Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa endoglucanase gh9 có nguồn gốc từ dna đa hệ gen của vi khuẩn xung quanh khu nấm mục trắng thủy phân gỗ trong tế bào escherichia coli (khóa luận tốt nghiệp)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA endoglucanase GH9 CÓ NGUỒN GỐC TỪ DNA ĐA HỆ GEN CỦA VI KHUẨN XUNG QUANH KHU NẤM MỤC TRẮNG THỦY PHÂN GỖ TRONG TẾ BÀO ESCHERICHIA COLI” Hà Nội - 2021 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA endoglucanase GH9 CÓ NGUỒN GỐC TỪ DNA ĐA HỆ GEN CỦA VI KHUẨN XUNG QUANH KHU NẤM MỤC TRẮNG THỦY PHÂN GỖ TRONG TẾ BÀO ESCHERICHIA COLI” Người thực hiện: Lê Thu Hồi Ngành: Cơng nghệ sinh học Người hướng dẫn: PGS.TS Đỗ Thị Huyền GS.TS Phan Hữu Tôn Hà Nội - 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu trung thực chưa công bố Nội dung lý thuyết có khóa luận tơi có tham khảo số tài liệu trích dẫn mục tài liệu tham khảo Mọi giúp đỡ cho việc thực khóa luận cám ơn Tơi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với lời cam đoan trên! Hà nội, ngày tháng năm Sinh viên thực Lê Thu Hoài i LỜI CẢM ƠN Để báo cáo khóa luận tốt nghiệp hồn thành, xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến PGS.TS Đỗ Thị Huyền GS.TS Phan Hữu Tôn theo sát hướng dẫn giúp đỡ tơi tận tình suốt thời gian tơi thực khóa luận tốt nghiệp Cơng trình thực nguồn kinh phí đề tài NĐT.50.GER/18 GS Trương Nam Hải làm chủ nhiệm Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới giúp đỡ tạo điều kiện Chủ nhiệm đề tài ban Lãnh đạo phòng Kỹ thuật Di truyền - Viện Công nghệ Sinh học tạo điều kiện thuận lợi cho thực đề tài Xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam truyền đạt cho kiến thức định hướng thật quý báu ngành học Trong khoảng thời gian thực khóa luận tốt nghiệp tơi nhận hướng dẫn hỗ trợ tận tình tất chú, anh chị cán phòng Kỹ thuật Di truyền, đặc biệt anh Nguyễn Hải Đăng, cô Đỗ Thị Huyền, cô Nguyễn Thị Q Bởi lẽ tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành ấm áp đến tất anh chị cán phòng giúp đỡ Đặc biệt lời cảm ơn cuối muốn giành cho gia đình, bạn bè, người thân yêu bên cạnh ủng hộ, giúp đỡ tất phương diện Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà nội, ngày tháng năm Sinh viên thực Lê Thu Hoài ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục đích yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Nội dung nghiên cứu Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung endoglucanase 2.1.1 Đặc điểm cấu trúc phân loại 2.1.2 Tính chất endoglucanase 2.1.3 Giới thiệu chung glycoside hydrolase họ (GH8) 2.2 Ứng dụng enzyme endoglucanase 2.2.1 Ứng dụng công nghiệp sinh học 2.2.2 Ứng dụng sản xuất cồn sinh học 2.2.3 Ứng dụng ngành công nghiệp 2.2.4 Ứng dụng công nghiệp thực phẩm 2.2.5 Ứng dụng ngành dệt may 2.3 Biểu gen E coli vector biểu pET22b(+) Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 3.1 Vật liệu nghiên cứu 10 3.2 Phương pháp nghiên cứu 15 iii Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 4.1 Thiết kế vector biểu gen cải biến mã ba gen eg9 21 4.2 Biến nạp biểu enzyme EG9 chủng E coli khác 23 4.3 Ảnh hưởng thời điểm cảm ứng đến biểu protein