Nghiên cứu thu nhận peptit kìm hãm enzym chuyển hóa angiotensin từ thủy phân protein đậu tương bằng enzym và khả năng ứng dụng

Trương Thị Ngọc Hồi Công nghệ sinh học LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô giáo hướng dẫn PGS.TS Trần Liên Hà – giảng viên Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm trường đại học Bách khoa Hà Nội, người luôn hướng dẫn, giúp đỡ suốt trình hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm, cán phòng thí nghiệm Viện công nghệ Sinh học Thực phẩm, bạn sinh viên tạo điều kiện thuận lợi, tận tình giúp đỡ để hoàn thành luận văn Cuối xin gửi tới gia đình, bạn bè, tình cảm tốt đẹp động viên, quan tâm, giúp đỡ người dành cho thời gian làm luận văn Hà Nội, ngày tháng năm 2011 Học viên Trương Thị Ngọc Hồi Luận văn thạc sỹ khoa học 2009 - 2011 Trương Thị Ngọc Hồi Công nghệ sinh học LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu luận văn khoa học Các kết nghiên cứu luận văn hoàn toàn trung thực, thông số, kết tính toán hoàn toàn xác chưa công bố công trình nghiên cứu khác Hà Nội, ngày tháng năm 2011 Học viên Trương Thị Ngọc Hồi Luận văn thạc sỹ khoa học 2009 - 2011 Trương Thị Ngọc Hồi Công nghệ sinh học MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU 11 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 13 1.1 Giới thiệu enzym chuyển hóa angiotensin (ACE) 13 1.1.1 Angiotensin 13 1.1.2 Cấu trúc hóa học enzym chuyển hóa angiotensin (ACE) 13 1.1.3 Tính chất ACE 14 1.2 Bệnh cao huyết áp người vai trò ACE bệnh cao huyết áp 16 1.2.1 Bệnh cao huyết áp người 16 1.2.2 Hệ thống Renin-Angiotensin-Aldosterol (RAAS) 17 1.2.3 Hệ thống Kinin-Nitric-Oxide (KNOS) 18 1.3 Các peptit ức chế enzym chuyển hóa angiotensin (ACEIP) 19 1.3.1 Lịch sử nghiên cứu 19 1.3.2 Đặc tính chế hoạt động ACEIP 20 1.3.3 Phân loại ACEIP 21 1.4 Các đường sản xuất ACEIP 25 1.4.1 Sản xuất ACEIP đường tổng hợp hóa học 25 1.4.2 Sản xuất ACEIP từ protein tự nhiên 25 1.5 Tình hình nghiên cứu sản xuất ứng dụng ACEIP 31 1.5.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất ứng dụng ACEIP giới 31 1.5.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất ACEIP nước 32 Luận văn thạc sỹ khoa học 2009 - 2011 Trương Thị Ngọc Hồi Công nghệ sinh học 1.6 Đậu tương protein đậu tương sản xuất ACEIP 33 1.6.1 Nghiên cứu sản xuất ACEPI Enzym protease 34 1.6.2 Nghiên cứu sản xuất ACEIP từ vi khuẩn 36 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.1 Nguyên liệu 38 2.1.1 Enzym protease chất 38 2.1.2 Hóa chất 38 2.1.3 Thiết bị 38 2.1.4 Môi trường 39 2.2 Phương pháp nghiên cứu 39 2.2.1 Chuẩn bị dịch thủy phân protein đậu tương 39 2.2.2 Phương pháp lên men thu protease phương pháp thu nhận peptit từ dịch thủy phân protein đậu tương 39 2.2.3 Phương pháp phân tích 41 2.2.4 Phương pháp tối ưu cổ điển 44 2.2.5 Tinh peptit 44 2.2.6 Phương pháp sấy phun sản phẩm sau lên men 46 2.2.7 Xác đinh tiêu an toàn thực phẩm sản phẩm 47 2.2.8 Phương pháp xác định độc tính cấp 48 2.2.9 Thử nghiệm mèo 49 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 51 3.1 Xác định khả kìm hãm ACE dịch peptit sau thủy phân 51 3.2 Tối ưu điều kiện thủy phân protein đậu tương trypsin 52 3.2.1 Ảnh hưởng tỷ lệ E/S đến khả kìm hãm ACE sử dụng trypsin thủy phân protein đậu tương 52 3.2.2 Ảnh hưởng tỷ lệ E/S thời gian thủy phân trypsin 53 3.2.3 Tối ưu nhiệt độ thủy phân protein đậu tương 54 3.2.4 Tối ưu pH thủy phân protein đậu tương 55 3.3 Tối ưu điều kiện thủy phân protein đậu tương pepsin 