luận văn thạc sĩ nghiên cứu nhân dòng và biểu hiện gen lipl21 mã hóa lipoprotein từ leptospira interrogans trong escherichia coli

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Đặng Thị Quỳnh NGHIÊN CỨU NHÂN DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN LipL21 MÃ HÓA LIPOPROTEIN TỪ Leptospira interrogans TRONG Escherichia coli LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM Hà Nội – tháng 04 năm 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Đặng Thị Quỳnh NGHIÊN CỨU NHÂN DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN LipL21 MÃ HÓA LIPOPROTEIN TỪ Leptospira interrogans TRONG Escherichia coli Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 19811017 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS TS Nghiêm Ngọc Minh Hà Nội - 2021 i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học riêng Các số liệu sử dụng phân tích luận văn có nguồn gốc rõ ràng, công bố theo quy định Các kết luận văn chưa công bố nghiên cứu khác Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Học viên Đặng Thị Quỳnh LỜI CẢM ƠN Hồn thành đề tài nghiên cứu này, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Nghiêm Ngọc Minh – Viện Nghiên cứu hệ gen – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tận tình bảo, hướng dẫn, giúp đỡ động viên tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Đồng thời, xin gửi lời cảm ơn trân trọng tới lãnh đạo Viện Nghiên cứu hệ gen thầy cô Học viện Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi, tận tình giúp đỡ suốt trình học tập nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Võ Thị Bích Thủy – trưởng phịng Hệ gen học vi sinh cán bộ, học viên, sinh viên thuộc phòng Hệ gen học vi sinh, người giúp đỡ tơi nhiều để tơi hồn thành đề tài nghiên cứu Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình bạn bè động viên, khuyến khích tơi suốt q trình học tập thực khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Học viên Đặng Thị Quỳnh DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Amp Ampicillin APS Ammonium persulphate bp Base pair BSA Bovine Serum Albumins (Huyết bò) CBB Comassie Brilliant Blue DNA Deoxyribonucleic acid E coli Escherichia coli EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Acid IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside kb Kilobase kDa KiloDalton L interrogans Leptospira interrogans L Bataviae Leptospira interrogans serovar Bataviae L Canicola Leptospira interrogans serovar Canicola L Grippotyphosa Leptospira interrogans serovar Grippotyphosa L Icterohaemorrhagiae Leptospira interrogans serovar Icterohaemorrhagiae L Pomona Leptospira interrogans serovar Pomona LB Luria Bertani LPS Lipopolysaccaride OD Optical density PBS Phosphate buffer saline PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng khuếch đại gen) RNA Ribonucleic acid SDS Sodium dodecyl sulfate TBST Tris-buffered saline với Tween 20 TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Ưu loại vector pET 15 Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi LipL21 Fw/Rv 27 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 29 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng gắn gen vào vector nhân dòng 31 Bảng 2.4 Thành phẩn phản ứng gắn 35 Bảng 2.5 Công thức pha gel tách 37 Bảng 2.6 Công thức pha gel cô 37 Bảng 2.7 Định lượng protein phương pháp Bradford 40 Bảng 3.1 Các vị trí nucleotide khác biệt năm chủng Leptospira 45 Bảng 3.2 Trình tự vùng epitope dự đoán gen Lipl21 46 Bảng 3.3 Kết đo độ hấp thụ BSA bước sóng 595nm 63 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Tỷ lệ mắc bệnh Leptospirosis người hàng năm tồn cầu Hình 1.2 Hình dạng Leptospira interrogans kính hiển vi (KHV) điện tử quét Hình 1.3 Cấu trúc màng xoắn khuẩn Leptospira interrogans [2] 11 Hình 1.4 Bản đồ gen vector nhân dịng pJET 1.2 (Thermo Scientific) 14 Hình 1.5 Bản đồ gen vector biểu pET (Novagen) 18 Hình 1.6 Bản đồ gen vector biểu pGEX-6P-3 (Merch) 19 Hình 1.7 Đánh giá khả gây miễn dịch số chủng Leptospira sử dụng kháng huyết LipL32 tinh chế từ thỏ 22 Hình 1.8 Đánh