EG9 25 4.4 Nghiên cứu lựa chọn mơi trường thích hợp cho sinh tổng hợp EG9 26 4.5 Ảnh hưởng nồng độ IPTG đến biểu protein EG9 28 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 30 5.1 Kết luận 30 5.2 Kiến nghị 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 31 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT EG Endoglucanase COS Cello-oligosaccharide GH Glycoside hydrolase DNA Deoxyribonucleic acid LB Luria- Bertani medium Amp Ampicillin IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside RNA Ribonucleic acid DNTP Deoxyribonucleotide triphosphate EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid APS Amonium persulfate Bp Base pairs Kb Kilobase kDa KiloDalton OD Optical density SDS Sodium dodecyl sulfate PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis TAE Tris-acetate-EDTA TEMED Tetramethylethelenediamine v DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng Thành phần loại môi trường nghiên cứu lựa chọn biểu 11 Bảng Thành phần gel polyacrylamide 13 Bảng Thành phần phản ứng cắt 18 vi DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang Hình 2.1 Cấu trúc khơng gian protein EG9 Hình 4.1 Trình tự gen eg9 gốc trình tự cải biến mã hóa cho endoglucanase GH8 22 Hình 4.2 Phân tích sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp pET22-eg9 gel điện di agarose 1% 23 Hình 4.3 Phân tích protein tổng số chủng biểu Rosetta, JM109, Soluble, Origami, C43 mang pET22-eg9 (A) protein pha tổng số (TS), pha tan, pha tủa biểu củng Rosetta (B) 24 Hình 4.4 Phân tích protein pha tổng số (TS), pha tan, pha tủa cảm ứng thời điểm khác củng Rosetta 25 Hình 4.5 Phân tích kết ni cấy chủng E coli Rosetta biểu EG9 môi trường khác 27 Hình 4.6 Phân tích kết nuôi cấy chủng E coli Rosetta biểu EG9 nồng độ chất cảm ứng khác 29 vii Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài Nguồn nhiên liệu sinh học sản xuất từ sinh khối lignocellulose có khả giảm khí thải carbon, đồng thời tăng hiệu sử dụng lượng giảm phụ thuộc vào lượng quốc gia Đây nguồn hữu dồi có khả sản xuất hóa chất nhiên liệu tái tạo với chi phí thấp Nguồn sinh khối tự nhiên có nguồn gốc từ chất thải cơng nghiệp (mùn cưa, chất thải nhà máy giấy chất thải công nghiệp thực phẩm), chất thải lâm nghiệp (gỗ cứng gỗ mềm), phụ phẩm nông nghiệp (rơm rạ, stover hạt phi thực phẩm), chất thải (chất thải nhà bếp, nước thải giấy thải), chất thải rắn thị (Lü, Sheahan, Fu 2011) Cellulase nhóm enzyme chuyển hóa cellulose nguồn sinh khối lignocellulose tự nhiên thành đường gluclose nguồn đường vi sinh vật chuyển hóa thành cồn sinh học sản phẩm có giá trị khác Trong số cellulase này, endoglucanase cellulase đóng vai trị quan trọng q trình thủy phân sinh khối thực vật chúng có khả phân cắt ngẫu nhiên sợi cellulose để giúp beta-glucosidase cellobiohydrolase hoạt động giải phóng glucose Các endoglucanase khác phân cắt liên kết glycosidic khác β -1-4-endoglucanase enzyme phổ biến Chúng phân cắt β -1-4- bên liên kết glycoside chuỗi cellulose Tuy nhiên, việc tìm enzyme có hoạt tính mạnh, phân cắt nhanh thách thức lớn với nhà khoa học để sản xuất sản phẩm chuyển hóa từ nguồn sinh khối