis of codon usage bias and base compositional constraint in iridovirus genomes”, Virus Reseach 126, pp 196-206 31 Christensen A H., Sharrock R., Quail P H (1992), “Maize polyubiquitin genes, structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation”, Plant Mol Biol 18, pp 675-689 32 Collins R., Ko L., So K., Ellis T., Lau L., Yu A (2002), “Detection of highly pathogenic and low pathogenic avian influenza subtype H5 (Eurasian lineage) using NASBA”, J Virol Methods 103(2), pp 213-225 33 Conenello G M., Palese P (2007) “Influenza A virus PB1-F2: a small protein with a big punch”, Cell Host Microbe 2(4), pp 207-209 34 Cordula K., Boehm R., Voeste D., Barth S., (2002) Transient transformation of Wolffia columbiana by particle bombardment Aquatic Botany 72(2): pp 175181 81 Tài liệu tham khảo 35 D'Aoust M A., Lavoie P O., Couture M M., Trepanier S., Guay J M., Dargis M., Mongrand S., Landry N., Ward B J., Vezina L P (2008), “Influenza virus-like particles produced by transient expression in Nicotiana benthamiana induce a protective immune response against a lethal viral challenge in mice” Plant Biotechnol J 6(9), pp 930-940 36 Datta A K (1995), “Efficient amplification using 'Megaprimer' by asymmetric polymerase chain reaction”, Nucleic Acids Res 23(21), pp 4530-4531 37 Departer B S., Schilperoort R A (1992), “Structure and expression of a rootspecific rice gene”, Plant Mol Biol 18, pp 161-164 38 Dickey L., Cox K., Peele C (2007), “Expression control elements from the Lemnaceate family”, US Patent Appl 20070180583 39 Estruch J J., Carozzi N B., Desai N., Duck N B., Warren G W., Koziel M G (1997), "Transgenic plants, an emerging approach to pest control" Nat Biotechnol 15(2), pp 137-141 40 Fang LQ., de Vlas SJ., Liang S., Loooman CW (2008) Environment factors contributing to the spread of H5N1 avian influenza in mainland China PLoS ONEn 3(5): pp 2268 41 Fennoy S L., Bailey-Serres J (1993), "Synonymous codon usage in Zea mays L nuclear genes is varied by levels of C and G-ending codons", Nucleic Acids Res 21(23), pp 5294-5300 42 Giebel L B., Spritz R A (1990), “Site-directed mutagenesis using a doublestranded DNA fragment as a PCR mồi”, Nucleic Acids Res 18(16), pp 4947 43 Gustafsson C., Govindarajan S., Minshull J (2004), "Codon bias and heterologous protein expression", Trends Biotechnol 22(7), pp 346-353 44 Hampson A W., Mackenzie J S (2006), “The influenza viruses”, Med J Aust 185(10 Suppl), pp 39-43 45 Hernandez-Garcia C., Martinelli A., Bouchard R., Finer J (2009), “A soybean (Glycine max) polyubiquitin promoter gives strong constitutive expression in transgenic soybean”, Plant Cell Rep 28, pp 837-849 82 Tài liệu tham khảo 46 Higgs P G., Ran W (2008), "Coevolution of codon usage and tRNA genes leads to alternative stable states of biased codon usage", Mol Biol Evol 25(11), pp 2279-2291 47 Hoekema A., Hirsch P.R., Hooykaas P.J.J (1983), “A binary plant vector strategy based on separation of vir and T-region of the Agrobacterium tumefaciens Tiplasmid”, Nature 303, pp 179-180 48 Hooykaas P.J.J., Schilperoort R.A (1992), “Agrobacterium and plant genetic engineering”, Plant Molecular Biology 19, pp 15-38 49 Horimoto T., Kawaoka Y (1995), “The