giá tiêu chuẩn hóa nồng độ kháng nguyên tái tổ hợp LipL32 pha loãng huyết với tỉ lệ 1:1000 24 Hình 3.1 Trình tự nucleotit gen LipL21 tương đồng đối chiếu từ chủng vi khuẩn L interrogans Tên chủng vi khuẩn ký hiệu: 44 Hình 3.2 Trình tự axit amin gen LipL21 45 Hình 3.3 Điện di đồ sản phẩm PCR nhân gen LipL21 48 Hình 3.4 Điện di đồ sản phẩm PCR nhân gen LipL21 từ plasmid khuẩn lạc 1, 2, 3, 4, 49 Hình 3.5 Kết so sánh trình tự gen LipL21 chủng L Bataviae trình tự gen LipL21 vector nhân dịng pJET-LipL21 50 Hình 3.6 Điện di đồ sản phẩm vector pJET- LipL21 51 Hình 3.7 Điện di đồ sản phẩm plasmid pET 32a 52 Hình 3.8 Điện di đồ sản phẩm cắt vector pJET-LipL21 enzyme giới hạn EcoRV XhoI 53 Hình 3.9 Điện di đồ sản phẩm cắt vector pET32a enzyme giới hạn EcoRV XhoI 53 Hình 3.10 Điện di đồ kiểm tra khuẩn lạc với cặp mồi T7 promoter Fw/ T7 terminater Rv 54 Hình 3.11 Điện di đồ kiểm tra khuẩn lạc với cặp mồi LipL21 Fw/Rv 55 Hình 3.12 Điện di đồ kiểm tra biểu protein LipL21 E coli BL21 57 Hình 3.13 Điện di đồ kiểm tra biểu LipL21 E coli BL21 điều kiện nhiệt độ nuôi cấy cảm ứng khác 58 Hình 3.14 Điện di đồ kiểm tra biểu LipL21 E coli BL21 điều kiện nồng độ cảm ứng IPTG khác 60 Hình 3.15 Điện di đồ kiểm tra biểu LipL21 E coli BL21 điều kiện thời gian cảm ứng IPTG khác 61 Hình 3.16 Đồ thị đường chuẩn BSA 63 Hình 3.17 Nồng độ protein phân đoạn tinh thu định lượng Bradford 64 Hình 3.18 Điện di đồ kiểm tra biểu pET32a-LipL21 E coli BL2 tinh 65 Hình 3.19 Phản ứng Western Blot kháng nguyên tái tổ hợp LipL21 với kháng thể thu từ huyết chuột 66 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH LETOSPIROSIS 1.1.1 Tổng quan tình hình giới 1.1.2 Tổng quan tình hình nước 1.2 VI KHUẨN LEPTOSPIRA i ii iii v vi viii 2 1.2.1 Giới thiệu chung vi khuẩn Leptospira 1.2.2 Đặc điểm cấu trúc hệ gen vi khuẩn Leptospira 10 1.2.3 Gen LipL21, protein LipL21 liên quan đến độc lực vi khuẩn Leptospira tính ứng dụng 12 1.3 NHÂN DỊNG VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN NGOẠI LAI 1.3.1 Biểu protein ngoại lai E coli 1.3.2 Nhân dòng biểu gen vi khuẩn Leptospira interrogans 13 13 20 CHƯƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU27 2.1 NGUYÊN LIỆU, MÁY MĨC 27 2.1.1 Ngun liệu hóa chất 2.1.2 Máy móc, dụng cụ thí nghiệm 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 28 29 2.2.1 Phương pháp nhân dòng gen LipL21 vào vector pJET1.2 29 2.2.2 Phương pháp biểu gen LipL21 E coli BL21 32 2.2.3 Phương pháp thu, tinh sạch, đánh giá khả đáp ứng miễn dịch protein LipL21 tái tổ hợp 36 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 TẠO VECTOR MANG GEN LIPL21 43 43 APDV.000676 8(1).2020 712 impart resistance to colonization and reduce the tissue damage[23] To the best of our knowledge, this is the first research of rLipL21 production as a vaccine candidate against Leptospirosis in Vietnam However, further studies are needed to evaluate the effectiveness of this recombinant protein before it can be produced as a complete vaccine used in livestock production Conclusion This study showed that the potential of rLipL21 as a multiepitope antigen against five common Leptospira strains in Vietnam Immunized mice showed a strong antigen-specific immune response, a reduction in tissue damage and colonization and an increasing survival rate in challenge experiments Thus, the rLipL21 may be recommended as promising vaccine candidate against Leptospirosis Acknowledgement This research was funded by the VETVACO Join Stock Company, Vietnam References Dutta TK, Christopher M (2005) Leptospirosis-An overview J Assoc Physicians India 53: 545-551 Loan HK, Van Cuong N, Takhampunya R, Kiet BT, Campbell J, et al (2015) How important are rats as vectors of leptospirosis in the Mekong Delta of Vietnam? Vector Borne Zoonotic Dis 15(1): 56-64 Lee HS, Khong NV, Xuan HN, Nghia VB, Nguyen VH, et al (2017) Seroprevalence of specific leptospira serovars in fattening pigs from provinces in Vietnam BMC Vet Res 13(1): 125 Langston CE, Heuter KJ (2003) Leptospirosis: A re-emerging zoonotic disease Vet Clin North Am