cạnh tranh thị trường Trong nghiên cứu để tìm kiếm endoglucanase có hoạt tính tốt, chúng tơi lựa chọn trình tự từ liệu giải trình tự DNA metagenome vi khuẩn mùn xung quanh khu nấm mục trắng thủy phân gỗ, mã hóa cho endoglucanase GH8 để nghiên cứu biểu hiện, kiểm tra hoạt tính Bảng Thành phần phản ứng cắt Thành phần phản ứng H2O Thể tích (µl) 5.7 5.7 5.4 Tango 2X (10X) 1 DNA (50 ng/µl) 3 NcoI (5U/µl, Fermentas) 0.3 0.3 XhoI (5U/µl, Fermentas) 0.3 Tổng 10 10 0.3 10 Hỗn hợp phản ứng trộn đều, ủ nhiệt độ 37oC Sản phẩm phản ứng cắt kiểm tra cách điện di gel agarose 0,8% 3.2.4 Điện di protein gel polyacrylamide – SDS  Cơ sở lý thuyết Trong phương pháp chạy điện di SDS-PAGE, protein bao bọc xung quanh chất tích điện âm có tính oxi hóa mạnh SDS có dung dịch đệm xử lý mẫu Do protein trở thành dạng thẳng tích điện âm Dưới tác dụng điện trường đều, protein có điện tích âm chạy cực dương Các phân tử di chuyển với tốc độ khác tùy thuộc vào kích thước phân tử mà khơng phụ thuộc vào điện tích hay hình dạng chúng  Quy trình thực - Tháo lược đặt gel vào bể điện di từ từ đổ ngập gel dung dịch đệm chạy 18 - Tra mẫu protein: mẫu protein biến tính dung dịch xử lý mẫu 6X (tỉ lệ mẫu/đệm xử lý 5/1) 100oC 10 phút sau để nhanh lên đá phút Ly tâm nhanh để loại bỏ cặn - Điện di dòng điện chiều với hiệu điện 100 V 10 mA khoảng 15 phút cho mẫu qua gel sau tăng cường độ dịng điện lên 20 mA tiếp tục điện di khoảng 45 phút - Gel sau chạy điện di xong gỡ nhuộm dung dịch coomassie brilliant blue 30 phút Sau gel rửa lần dung dịch rửa 3.2.5 Chuẩn bị tế bào E coli khả biến - Cấy chuyền khuẩn lạc E coli ml môi trường LB lỏng, lắc 200 vòng/phút 37oC qua đêm - Chuyển ml dịch tế bào sang môi trường LB, tiếp tục nuôi cấy điều kiện tới nồng độ tế bào OD600 đạt 0,4-0,6 (khoảng 2h) Chia ống falcon ống 40 ml dịch tế bào đặt đá khoảng 30 phút đến - Li tâm thu tế bào 3000 vòng/phút phút 4oC - Thu tủa box cấy - Hòa tủa tế bào 40 ml CaCl 0,1 M Để mẫu đá 15 phút - Li tâm thu tế bào 3000 vòng/phút 4oC 10 phút, sau thu tủa - Hịa tủa 1-2 ml CaCl 0,1M Bổ sung 15% glycerol (0,25 ml glycerol 80% cho ml tế bào khả biến) - Chia vào ống Eppendorf 40 µl dung dịch tế bào để sử dụng trực tiếp cho biến nạp bảo quản -80oC 19 3.2.6 Biến nạp ADN plasmid vào tế bào E coli sốc nhiệt  Cơ sở lý thuyết Thông thường tế bào trì điện màng cách bơm proton từ bên dịch bào bên ngoại bào Do tế bào bên tích điện âm so với tế bào bên Sốc nhiệt gây giãn nở đột ngột thành màng tế bào, làm lỗ màng mở nhanh Lỗ màng tế bào khả biến tích điện dương xử lý tế bào với ion Ca++ hút DNA tích điện âm lên bề mặt lỗ màng Số nhiệt làm giảm điện màng, tạo điều kiện thuận lợi để DNA qua lớp màng vào tế bào Kỹ thuật hoạt động tốt DNA plasmid dạng vịng  Quy trình biến nạp - Lấy tế bào khả biến từ -80oC, để đá 30 phút để tế bào tan từ từ (tránh bị sốc nhiệt) - Bổ sung μl ADN plasmid vào ống tế bào khả biến, đảo nhẹ nhàng đầu côn để ADN phân bố dịch tế bào khả biến Sau đó, đặt tồn mẫu đá thời gian 5-10 phút - Mẫu đặt đá chuyển vào bể ổn nhiệt 42oC phút 30 giây Sau đó, đặt mẫu lên đá lạnh phút Bổ sung 500 µl LB lỏng, nuôi lắc 37oC 45 phút - Hút