Hemagglutinin cleavability of a virulent avian influenza virus by subtilisin-like endoproteases is influenced by the amino acid immediately downstream of the cleavage site”, Virology 210(2), pp 466-470 50 Horimoto T., Kawaoka Y (2001), “Pandemic threat posed by acian influenza A viruses”, Clin Mcrobilol tev 14(1), pp 129-149 51 Horimoto T., Kawaoka Y (2006), “Strategies for developing vaccines against H5N1 influenza A viruses”, Trends Mol Med 12(11), pp 506-514 52 Horton R M (1995), "PCR-mediated recombination and mutagenesis", Mol Biotechnol 3(2), pp 93-99 53 Hui D S (2008), “Review of clinical symptoms and spectrum in humans with influenza A/H5N1 infection”, Respirology 13 Suppl 1, pp 10-13 54 Hulse-Post D J., Sturm-Ramirez K M., Humberd J., Seiler P., Govorkova E A., Krauss S., Scholtissek C., Puthavathana P., Buranathai C., Nguyen T D., Long H T., Naipospos T S., Chen H., Ellis T M., Guan Y., Peiris J S., Webster R G (2005), “Role of domestic ducks in the propagation and biological evolution of highly pathogenic H5N1 influenza viruses in Asia”, Proc Natl Acad Sci USA 102(30), pp 10682-10687 55 Ito T., Kawaoka Y (1998), “Avian influenza” In Nicholson KG, Webster RG, Hay AJ (eds) Textbook of influenza Blackwell Science Ltd., Oxford, United Kingdom, pp 126-136 83 Tài liệu tham khảo 56 Justewicz D M., Morin M J., Robinson H L., Webster R G (1995), “Antibodyforming cell response to virus challenge in mice immunized with DNA encoding the influenza virus Hemagglutinin”, J Virol 69(12), pp 7712-7717 57 Kammann, M., Laufs J., Schell J., Gronenborn B (1989), “Rapid insertional mutagensis of DNA by polymerase chain reaction (PCR)”, Nucleic Acids Res 17, pp 5404 58 Ke S H., Madison E L (1997), "Rapid and efficient site-directed mutagenesis by single-tube 'Megaprimer' PCR method" Nucleic Acids Res 25(16), pp 33713372 59 Keawcharoen J., Amonsin A., Oraveerakul K., Wattanodorn S., Papravasit T., Karnda S., Lekakul K., Pattanarangsan R., Noppornpanth S., Fouchier R A., Osterhaus A D., Payungporn S., Theamboonlers A., Poovorawan Y (2005), “Characterization of the Hemagglutinin and neuraminidase genes of recent influenza virus isolates from different avian species in Thailand”, Acta Virol 49(4), pp 277-280 60 Khandelwaal A S G., Shaila M S (2003), “Oral immunization of cattle with Hemagglutinin protein of rinderpest virus expressed in transgenic peanut induces specific immune responses”, Vaccine 21, pp 3282-3289 61 Khandelwaal A S G., Shaila M.S (2003), “Expression of Hemagglutinin protein of rinderpest virus in transgenic tobacco and immunogenicity of plany-derived protein a mouse model”, Virology 308(2), pp 207 62 Kodihalli S., Goto H., Kobasa D L., Krauss S., Kawaoka Y., Webster R G (1999), “DNA vaccine encoding Hemagglutinin provides protective immunity against H5N1 influenza virus infection in mice”, J Virol 73(3), pp 2094-2098 63 Kumar G B., Ganapathi T R., Revathi C J., Srinivas L., Bapat V A (2005), “Expression of hepatitis B surface antigen in transgenic banana plants”, Planta 222(3), pp 484-493 64 Lal P., Ramachandran V G., Goyal R., Sharma R (2007), “Edible vaccines, current status and future”, Indian J Med Microbiol 25(2), pp 93-102 