57 Luận văn thạc sỹ khoa học 2009 - 2011 Trương Thị Ngọc Hồi Công nghệ sinh học 3.3.1 Ảnh hưởng tỷ lệ E/S đến khả kìm hãm ACE sử dụng pepsin thủy phân protein đậu tương 57 3.3.2 Ảnh hưởng tỷ lệ E/S thời gian thủy phân 58 3.3.3 Tối ưu nhiệt độ thủy phân protein đậu tương 59 3.3.4 Tối ưu pH thủy phân protein đậu tương 60 3.4 Tối ưu điều kiện thủy phân protein đậu tương dịch lên men protease Bacillus subtilis CN2 61 3.4.1 Tối ưu tỷ lệ E/S thời gian phản ứng thủy phân protein đậu tương dịch protease 61 3.4.2 Tối ưu nhiệt độ thủy phân protein đậu tương dịch protease 62 3.4.3 Tối ưu pH thủy phân protein đậu tương dịch protease 64 3.5 Khả kìm hãm ACE loại enzym sau trình tối ưu 65 3.6 Tinh peptit 66 3.7 Kết xác định tiêu an toàn thực phẩm sản phẩm 69 3.8 Kết xác định độc tính cấp 69 3.9 Kết thử nghiệm mèo 70 3.10 Đặc tính sản phẩm sau sấy phun 74 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO 78 PHỤ LỤC 86 Luận văn thạc sỹ khoa học 2009 - 2011 Trương Thị Ngọc Hồi Công nghệ sinh học DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu RAAS Giải thích Renin - Angiotensin - Aldosterol System (hệ thống Renin -Angiotensin Aldosterol) ACEI Angiotensin I converting enzym inhibitor (chất ức chế enzym chuyển angiotensin I) ACEIP Angiotensin I converting enzyme inhibitor peptits (peptit ức chế enzym chuyển hóa angiotensin) ACE Angiotensin I converting enzyme (enzym chuyển hóa angiotensin I) BSA Bovine serum albumin (albumin huyết bò) Da Dalton IC50 50% inhibitory concentration (mg/ml) (nồng độ ức chế 50% hoạt tính ACE) SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphate - polyacrylamide gel electrophoresis (điện di gel polyacrylamid) FAPGG Furylacryloyl-Phenylalanyl-Glycyl-Glycine E/S Tỷ lệ Enzym/cơ chất Luận văn thạc sỹ khoa học 2009 - 2011 Trương Thị Ngọc Hồi Công nghệ sinh học DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Đặc tính dược lý ACEI phê chuẩn Mỹ[45] 24 Bảng 1.2: Những peptit cho hoạt tính ức chế ACE từ nước 27 Bảng 1.3: Các sản phẩm thương mại từ sản phẩm protein sữa [51] .28 Bảng 1.4: Giá trị IC50 số sản phẩm lên men từ đậu tương [52] .29 Bảng 1.5: Khả ức chế ACE số loại protein thực vật 30 Bảng 1.6 Một vài protease sử dụng trình sản xuất ACEIP [Enrollment in local colleges, 2005][25] 34 Bảng 3.1 Hoạt tính kìm hãm số enzym 66 Bảng 3.2: Các tiêu an toàn thực phẩm sản phẩm 69 Bảng 3.3: Độc tính cấp dung dịch thử 70 Bảng 3.4: Huyết áp mèo trước sau uống nước (lô chứng)(n = 5) .71 Bảng 3.5: Huyết áp mèo trước sau uống dịch chiết đậu tương liều 1ml/kg (n = 4) .72 Bảng 3.6: Huyết áp mèo trước sau uống dịch chiết đậu tương liều 4ml/kg (n = 5) .73 Bảng 3.7: Đặc tính chế phẩm sau sấy phun 74 Bảng B 1: Kết đo OD595nm để xây dựng đường chuẩn BSA 86 Bảng B.2: Kết đo OD để xây dựng đường chuẩn peptit .87 Bảng B.3: Ảnh hưởng tỷ lệ E/S thời gian phản ứng tới hàm lượng peptit tạo thành sau thủy phân protein đậu tương trypsin 88 Bảng B.4: Nồng độ peptit dịch thủy phân nhiệt độ phản ứng khác thủy phân protein đậu tương trypsin 88 Bảng B.5: Nồng độ peptit dịch thủy phân giá trị pH khác thủy phân protein đậu tương trypsin 88 Bảng B.6: Ảnh hưởng tỷ lệ E/S thời gian phản ứng tới hàm lượng peptit tạo thành sau thủy phân protein đậu tương pepsin .89 Bảng B.7: Nồng độ peptit dịch thủy phân nhiệt độ phản ứng khác thủy protein đậu tương pepsin 89 Luận văn thạc sỹ khoa học 2009 - 2011 Trương Thị Ngọc Hồi Công nghệ sinh học Bảng B.8: Nồng độ peptit dịch thủy phân giá trị pH