dịch tế bào cấy trải đĩa LBA Ủ đĩa 37oC qua đêm Chỉ tế bào chứa ADN plasmid (chứa gen kháng Amp) có khả mọc tạo khuẩn lạc đĩa LBA Thực song song với đối chứng âm tế bào E coli khả biến không bổ sung ADN plasmid tái tổ hợp, cấy trải đĩa LBA LB 20 Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thiết kế vector biểu gen cải biến mã ba gen eg9 Trình tự gen eg9 mã hóa cho enzyme trưởng thành (gen GL0183420 khơng chứa vùng gen mã hóa tín hiệu tiết) kiểm tra mức độ phù hợp mã ba với mã ba E coli phần mềm tìm kiếm mã Genscript (Mỹ) Sau gen eg9 tối ưu mã ba cho phù hợp với mã ba chủng biểu E coli Gen mã hóa enzyme hồn thiện (khơng chứa trình tự tín hiệu tiết gồm 1269 nucleotide) kiểm tra mức độ phù hợp mã ba cho việc biểu gen tế bào E coli Kết cho thấy gen có 70,84% GC, số phù hợp mã ba (CAI: codon adaptation index) đạt 0,75 phần trăm mã 6% Với kết này, tỷ lệ % GC gen cao cho việc biểu gen E coli Bên cạnh đó, 6% mã ảnh hưởng tới mức độ dịch mã gen Vì vậy, gen tối ưu mã ba để tăng số phù hợp lên 0,92, loại bỏ 100% mã tỷ lệ % GC giảm xuống cịn 66,88% Trình tự gen gốc gen tối ưu mã ba mô tả hình 4.1 Gen sau bổ sung thêm trình tự mã hóa vị trí nhận biết enzyme hạn chế NcoI đầu 5', XhoI đầu 3' cho gen dịch mã khung đọc vector pET22b(+) đặt tổng hợp, chuyển vào vector pET22b(+) để tạo vector pET22-eg9 21 Cải biến Gen gốc GCG ACC GCG ACC AAG CCG GCT GCG CAA CCG GCG GGT CGT GCG GCG GCG GCG GCG AGC GCG A T T A T C G C T C G T C C C TCT C 60 Cải biến Gen gốc GCG CCG GCG TGC GAC GAT TGG CGT AGC TAC CGT AAC TTC GTG ACC CGT TTT GTT CAG CAA T C C T C C C C G G 120 Cải biến Gen gốc GAC GGT CGT GTG GTT GAT TTC AGC ACC CCG CAG CAA CAG ACC ACC AGC GAG GGT CAA AGC C C C C C TCG G G G TC A G G TCG 180 Cải biến Gen gốc TAT GCG ATG TTC TTT GCG CTG GTT GCG AAC GAC CGT GCG AGC TTC GAA CGT CTG CTG CAT T C C C C G G C 240 Cải biến Gen gốc TGG ACC CGT GCG AAC CTG AGC GCG GGT CGT TTT GAC GCG AAC GAT CTG AAG CTG CCG GCG C T TC A C C C T C C A 300 Cải biến Gen gốc TGG CAG TGG GGT CGT AAA CCG GAT GGT AGC TAC GGC GTT CTG GAC CCG AAC AGC GCG AGC C C G C C C TCG G C T TCG TC 360 Cải biến Gen gốc GAC GCG GAT CTG TGG ATC GCG TAC GAC CTG TTC GAG GCG GGT CGT CTG TGG CAC GAA CCG T C C C G A G 420 Cải biến Gen gốc AGC TAT ACC CAA CTG GCG TGG GCG CTG ATC ACC CAA ATT GCG AAA CAG GAA GTG AGC ACC TCG C G G C G G C G G 480 Cải biến Gen gốc CTG GAC GGT CTG GGT CCG ATG CTG CTG CCG GGT CCG CAG GGC TTT CGT AAC GGT GGC ACC C C G T G A G G C G 540 Cải biến Gen gốc ACC CGT CTG AAC CCG AGC TAC CTG CCG CTG CCG CTG CTG CGT GCG CTG GCG GCG GAA GCG G G C T A T C C C C 600 Cải biến Gen gốc CCG AGC GGT CCG TGG GCG AGC ATC GCG GCG AAC GCG TAT ACC CTG GTG CGT ACC ACC GCG TC C G C C A.G 660 Cải biến Gen gốc CCG CGT GGT TTC GCG CCG GAT TGG GCG GCG TGG CGT GAC GGC CGT TTT ATT GTG GAC CCG C C C C C C C C 720 Cải biến Gen gốc AAG AAC GGT GAT GTT GGC AGC TAC GAC GCG ATC CGT GTT TAT CTG TGG GCG GGT ATT ACC C C C T T C C T C C 780 Cải biến Gen gốc GCG CCG GCG GAC CCG CTG GCG AAA CCG TGG CTG GCG GCG CTG GAC GGT ATG CGT GCG CAA C C C G C C G 840 Cải biến Gen gốc ATT GCG CAA AGC GGC TAC CCG CCG GAG CGT GTT GCG ACC ACC AGC