84 Tài liệu tham khảo 65 Landolt E (1986), The family of Lemnaceae - a monographic study Vol.1, Veroff Geobot Inst ETH, Stiftung Rubel, Zurich, Heft 71 66 Li H Y., Ramalingam S., Chye M L (2006), “Accumulation of recombinant SARS-CoV spike protein in plant cytosol and chloroplasts indicate potential for development of plant-derived oral vaccines”, Exp Biol Med 231(8), pp 13461352 67 Liu M., Wood J M., Ellis T., Krauss S., Seiler P., Johnson C., Hoffmann E., Humberd J., Hulse D., Zhang Y., Webster R G., Perez D R (2003), “Preparation of a standardized, efficacious agricultural H5N3 vaccine by reverse genetics”, Virology 314(2), pp 580-590 68 Lu J., Sivamani E., L I X., Qu R (2008), “Activity of the 5’ regulatory regions of the rice polyubiquitin rubi3 gene in transgenic rice plants as analyzed by both GUS and GFP reporter genes”, Plant Cell Rep 27, pp 1587-1600 69 Marcondes J., Hansen E (2008), “Transgenic lettuce seedlings carrying hepatitis B virus antigen HBsAg”, Braz J Infect Dis 12(6), pp 469-471 70 Matrosovich M., Zhou N., Kawaoka Y., Webster R (1999), “The surface glycoproteins of H5 influenza viruses isolated from humans, chickens, and wild aquatic birds have distinguishable properties”, J Virol 73(2), pp 1146-1155 71 McElrroy D., Chamberlain D A., Moon E., Wilson K J (1995), “Development of gusA reporter gene constructs for cereal transformation, availability of plant transformation vectors from the CAMBIA molecular genetics resource serevice”, Mol Breed 1, pp 27-37 72 Murphy B., Webser R (1996), “Orthomyxoviruses” In Fields B N., Knipe D M., Howley PM, Fields virology, 3rd ed Lippincott - Raven Publishers, Philadelphia, Pa, pp 1397-1445 73 Murray E E., Lotzer J., Eberle M (1989), “Codon usage in plant genes”, Nucleic Acids Res 17(2), pp 477-498 74 Nwe N., He Q., Damrongwatanapokin S., Du Q., Manopo I., Limlamthong Y., Fenner B J., Spencer L., Kwang J (2006), “Expression of Hemagglutinin 85 Tài liệu tham khảo protein from the avian influenza virus H5N1 in a baculovirus/insect cell system significantly enhanced by suspension culture”, BMC Microbiol 6, pp 16 75 Okubaca P., Tobin E (2003), “Rice ubiquitin promoters: deletion analysis and potential usefulness in plant transformation systems”, Plant Cell Rep 22: 129134 76 Perlak F J., Fuchs R L., Dean D A., McPherson S L., Fischhoff D A (1991), "Modification of the coding sequence enhances plant expression of insect control protein genes" Proc Natl Acad Sci USA 88(8), pp 3324-3328 77 Peyre M., Fusheng G., Desvaux S., Roger F (2009), “Avian influenza vaccines, a practical review in relation to their application in the field with a focus on the Asian experience”, Epidemiol Infect 137(1), pp 1-21 78 Quiao C., Tian G., Jiang G., Li Y., Shi J., Yu K., Chen H (2006), “Vaccines developed for H5 highly pathogenic avian ìnluenza in China”, Ann N Y Acad Sci 1081:pp 182-192 79 Rocha E P (2004), "Codon usage bias from tRNA's point of view, redundancy, specialization, and efficient decoding for translation optimization", Genome Res 14(11), pp 2279-2286 80 Rothwell G W., Van M R., Ballard H E., Stockey R A (2004), "Effects of the polyubiquitin gene Ubi.u4 leader intron and first ubiquitin monomer