khác thủy phân protein đậu tương pepsin 89 Bảng B.9: Ảnh hưởng tỷ lệ E/S thời gian phản ứng tới hàm lượng peptit tạo thành sau thủy phân protein đậu tương dịch protease 90 Bảng B.10: Nồng độ peptit dịch thủy phân nhiệt độ phản ứng khác thủy protein đậu tương dịch protease 90 Bảng B.11: Nồng độ peptit dịch thủy phân giá trị pH khác thủy phân protein đậu tương dịch protease 90 Luận văn thạc sỹ khoa học 2009 - 2011 Trương Thị Ngọc Hồi Công nghệ sinh học DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Cấu trúc hình dáng ACE từ huyết tương, tế bào soma tế bào sinh dục, biễu diễn trung tâm hoạt động, vị trí gắn kẽm, vùng N C [57] 14 Hình 1.2: Mô hình trung tâm hoạt động ACE liên kết với .15 Hình 1.3: Hoạt động hệ Renin-Angiotensin-Aldosterone [7] .17 Hình 1.4: Hệ thống Kinin-Nitric-Oxide [45] 18 Hình 1.5: ACE xúc tác tạo thành Angiotensin II hoạt động từ Angiotensin I, đồng thời làm vô hoạt bradykinin [68] .19 Hình 1.6: Mô hình liên kết phản ứng peptit kìm hãm ACE (LeuGly-Pro) trung tâm hoạt động ACE [49] 21 Hình 1.7: Công thức cấu tạo Captopril[45] 22 Hình 1.8: Công thức cấu tạo Enalapril [64] .23 Hình 1.9: công thức cấu tạo Lisinopri [67] 23 Hình 3.1: So sánh khả kìm hãm ACE loại enzyme .51 Hình 3.2: Ảnh hưởng tỷ lệ E/S sử dụng enzym trypsin đến khả kìm hãm ACE .52 Hình 3.3: Khả tạo peptit tỷ lệ E/S thời gian thủy phân 54 Hình 3.4: Khả tạo peptit nhiệt độ thủy phân khác 55 Hình 3.5: Khả tạo peptit pH khác 56 Hình 3.6: Ảnh hưởng tỷ lệ E/S sử dụng enzym pepsin đến khả kìm hãm ACE .57 Hình 3.7: Khả tạo peptit tỷ lệ E/S thời gian thủy phân 58 Hình 3.8: Khả tạo peptit nhiệt độ khác 59 Hình 3.9: Khả tạo peptit pH khác 60 Hình 3.10: Khả tạo peptit tỷ lệ E/S thời gian thủy phân 61 Hình 3.11: Khả tạo peptit nhiệt độ khác 63 Hình 3.12: Khả tạo peptit pH khác 64 Hình 3.13 Khả kìm hãm ACE sau trình tối ưu 65 Hình 3.14 Khả kìm hãm ACE qua giai đoạn tinh .67 Luận văn thạc sỹ khoa học 2009 - 2011 Trương Thị Ngọc Hồi Công nghệ sinh học Hình 3.15: Kết điện di SDS-PAGE 68 Hình 3.16: Thử nghiệm mèo 71 Hình 3.17: Chế phẩm thô sau sấy phun chứa peptit ức chế ACE sử enzym trypsin với chất protein đậu tương 74 Hình P.1: Đường chuẩn BSA .86 Hình P.2: Đường chuẩn xác định hàm lượng peptit 87 Luận văn thạc sỹ khoa học 10 2009 - 2011 Trương Thị Ngọc Hồi Công nghệ sinh học KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Sau trình nghiên cứu, thực đề tài: “Nghiên cứu thu nhận peptit kìm hãm enzym chuyển hóa angiotensin từ thủy phân protein đậu tương enzym khả ứng dụng”, có số kết luận sau: KẾT LUẬN: Đã xác định khả kìm hãm ACE sản phẩm sau thủy phân protein đậu tương sử dụng ba loại enzym với điều kiện tối ưu (trypsin, pepsin, dịch protease) Lựa chọn enzym trypsin để thủy phân thu nhận peptit kìm hãm ACE với hiệu suất kìm hãm ACE cao 97,24%, thời gian thủy phân ngắn (01 giờ) pH 7,6 Đã nghiên cứu tinh ACEIP, hoạt tính kìm hãm ACE sau tinh 98,97 % Điện di SDS-PAGE cho thấy peptit có hoạt tính ức chế ACE có trọng lượng phân tử < Kda Đã kiểm tra chất lượng an toàn thực phẩm chế phẩm peptit kìm hãm ACE: đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm Đã xác định độc tính cấp dịch chứa peptit sau lọc dòng ngang 10 kDa: LD50 = 177,8 ml/kg Đã tiến hành thử nghiệm thành công mèo với liều ml/kg thể trọng, mèo làm hạ huyết áp mèo có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) Đã tiến hành sấy phun lưu giữ chế phẩm peptit, khả kìm hãm ACE sau sấy phun 96,2%, với hàm lượng peptit 1,29% Luận