GGT GCG GCG CAA GGT C T C C C G C 900 Cải biến Gen gốc GAA GCG CCG CTG GGT TTC TGG GGC GCG CTG CTG CCG TAT TTT CGT GCG CTG AAC GAC ACC C C C C G 960 Cải biến Gen gốc CGT GCG GCG AGC CTG GCG CAG ACC CAC CTG GCG GCG CTG GAT GCG GCG AGC GCG AGC GCG C C T C A G T C C C TCT C 1020 Cải biến Gen gốc GCG GCG GCG GCG GGT GCG GCG GCG CCG CTG GGC ACC AGC GCG GGT GCG CCG GGC GCG ACC A C C A TC C A C G 1080 Cải biến Gen gốc AGC GCG GGC ACC AGC CTG AGC ATT GGC AAG AGC GCG GAT ACG CCG GGT GGC ACC CCG GCG TC A A TCT A TCG A TCT A C C C C T C A 1140 Cải biến Gen gốc CCG GTG TAC TAT GAC GAG GTT CTG ATG CTG TTC GGC ACC GGC TTT GCG GAT GGT CGT TAT C C A G C C C C C C 1200 Cải biến Gen gốc CAC TTT GAC GAT ACC GGC CGT CTG GTG CCG CGT TGG GAA AAC AGC TGC CAG ACC GCG CAC T C C G C G TCA A C 1260 Cải biến Gen gốc GCG CGT AGC 1269 C TCG Hình 4.1 Trình tự gen eg9 gốc trình tự cải biến mã hóa cho endoglucanase GH8 Trình tự gen eg9 vector tái tổ hợp kiểm tra giải trình tự gen, kiểm tra khung đọc Sau đó, vector pET22-eg9 tách với lượng lớn để dùng biến nạp vào chủng biểu cho biểu gen Plasmid pET22-eg9 sau tách chiết cắt kiểm tra enzyme giới hạn NcoIXhoI giữ -20oC Phức hợp phản ứng ủ 37oC giờ, sau điện di gel agarose 0.8% 22 M NcoI XhoI NcoI+XhoI Kb 10 − 8− 6− 5− 1.5 − 1− Hình 4.2 Phân tích sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp pET22-eg9 gel điện di agarose 1% Chú thích: M: DNA chuẩn kb (Fermentas) Kết (Hình 4.2) cho thấy vector pET22-eg9 sau cắt NcoI XhoI mở vịng thành dạng thẳng có kích thước kb với kích thước lý thuyết 6,8 kb (gồm 5,5 kb pET22b(+) 1,3 kb gen eg9) Gen eg9 đưa vào vector pET22b(+) hai enzyme giới hạn NcoI XhoI nên cắt cặp enzyme này, plasmid pET22-eg9 cắt thành hai băng có kích thước kb tương ứng với kích thước pET22b(+) 1,3 kb tương ứng kích thước gen eg9 (Hình 4.2) Như vector pET22-eg9 thiết kế tách chiết thành công 4.2 Biến nạp biểu enzyme EG9 chủng E coli khác Để so sánh tuyển chọn dịng vi khuẩn có khả biểu protein cao nhất, tiến hành biến nạp DNA plasmid pET22-eg9 vào chủng E coli khả biến bao gồm Rosetta, JM109, Origami, Soluble, C43 theo phương pháp sốc nhiệt Sambrook Russell (Sambrook Russell 2001) Plasmid pET22-eg9 biến nạp vào chủng biểu để tiến hành biểu gen Kết (Hình 4.3) cho thấy so với dịng đối chứng khơng cảm ứng, EG9 có kích thước khoảng 49 kDa biểu rõ 23 chủng Rosetta chủng C43, thể băng protein xuất vị trí cao vạch protein chuẩn có kích thước 45 kDa biểu với hàm lượng lớn, rõ ràng Ở chủng E coli khác Origami, Soluble JM109 băng có kích thước tương tự EG9 xuất với lượng nhỏ trùng với băng protein có kích thước tương tự đối chứng Do vậy, biểu EG9 chủng khó đánh giá Rosetta JM109 M (-) Origami Soluble (-) (-) (-) C43 M kDa − 116.0 − 66.2 −45.0 − 35.0 −25.0 − 18.4 − 14.4 kDa 116.0 − M TS Tan Tủa 66.2 − 45.0 − 35.0 − 25.0 − 18.4 − 14.4 − A B Hình 4.3 Phân tích protein tổng số chủng biểu Rosetta, JM109, Soluble, Origami, C43 mang pET22-eg9 (A) protein pha tổng số (TS), pha tan, pha tủa biểu củng Rosetta (B) Chú thích: M: thang protein chuẩn (Fermentas); 1-3: Các dòng khác chủng biểu hiện; (-) dịng khơng cảm ứng sinh tổng hợp EG9 