on reporter gene expression in Nicotiana tabacum”, Plant Mol Biol 45: 655-667 81 Rybicki E P (2010), “Plant-made vaccines for humans and animals”, Plant Biotechnol J 8(5), pp 620-637 82 Sambrook J., Russell D (2001), Molecular cloning, A Laboratory manual, Cold spring Harbor laboratory press, Third edition, New York 83 Schnepf E., Crickmore N., Van Rie J., Lereclus D., Baum J., Feitelson J., Zeigler D R., Dean D H (1998), "Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins", Microbiol Mol Biol Rev 62(3), pp 775-806 86 Tài liệu tham khảo 84 Sharp P M., Bailes E., Grocock R J., Peden J F., Sockett R E (2005), "Variation in the strength of selected codon usage bias among bacteria", Nucleic Acids Res 33(4), pp 1141-1153 85 Shoji Y., Bi H., Musiychuk K., Rhee A., Horsey A., Roy G., Green B., Shamloul M., Farrance C E., Taggart B., Mytle N., Ugulava N., Rabindran S., Mett V., Chichester J A., Yusibov V (2009), “Plant-derived Hemagglutinin protects ferrets against challenge infection with the A/Indonesia/05/05 strain of avian influenza”, Vaccine 27(7): pp 1087-1092 86 Spitsin S., Andrianov V., Pogrebnyak N., Smirnov Y., Borisjuk N., Portocarrero C., Veguilla V., Koprowski H., Golovkin M (2009) “Immunological assessment of plant-derived avian flu H5/HA1 variants”, Vaccine 27(9): 12891292 87 Stefaniak B., Wozng A., Budna T (2002), “A gene showing sequence similarity to pectin esterase is spesificially expressed in developing pollen of Brassica napus Sequences in its 5’ flanking region are conserved in other pollen-specific promoter”, Plant Mol Biol 16: 501-513 88 Subbarao K., Luke C (2007), “H5N1 viruses and vaccines”, PLoS Pathog 3(3), pp 40 89 Swayne D E., Suarez D L (2000), “Highly pathogenic avian influenza”, Rev Sci Tech 19(2), pp 463-482 90 Takagi H., Hiroi T., Yang L., Tada Y., Yuki Y., Takamura K., Ishimitsu R., Kawauchi H., Kiyono H., Takaiwa F (2005), “A rice-based edible vaccine expressing multiple T cell epitopes induces oral tolerance for inhibition of Th2mediated IgE responses”, Proc Natl Acad Sci USA 102(48), pp 17525-17530 91 Tian G., Zhang S., Li Y., Bu Z., Liu P., Zhou J., Li C., Shi J., Yu K., Chen H (2005) “Protective efficacy in chickens, geese and ducks of an H5N1inactivated vaccine developed by reverse genetics”, Virology 341(1): pp 153162 87 Tài liệu tham khảo 92 Tran D D., Friedrich A., Becker S., Schnabl, Ham L H., and Boehm R (2006), "Expression of the gene encoding VP2 protein of Infectious Bursal Disease Virus in Wolffia australiana" 93 Tyagi R., Lai R., Duggleby R G (2004), "A new approach to 'Megaprimer' polymerase chain reaction mutagenesis without an intermediate gel purification step", BMC Biotechnol 4, pp 94 Tzfira T (2006) “Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology”, Curr Opin Biotechnol 17: pp 147-154 95 Vey M., Orlich M., Adler S., Klenk H D., Rott R., Garten W (1992), “Hemagglutinin activation of pathogenic avian influenza viruses of serotype H7 requires the protease recognition motif R-X-K/R-R”, Virology 188(1), pp 408413 96 Wagner R., Matrosovich M., Klenk H D (2002), “Functional balance between Hemagglutinin and neuraminidase in influenza virus infections”, Rev Med Virol 12(3), pp 