văn thạc sỹ khoa học 76 2009 - 2011 Trương Thị Ngọc Hồi Công nghệ sinh học KIẾN NGHỊ: Do điều kiện thời gian nghiên cứu có hạn, chưa thể nghiên cứu sâu vào xác định đặc tính thử nghiệm lâm sàng chế phẩm chứa peptit kìm hãm enzym ACE Chúng có số kiến nghị sau: • Tiến hành nghiên cứu xác định trình tự axit amin peptit có hoạt tính ACE thu • Thử nghiệm lâm sàng người để tiến tới sản xuất sản phẩm chứa peptit sinh học có hoạt tính ức chế ACE, có tác dụng điều trị bệnh cao huyết áp nước Luận văn thạc sỹ khoa học 77 2009 - 2011 Trương Thị Ngọc Hồi Công nghệ sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Tô Kim Anh (1999), Nghiên cứu công nghệ thu nhận colagenaza từ vi khuẩn Bacillus subtilis, Luận án tiến sỹ kỹ thuật Nguyễn Tiến Dũng (2007), Phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật thực phẩm, Đại học Quốc gia Thành Phố Hồ Chí Minh Lê Thanh Hà, Quản Lê Hà, Nguyễn Thị Hoài Trâm (2008), Nghiên cứu điều kiện thủy phân Casein enzym để thu peptit kìm hãm ACE, Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ IV, Hóa sinh Sinh học phân tử, phục vụ nông, sinh, y học công nghiệp thực phẩm, tr 9-11 Nguyễn Hoài Hương, Bùi Văn Thế Vinh (2009), Bài giảng thực hành hóa sinh, Trường Đại học kỹ thuật Công nghệ TP.HCM, Khoa Môi trường Công nghệ Sinh học Vũ Hồng Minh (2006), Nghiên cứu trình thu sinh khối tạo chế phẩm vi khuẩn Streptococcus Thermophilus, Luận văn thạc sĩ khoa học Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Lê Thanh Ngân (2007), Nghiên cứu lựa chọn chủng vi sinh vật điều kiện lên men tổng hợp peptit chức kìm hãm enzym chuyển Angiotensin từ nguồn protein sữa bò, Luận văn thạc sĩ khoa học Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Lê Văn Nhân ( 2007), ”Lịch sử khám phá nhóm thuốc ức chế enzym chuyển Angiotensin”, Y dược ngày Phạm Quỳnh Nhung (2009), Nghiên cứu công nghệ sản xuất peptit có khả kìm hãm enzym chuyển hóa angiotensin từ đậu tương, sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis CN2, Luận văn thạc sỹ khoa học trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học 78 2009 - 2011 Trương Thị Ngọc Hồi Công nghệ sinh học Lã Quỳnh Như (2007), Nghiên cứu điều kiện tách tinh peptit chức chống bệnh cao huyết áp từ dịch thủy phân casein, Luận văn thạc sỹ khoa học trường đại học Bách Khoa Hà Nội 10 Lương Đức Phẩm (1998), Công nghệ vi sinh vật, Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội 11 Trần Linh Phước (2003), Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm, Nhà xuất giáo dục 12 Nguyễn Thị Phương Thảo (2008), Nghiên cứu công nghệ thu nhận peptit kìm hãm enzym chuyển hóa angiotesin từ vi sinh vật lên men truyền thống với chất đậu tương, Luận văn thạc sỹ khoa học, Đại học Bách Khoa Hà Nội 13 Lê Ngọc Tú, Đỗ Ngọc Liên, Đặng Thị Thu (2002), Tế bào trình sinh học, Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội 14 Nguyễn Minh Tuyển (2002), Quy hoạch thực nghiệm, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Tài liệu nước ngoài: 15 Aera Jang, Cheorun Jo, Kyung-Sun Kang and Mooha Lee (2008), ”Antimicrobial and human cancer cell cytotoxic effect of synthetic angiotensin-converting enzym (ACE) inhibitory peptits”, Food Chemistry 107(1), pp 327-336 16 Ariyoshi, Y (1993) “Angiotensin-converting enzym inhibitors derived from food proteins”, Trends Food Sci Technol 4, pp 139-144 17 Basso N, Terragno NA (December 2001), "History about the discovery of the renin-angiotensin system", Hypertension 38 (6), pp 