Small Anim Pract 33(4): 791-807 Cullen PA, Haake DA, Adler BJF (2004) Outer membrane proteins of pathogenic spirochetes FEMS Microbiol Rev 28(3): 291-318 Gebriel A, Subramaniam G, Sekaran SJTB (2006) The detection and characterization of pathogenic leptospira and the use of OMPs as potential antigens and immunogens Trop Biomed 23(2): 194-207 Cullen PA, Cordwell SJ, Bulach DM, Haake DA, Adler BJI, et al (2002) Global analysis of outer membrane proteins from Leptospira interrogans serovar Lai Infect Immun 70(5): 2311-2318 Cullen PA, Xu X, Matsunaga J, Sanchez Y, Ko AI, et al (2005) Surfaceome of Leptospira spp Infect Immun 73(8): 4853-4863 Lin Xa, Zhao J, Qian J, Mao Y, Pan J, Li L, et al (2010) Identification of immunodominant B-and T-cell combined epitopes in outer membrane lipoproteins LipL32 and LipL21 of Leptospira interrogans Clin Vaccine Immunol 17(5): 778-783 10 Seenichamy A, Bahaman AR, Mutalib AR, Bejo KS (2014) Production and characterization of a polyclonal antibody of anti-rLipL21-IgG against Leptospira for early detection of acute leptospirosis BioMed Res Int 2014 11 Cruz LS, Vargas R, Lopes AAJE (2009) Leptospirosis: A worldwide resurgent zoonosis and important cause of acute renal failure and death in developing nations Ethn Dis 19(1 Suppl 1): S137-S141 12 Samina I, Brenner J, Moalem U, Berenstein M, Cohen A, et al (1997) Enhanced antibody response in cattle against Leptospira hardjo by intradermal vaccination Vaccine 15(12-13): 1434-1436 13 Bharti AR, Nally JE, Ricaldi JN, Matthias MA, Diaz MM, et al (2003) Leptospirosis: A zoonotic disease of global importance Lancet Infect Dis 3(12): 757-771 14 Yu K, Liu C, Kim BG, Lee D-YJ (2015) Synthetic fusion protein design and applications Biotechnol Adv 33(1): 155-164 15 Rollauer SE, Sooreshjani MA, Noinaj N, Buchanan SK (2015) Outer membrane protein biogenesis in gram-negative bacteria Philos Trans R Soc B 370(1679): 20150023 16 Xiao G, Luo D, Kong L, Chen X, Sun D, et al (2016) Chimeric epitope vaccine against Leptospira interrogans infection and induced specific immunity in guinea pigs BMC Microbiol 16(1): 1-9 17 Kumari A, Premlatha MM, Raja V, Mercy CSA, Sumathi K, et al (2018) Protective immunity of recombinant LipL21 and I-LipL21 against Leptospira interrogans serovar Autumnalis N2 infection J Infect Dev Ctries 12(1): 22-30 18 Srikram A, Zhang K, Bartpho T, Lo M, Hoke DE, et al (2011) Crossprotective immunity against leptospirosis elicited by a live, attenuated lipopolysaccharide mutant J Infect Dis 203(6): 870-879 19 Vilaysane A, Chun J, Seamone ME, Wang W, Chin R, et al (2010) The NLRP3 inflammasome promotes renal inflammation and contributes to CKD J Am Soc Nephrol 21(10): 1732-1744 20 Xiang M, Shi X, Li Y, Xu J, Yin L, et al (2011) Hemorrhagic shock activation of NLRP3 inflammasome in lung endothelial cells J Immunol 187(9): 4809-4817 21 Matsui M, Rouleau V, Ostells BL, Goarant C (2011) Gene expression profiles of immune mediators and histopathological findings in animal models of leptospirosis: comparison between susceptible hamsters and resistant mice Infect Immun 79(11): 4480-4492 22 Verma A, Stevenson B (2012) Leptospiral uveitis-there is more to it than meets the eye! Zoonoses Public Health 59 (Suppl 2): 132-141 23 Zuerner RL (2015) Host response to leptospira infection Curr Top Microbiol Immunol 387: 223-250 For possible submissions Click below: Appro Poult Dairy & Vet Sci Submit Article Copyright © : Vo Thi Bich Thuy ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Đặng Thị Quỳnh NGHIÊN CỨU NHÂN DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN LipL21 MÃ HÓA LIPOPROTEIN TỪ Leptospira. .. MANG GEN LIPL21 43 43 3.2 3.3 TẠO VECTOR BIỂU HIỆN GEN LipL21 TRONG E coli BL21 BIỂU HIỆN PROTEIN LIPL21 TRONG E coli BL21 50 56 3.3.1 Biểu protein LipL21 E coli BL21 3.3.2 Tối ưu điều kiện biểu. .. chủng Leptospira interrogans Việt Nam Chính lý trên, chúng tơi tiếp tục thực đề tài: ? ?Nghiên cứu nhân dòng biểu gen LipL21 mã hóa cho Lipoprotein từ Leptospira interrogans Escherichia coli? ?? với