159-166 97 Wagner R., Matrosovich M., Klenk H D (2002), “Functional balance between haemagglutinin and neuraminidase in influenza virus infections”, Rev Med Virol 12(3): pp 159-166 98 Walkerpeach C.R., Velten J (1994), "Agrobacterium - mediated gene transfer to plant cells, cointegrate and binary vector systems" Plant Molecular Biology Manual B1, pp 1-19 99 Wang L., Roossinck M J (2006), "Comparative analysis of expressed sequences reveals a conserved pattern of optimal codon usage in plants", Plant Mol Biol 61(4-5), pp 699-710 100 Webser R (1998), “Influenza, an emerging disease”, Emerg Infect Dis 4, pp 436441 101 Wu W., Jia Z., Liu P., Xie Z., Wei Q (2005), “A novel PCR strategy for highefficiency, automated site-directed mutagenesis”, Nucleic Acids Res 33(13), pp e110 88 Tài liệu tham khảo 102 Yamamoto Y T., Rajbhandari N., Lin X., Bergmann B A., Nishimura Y., Stomp A M (2001), "Genetic transformation of duckweed Lemna gibba and Lemna minor", In Vitro Cellular and Development Biology -Plant 37(3), pp 349-353 103 Yi-Minh Xu, Ning-Yi JIN, Zhi-ping XIA, Ming-Xiao-MA, Hui-Jun LU, Song HAN, Kuo-Shi, Guo-Dong LIANG (2006), “Expression of AIV subtype H5HA, H7HA and H9HA Hemagglutinin genne in Pichia pastoris”, Chin J Biotecch 22(2), pp 231-236 104 Zambon M (1999), “Epidemiology and pathogenesis of influenza”, J Antimicrob Chemother 44(Topic B), pp 3-9 105 Zhao Z M., Shortridge K F., Garcia M., Guan Y., Wan X F (2008), “Genotypic diversity of H5N1 highly pathogenic avian influenza viruses”, J Gen Virol 89 (Pt 9), pp 2182-2193 106 Zhou N., Shortridge K., Claas E., Krauss S., Webster R (1999), “Rapid evolution of H5N1 influenza viruses in chickens in Hong Kong”, J Virol 73, pp 33663374 107 Zhou T., Gu W., Ma J., Sun X., Lu Z (2005), “Analysis of synonymous codon usage in H5N1 virus and other influenza A viruses”, Biosystems 81(1), pp 7786 108 www.cucthuy.gov.vn 109 http://www.cytokinestorm.com/ 109 110 www.lemnagene.com 110.111.www.selectscience.net/products/quickchange-site-directed-mutagenesiskits/prod 112 http://www.sciencemediacentre.co.nz/2009/04/26/swine-flu-likely-among-newzealand-students/ 113 http://www.sciencedaily.com/releases/2009/02/090222142139.htm 114 http://www.slac.stanford.edu/tip/2004/nov05/flu.htm 111.115 www.who.int/en/ csr/ disease/ avian – influenza/ en/ 89 Tài liệu tham khảo 90 MỤC LỤC Lời cam đoan i Các từ viết tắt ii Tên viết tắt amino acid .iii Danh mục bảng iv Danh mục hình v MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Gen Hemagglutinin (HA) virus cúm A/H5N1 1.1.1 Virus cúm A/H5N1 1.1.1.1 Tình hình dịch bệnh cúm A/H5N1 1.1.1.2 Cấu trúc đặc điểm virus cúm A/H5N1 1.1.1.3 Độc lực virus cúm A/H5N1 1.1.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống H5N1, ứng dụng chuyển gen H5N1 vào trồng 1.1.2.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống H5N1trên giới 1.1.2.