1246–9 18 Chen et al (2004), “Peptits used as Angiotensin Converting Enzym Inhibitor and preparation process thereof”, United State Patent 67667990 B1 Luận văn thạc sỹ khoa học 79 2009 - 2011 Trương Thị Ngọc Hồi Công nghệ sinh học 19 Chen J, Okada, T Muramoto K, Yang S (2003), “Identification of AngiotensinI- Coverting Enzym Inhibitory peptits derived from the peptic diges of soy bean protein”, J Food Biochem 26(6), pp 543- 554 20 Chen JR, Yang SC, Suetsuna K, Chao JCJ (2004), “Soybean proteinderived hydrolysate affects blood pressure in spontaneously hypertensive rats”, J Food Biochem 28, pp 61–73 21 Wen- Dee Chiang, May-June Tsou, Zong-Yao Tsai, Tsun-Chung Tsai (2006), “Angiotensin I- converting enzym inhibitor derived from soy protein hydrolysate and produced by using membrane reactor”, Food Chemistry 98, pp 725-732 22 Cuhman DW, Ondetti MA (1980), “Inhibitors of angiotensin-converting enzym”, Elsevier/ North- Holland Biomedical Press, New York, Amsterdam 24, pp 41-104 23 Cushman DW, Cheubg HS (1971), “Spectrophotometric assay abd properties of the Angiotensin Converting Enzym of rabbit lunh”, Biochem Pharmacol 20, pp 1637-48 24 David W Cushman and Miguel A Ondetti (1991), “History of the Design of Captopril and Related Inhibitors of Angiotensin Converting Enzym”, Hypertension 17, pp 589-592 25 Dr J Tuomilehto (2004), “Journal of human hypertension”, life sciences 75(14), pp.1727-1734 26 Edward M Scolnick (2001), "Advances in protein chemistry Volume 56 Drug Discovery and Design”, ACADEMIC PRESS, USA 27 Ehlers, R W & Riordan, J F (1989), “Angiotensin-converting enzym: new concepts concerning its biological role”, Biochemistry 28, pp 5311-5318 28 FitzGerald, R J & Meisel, H (2000), ”Milk protein-derived peptit inhibitors of angiotensin-I-converting enzym”, Br J Nutr 84, pp 33-37 29 Fujita H, Yoshikawa M (1999), “a prodrug-type ACE-inhibitory peptit derived from fish protein”, Immunopharmacology 44(1/2), pp 123–7 Luận văn thạc sỹ khoa học 80 2009 - 2011 Trương Thị Ngọc Hồi Công nghệ sinh học 30 Frank C Church, Harold E Swaisgood, David H Porter, and George L Catignani 1983, “Spectrophotometric Assay Using o-Phthaldialdehyde for Determination of Proteolysis in Milk and Isolated Milk Proteins”, J Dairy Sci 66, pp 1219-1227 31 Gibbs BF, Zougman A, Masse R, Mulligan C (2004), “Production and characterization of bioactive peptits from soy hydrolysate and soy-fermented foods”, Food Res Int 37(2),123–31 32 Tran Lien Ha, Nagano Hiroko (2002), “Isolation and Characteristic of Bacillus subtilis CN2 and its collagenase Production”, Journal of Food Science 67(3), pp 1184-1187 33 Tran Lien Ha, Nguyen Van Cach, Nguyen Thi Hang, Nguyen Thanh Hoa (2006), “Isolation and characterization of Lactobacillus plantarum NC13 producing angiotensin-converting enzym inhibiting peptits”, Proceeding of the second international conference on the development of biomedical engineering in Vietnam, pp 236-241 34 Hemsen, A (1991), “Biochemical and functional characterisation of endothelin peptits with special reference to vascular effects”, Acta Physiol Scand Suppl 602, pp 1-61 35 Hiroyuki Uchida, Daisaku Kondo, Satoko Yamashita, Tomoko Tanaka, Lien Ha Tran, Hiroko Nagano, Takayuki Uwajima (2004), “Purification and properties of a protease by Bacillus subtilis CN2 isolated from a Vietnamese fish sauce”, World journal of microbiology and biotechnology, pp 579-582 36 Jeanette Otte, Samah M.Shalaby, Mila