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống H5N1 Việt Nam 1.1.3 Hemagglutinin 10 1.1.3.1 Gen Hemagglutinin 10 1.1.3.2 Protein Hemagglutinin 10 1.1.3.3 Hemagglutinin với nghiên cứu sản xuất vaccine thực vật 13 1.2 Chuyển gen vào bèo thực triển vọng 14 1.2.1 Chuyển gen vào thực vật 14 1.2.2 Bèo tiềm chuyển gen 14 1.2.3 Agrobacterium phƣơng pháp chuyển gen thực vật 15 1.2.3.1 Agrobacterium tƣợng biến nạp gen vào thực vật 15 1.2.3.2 Cấu tạo chức Ti-plasmid 15 1.2.3.3 Các loại vector Ti-plasmid 17 1.2.4 Thiết kế Ti-plasmid tái tổ hợp mang gen có giá trị 18 1.2.4.1 Chỉ thị chọn lọc/sàng lọc 19 1.2.4.2 Promoter vai trò biểu gen 19 1.2.4.3 Terminater 20 1.3 Các kỹ thuật tạo đột biến điểm để cải biến gen 21 1.3.1 Cơ sở di truyền việc cải biến gen 21 1.3.2 Các kỹ thuật tạo đột biến điểm 25 CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 29 2.1 NGUYÊN LIỆU 29 2.1.1 Nguyên liệu 29 2.1.2 Hóa chất 29 2.1.3 Thiết bị 30 2.2 Phƣơng pháp 32 2.2.1 Sơ đồ thí nghiệm 32 2.2.2 Thiết kế mồi cải biến vị trí nucleotide 33 2.2.3 Tạo đột biến điểm sử dụng phƣơng pháp Megaprimer 35 2.2.4 Tạo đột biến điểm sử dụng phƣơng pháp Quickchange 36 2.2.5 Tạo đột biến điểm theo phƣơng pháp kéo dài đoạn gối lên 37 2.2.6 Điện di gel agarose 37 2.2.7 Phƣơng pháp nhân gen kĩ thuật PCR 38 2.2.8 Tinh chế đoạn DNA gel agarose 39 2.2.9 Phản ứng ghép nối đoạn gen với vector 40 2.2.10 Biến nạp vào E coli Agrobacterium 40 2.2.10.1 Phƣơng pháp chuẩn bị tế bào khả biến E coli 40 2.2.10.2 Biến nạp vào A tumefaciens 41 2.2.11 Tách chiết tinh DNA plasmid 42 2.2.13 Phƣơng pháp xác định trình tự gen 44 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 3.1 Cải biến gen HA1 45 3.1.1 Nhân gen HA, HA1gắn trình tự nhận biết enzyme giới hạn đặc hiệu 45 3.1.2 Cải biến vị trí MD2 đoạn gen HA1 phƣơng pháp Megaprimer 48 3.1.3 Cải biến vị trí MD5, MD3 gen HA1 sử dụng phƣơng pháp Quickchange 49 3.1.4 Cải biến vị trí MD4 gen HA1 phƣơng pháp Megaprimer 51 3.1.5 Cải biến vị trí M2 đoạn gen HA1 sử dụng phƣơng pháp kéo dài đoạn gối lên 54 3.2 Thiết kế vector nhị thể pPAM mang gen HA, HA1 57 3.2.1 Kết thu vector pPAM 57 3.2.2 Kết tách dòng Ti-plasmid mang gen HA, HA1, HA1M dƣới điều khiển promoter CAMV35S kép 58 3.2.3 Thiết kế Ti-plasmid mang gen HA1, HA1M dƣới điều khiển đoạn promoter đặc hiệu bèo Spirodela polyrrhiza DB2 60 3.3 Thiết kế vector nhị thể pCAMBIA mang gen HA1, HA1M 65 3.3.1 Kết nhân gen HA1M có gắn hai enzyme nhận biết NcoI-NheI 66 3.3.2 Thiết kế cấu trúc promoter CAM 35S - GUS - NOS 66 3.3.3 Tạo cấu trúc promoter CAMV35S-gen HA1 (hoặc HA1M)-NOS terminater 67 3.3.4 Thiết kế Ti-plamid pCAMBIA1300 mang cấu trúc promoter CAMV35S-gen HA1 (hoặc HA1M)-NOS terminater 69 3.3.5 Thiết kế tạo cấu trúc gen HA1 HA1M dƣới điều khiển promoter Ubiquitin từ bèo S polyrrhyza Ti-plasmid pCAMBIA 71 3.4 Tạo chủng A tumefaciens mang vector pCAMBIA1300 chứa gen HA1 74 KẾT LUẬN 77 ĐỀ NGHỊ 77 TÀI LIỆU THAM KHẢO 78 ... đƣợc từ bèo tấm, tiến hành nghiên cứu đề tài Thiết kế vector nhị thể mang gen mã hóa Hemagglutinin từ virus cúm gia cầm để chuyển vào bèo tấm với nội dung sau: Cải biến 4-5 vùng gen mã hóa Hemagglutinin. .. nghệ gen với hỗ trợ kinh phí Đề tài nhánh Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen H5N1 để chuyển vào bèo tấm thuộc đề tài Nghiên cứu tạo giống bèo mang gen kháng nguyên H5N1 phòng chống bệnh cúm gia. .. cấu trúc gen mã hóa Hemagglutinin (chƣa cải biến, cải biến) với promoter CAMV35S promoter gen Ubiquitin từ giống bèo Spirodela polyrrhiza để chuyển gen trực tiếp vào bèo Thiết kế vector nhị thể