Zakora (2007), “Angiotensinconverting enzym inhibitory activity of milk protein hydrolysates: Effect of substrate, enzym and time of hydrolysis”, International Dairy Journal 17, pp 488-503 37 Jeong HJ, Park JH, Lam Y, de Lumen BO (2003) “Characterization of lunasin isolated from soybean”, J Agric Food Chem, 51(27), pp 7901–6 Luận văn thạc sỹ khoa học 81 2009 - 2011 Trương Thị Ngọc Hồi Công nghệ sinh học 38 Kimura A Takada A, Okada T, Yamada H, (2000), “Microbal manufacture of AngiotensinI- Converting Enzym Inhibiting Peptit”, Japan: Tiyo Hatsuko K.k: JPn Kokai Tokkyo Koho J P 22996.A2 22; Aug2000 11p 39 Kitts DD, Weiler K (2003), “Bioactive proteins and peptits from food sources Applications of bioprocesses used in isolation and recovery”, Curr Pharm Des 9(16), pp 1309–23 40 Korhonen H, Pihlanto A (2003),” Food-derived bioactive peptitsopportunities for designing future foods”, Curr Pharm Des 9(16) pp 1297– 308 41 M Miguel, M.M Contreras, I Recio and A Aleixandre (2009), “ACEinhibitory and antihypertensive properties of a bovine casein hydrolysate”, Food Chemistry 112 (1), pp 211-214 42 Maruyama, S., and Susuki, H.: A (1982), “Peptit Inhibitor of Angiotensin I Converting Enzym in the Tryptic Hydrolysate of Casein”, Agric Biol Chem 46, pp 1393 43 Matsui T, Yukiyoshi A, Doi S, Sugimoto H, Yamada H, Matsumoto K (2002), “Gastrointestinal enzym production of bioactive peptits from royal jelly protein and their antihypertensive ability in SHR”, Nutr Biochem 13(2), pp 80–6 44 Meisel, H.; Sawatski, G Renner, B eds (1993), “Casokinins as inhibitors of angiotensin-I-converting enzym” New Perspectives in Infant Nutrition, pp 153-159 45 Nancy J Brown, MD; Douglas E Vaughan, MD (1998), “AngiotensinConverting Enzym Inhibitors”, Circulation 97, pp 1411-1420 46 Oscar A Carretero (2005), “Novel mechanism of action of ACE and its inhibitors”, Am J Physiol Heart Circ Physiol 289, H1796-H1797 47 Oshima, G., Shimabukuro, H and Nagasawa, K (1979), "Peptit inhibitors of Angiotensin converting enzym digests of gelatin by bacterial collagenase”, Biochim Biophys Acta 566 (1), pp 128-37 Luận văn thạc sỹ khoa học 82 2009 - 2011 Trương Thị Ngọc Hồi Công nghệ sinh học 48 Oudit, G Y., Crackower, M A., Backx, P H & Penninger, J M (2003), “The role of ACE2 in cardiovascular physiology”, Trend Cardiovasc Med 13, pp 93-101 49 Pena-Ramos EA, Xiong YL (2002), “Antioxidant activity of soy protein hydrolysates in a liposomal system”, J Food Sci 67(8), pp 2952–6 50 Piotr J Rudzki, Katarzyna Buś, Hanna Ksycińska,and Kamila Kobylińska (2007), “An overview of chromatographic methods coupled with mass spectrometric detection for determination of angiotensin-converting enzym inhibitors in biological material”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 44 (2), pp 356-367 51 Richard J FitzGerald, Brian A Murray and Daniel J Walsh (2004), “Hypotensive Peptits from Milk Proteins”, J Nut 134, 980S-988S 52 Richard J FitzGerald, Brian A Murray, and Daniel J Walsh (2004), “The Emerging role of dairy proteins and bioactive peptits in nutrition and health”, American society for Nutritional Scienses13, pp.980S– 985S 53 Saito T, Nakamura T, Kitazawa H, Kawai Y, Itoh T (2000), “Isolation and structural peptits analysis of antihypertensive that exist naturally in gouda cheese”, J Dairy Sci 83, pp 1434-1440 54 Tiina Jauhiainen and Riitta Korpela (2007), ”Milk Peptits and Blood Pressur”, J Nutr 137, pp 825S-829S 55 Toshiaki Ichimura, Jianen Hu, Duong Qua Aita, and Susumu Maruyama, (2003), “Angiotensin I – Converting Enzym Inhibitory Activity and Insulin Secretion Stimulative Activity of Fermented Fish Sauce”, Journal of biosciene and bioengineerin, 96(5), pp 496-499 56 Turner, A J & Hooper, N M (2002), “The angiotensin-converting enzym gene family; genomics and pharmacology”, Trends Pharmcol Sci 23, pp 177-183 57 Vanesa Vermeirssen, John Van Camp, Willy Verstraete (2001), “Optimisation and validation of an angiotensin-converting enzym inhibition Luận văn thạc sỹ khoa học 83 2009 - 2011 Trương Thị Ngọc Hồi Công nghệ sinh học assay for the screening of bioactive peptits”, Journal of biochemical and biophysical methods 51, pp 75-87 58 Vanessa Vermeirssen (2003), “Release and activity of ACE inhibitory peptites from pea and whey protein: fermentation, in vitro digestion and transport”, Universiteit gent, pp 17-38 59 Walsh, D J & FitzGerald, R J (2004), “In Vitro Generation and Stability of the Lactokinin ß-Lactoglobulin Fragment”, J Dairy Sci 87, pp 3845-3857 60 Weber, M A (2001), “Vasopeptitase inhibitors”, The Lancet 358, pp 15251532 61 Wenyi Wang and Elvira Gonzalez de Mejia (2005), “A New Frontier in Soy Bioactive Peptits that May Prevent Age-related Chronic Diseases”, Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety 4, pp 63-78 62 Whitworth JA; World Health Organization, International Society of Hypertension Writing Group (2003), “2003 World Health Organization (WHO)/International Society of Hypertension (ISH) statement on management of hypertension”, J Hypertens 21(11), pp 1983-92 63 Yamamoto, N., Akino, A and Takano, T (1993), “Purification and specificity of a cell-wall-associated proteinase from Lactobacillus helveticus CP790”, Journal of Biochemistry (Tokyo) 114, pp 740-745 64 Yang, H.Y.T., Erdös, E G & Levin, Y (1970), “A dipeptityl carboxypeptitase that converts angiotensin I and inactivates bradykinin”, Biochem Biophys 214, pp 374-376 65 Yoshioka, M (1987), “Role of rat intestinal brush border membrane angiotensin converting enzym in dietary protein digestion”, Am J Physiol 253, G781-G786 66 Yulan Zhao, and Chuanlian Xu (2008), “Structure and Function of Angiotensin Converting Enzym and Its Inhibitors”, Chinese journal oh biotechnology, Volume 24, Issue Luận văn thạc sỹ khoa học 84 2009 - 2011 Trương Thị Ngọc Hồi Công nghệ sinh học 67 Trần Liên Hà, Phạm Phương Thảo, Nguyễn Văn Cách (2010), “Nghiên cứu đặc tính Bacillus subtilis TH2 sinh tổng hợp chất kìm hãm enzym chuyển hóa angiotensin”, Tạp trí công nghệ sinh học 8, tr 871-878 68 http://en.wikipedia.org/wiki/ACE_inhibitor 69 http://en.wikipedia.org/wiki/Renin-angiotensin_system 70 http://genomebiology.com/2003/4/8/225 71 http://vietbao.vn/Suc-khoe/Chung-cao-huyet-ap-gia-tang-tren-toan-thegioi/45238612/248/ 72 http://vtv.vn/Article/Get/Nguy-hiem-chua-biet-cua-can-benh-tang-huyet-ap69c44d9b88.htm 73 http://www.thuốc-sức khoẻ.com.khái niệm viết phân loại 003.htm 74 http://images1.afamily.channelvn.net/Images/Uploaded/Share/2009/04/10/da unanh.jpg 75 http: //en wikipedia org/wiki/ captopril 76 http://vietbao.vn/Suc-khoe/Phong-ngua-benh-tu-thuc-pham/70078755/248/ 77 http://journals.tubitak.gov.tr/biology/issues/biy-98-22-4/biy-22-4-797042.pdf Luận văn thạc sỹ khoa học 85 2009 - 2011 Trương Thị Ngọc Hồi Công nghệ sinh học PHỤ LỤC Bảng B 1: Kết đo OD595nm để xây dựng đường chuẩn BSA [BSA] (mg/ml) 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 OD595nm 0.015 0.054 0.160 0.258 0.403 0.512 0.6 y = 0.5608x - 0.0561 R2 = 0.995 0.5 OD 595nm 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 [BSA] (mg/ml) Hình P.1: Đường chuẩn BSA Luận văn thạc sỹ khoa học 86 2009 - 2011 Trương Thị Ngọc Hồi Công nghệ sinh học Bảng B.2: Kết đo OD để xây dựng đường chuẩn peptit Nồng độ peptit (mg/ml) 0.5 OD340nm 0,027 0,093 0,188 0,246 0,354 0,433 0,587 0.7 y = 0.0953x - 0.0171 R2 = 0.9879 0.6 0.5 OD 340nm 0.4 0.3 0.2 0.1 0 Nồng độ peptit (mg/ml) Hình P.2: Đường chuẩn xác định hàm lượng peptit Luận văn thạc sỹ khoa học 87 2009 - 2011 Trương Thị Ngọc Hồi Công nghệ sinh học Bảng B.3: Ảnh hưởng tỷ lệ E/S thời gian phản ứng tới hàm lượng peptit tạo thành sau thủy phân protein đậu tương trypsin E/S Thời gian (h) 1: 1: 1: 1:10 1:15 0,86 0,98 0,35 0,33 0,25 0.5 4.32 4,05 3,97 3,64 3,20 4.52 4,18 4,11 4,02 3,53 4.62 4,17 4,13 4,00 3,55 4.62 4,19 4,15 4,04 3,56 4.63 4,20 4,14 4,05 3,59 4.63 4,23 4,17 4,09 3,57 Bảng B.4: Nồng độ peptit dịch thủy phân nhiệt độ phản ứng khác thủy phân protein đậu tương trypsin Nhiệt độ (oC) Nồng độ peptit (mg/ml) 27 30 37 40 45 3,56 3,8 4,0 5,1 4,48 Bảng B.5: Nồng độ peptit dịch thủy phân giá trị pH khác thủy phân protein đậu tương trypsin pH 6,5 7,6 8,5 Nồng độ peptit (mg/ml) 3,59 3,6 3,84 3,07 2,15 Luận văn thạc sỹ khoa học 88 2009 - 2011 Trương Thị Ngọc Hồi Công nghệ sinh học Bảng B.6: Ảnh hưởng tỷ lệ E/S thời gian phản ứng tới hàm lượng peptit tạo thành sau thủy phân protein đậu tương pepsin E/S Thời gian (h) 1:1 1:5 1:10 1:15 1:20 0,30 0,83 0,90 0,94 0,70 0.5 2,12 2,90 3,70 3,40 3,04 2,27 3,44 4,86 4,09 3,80 2,96 4,94 5,78 5,40 5,38 2,97 4,95 5,78 5,43 5,39 2,95 4,98 5,79 5,42 5,41 2,94 4,97 5,81 5,45 5,42 Bảng B.7: Nồng độ peptit dịch thủy phân nhiệt độ phản ứng khác thủy protein đậu tương pepsin Nhiệt độ( oC) Nồng độ peptit (mg/ml) 25 30 37 40 45 2,38 2,48 2,94 2,26 1,58 Bảng B.8: Nồng độ peptit dịch thủy phân giá trị pH khác thủy phân protein đậu tương pepsin pH Nồng độ peptit (mg/ml) Luận văn thạc sỹ khoa học 4,06 4,17 4,00 2,97 2,79 2,15 89 2009 - 2011 Trương Thị Ngọc Hồi Công nghệ sinh học Bảng B.9: Ảnh hưởng tỷ lệ E/S thời gian phản ứng tới hàm lượng peptit tạo thành sau thủy phân protein đậu tương dịch protease E/S ( %v/v) Thời gian (ph) 1,5 2,5 1,07 1,14 1,23 1,38 1,17 10 1,59 1,92 2,67 2,84 2,20 20 2,19 2,36 3,03 3,23 2,63 40 2,20 3,99 4,96 5,25 4,89 60 2,21 4,08 4,95 5,55 5,03 80 2,20 4,10 4,98 5,57 5,00 100 2,18 4,09 5,01 5,59 5,02 Bảng B.10: Nồng độ peptit dịch thủy phân nhiệt độ phản ứng khác thủy protein đậu tương dịch protease Nhiệt độ (oC) 25 30 37 40 45 Nồng độ peptit (mg/ml) 1,45 5,48 6,01 5,48 4,95 Bảng B.11: Nồng độ peptit dịch thủy phân giá trị pH khác thủy phân protein đậu tương dịch protease pH 9,5 10 10,5 11 Nồng độ peptit (mg/ml) 5,32 5,41 5,14 4,39 4,1 Luận văn thạc sỹ khoa học 90 2009 - 2011 ... Nghiên cứu thu nhận peptit kìm hãm enzym chuyển hóa angiotensin từ thủy phân protein đậu tương enzym khả ứng dụng Mục tiêu đề tài: Nghiên cứu, lựa chọn enzym thủy phân protein đậu tương để thu. .. việt Đậu tương nguồn protein tiềm cho peptit sinh học Một vài peptit có khả kìm hãm ACE phát dịch thu phân đậu tương enzym tripsin Năm 2003, 2004 Chen cộng [20] phát peptit kìm hãm ACE trình thủy. .. Phương pháp nghiên cứu 39 2.2.1 Chuẩn bị dịch thủy phân protein đậu tương 39 2.2.2 Phương pháp lên men thu protease phương pháp thu nhận peptit từ dịch thủy phân protein đậu tương