IPTG Enzyme EG9 biểu chủng Rosetta chủ yếu dạng không tan (đường chạy số 3) thấy xuất băng protein pha tan (đường chạy 2) Ngoài sử dụng nước để siêu âm phá tế bào, sử dụng đệm PBS có pH khác (4, 5, 6, 7, 8, 9), đệm Tris có pH khác để siêu âm hòa tan EG9 khả tan EG9 không cải thiện Thông thường, enzyme biểu pha protein tan thường có cấu trúc bậc bậc xác nên có hoạt tính sinh học Để tăng khả biểu 24 protein dạng tan, có hoạt tính sinh học, chúng tơi tiến khảo sát điều kiện biểu môi trường nuôi cấy, nồng độ chất cảm ứng, thời điểm cảm ứng 4.3 Ảnh hưởng thời điểm cảm ứng đến biểu protein EG9 Thời điểm cảm ứng đóng vai trò quan trọng biểu nhiều loại protein tái tổ hợp Thơng thường, thời điểm cảm ứng thích hợp tế bào E coli OD 600 đạt khoảng 0,6-0,8 Tuy nhiên, với protein tái tổ hợp có khả ảnh hưởng xấu tới trao đổi chất tế bào việc cảm ứng sinh tổng hợp protein làm tế bào dừng sinh trưởng bị chết Với protein này, tế bào phải nuôi cấy đến gần pha cân nên cảm ứng sinh tổng hợp protein để có hội thu enzyme tốt Đối với protein tái tổ hợp khơng gây ảnh hưởng tới tế bào việc cảm ứng thời điểm khơng ảnh hưởng tới sản lượng protein tái tổ hợp thu Trong nghiên cứu này, tiến hành nuôi cấy cảm ứng chủng Rosetta mang gen eg9 thời điểm OD 600 đạt 0,2; 0,3; 0,5; 0.6; 0.8; 1,0 ni cấy lắc 170 vịng/phút 30oC Tổng số Tủa Tan 0.2 0.3 0.5 0.6 0.8 1.0 M 0.2 0.3 0.5 0.6 0.8 1.0 0.2 0.3 0.5 0.6 0.8 1.0 kDa −116.0 −66.2 −45.0 −35.0 −25.0 −18.4 −14.4 Hình 4.4 Phân tích protein pha tổng số (TS), pha tan, pha tủa cảm ứng thời điểm khác củng Rosetta Chú thích: M: thang protein chuẩn (Fermentas); 0,2; 0,3; 0,5; 0.6; 0.8; 1,0: OD thời điểm cảm ứng sinh tổng hợp EG9 IPTG 25 Kết cho thấy sinh khối mẫu khơng cảm ứng tính theo OD 600 đạt 2,2 tất mẫu cảm ứng thời điểm khác giao động từ 1,3 đến 1,5 khơng có sai khác có ý nghĩa thống kê Ở tất thời điểm cảm ứng, tế bào sinh tổng hợp enzyme EG9 với hàm lượng tương đương đánh giá tương đối điện di SDS-PAGE hầu hết enzyme tái tổ hợp nằm pha không tan Như nói EG9 sinh khơng ảnh hưởng tới sinh trưởng, phát triển tế bào thời điểm cảm ứng tế bào sinh tổng hợp EG9 OD 600 4.4 Nghiên cứu lựa chọn mơi trường thích hợp cho sinh tổng hợp EG9 Thành phần môi trường yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả biểu protein tái tổ hợp Mỗi loại protein tổng hợp mức độ khác môi trường khác nên việc thăm dị thành phần mơi trường phù hợp nhằm nâng cao sinh khối tế bào sản lượng riêng protein tái tổ hợp cần thiết Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cho thấy mơi trường thích hợp cho nhân giống sinh khối khơng thích hợp cho sản xuất protein tái tổ hợp Vì khảo sát khả biểu protein EG9 loại môi trường với thành phần khác (LB, PE, SB, TB TBD) Thí nghiệm tiến hành điều kiện cảm ứng với 0,5 mM IPTG, lắc 170 vòng/phút, 25ºC thời gian Kết hình 4.5A cho thấy mơi trường mơi trường PE cho sinh khối tế bào cao sau đến TBD đến môi trường TB Môi trường PE môi trường có chứa nguồn N phong phú nghèo nguồn carbon Như thấy chủng Rosetta mang gen mã hóa eg9 sử dụng đường cho sinh trưởng 26 (-) TS EG9 Sinh khối tế bào sau nuôi cấy cảm ứng TS LB 1.2 OD600 0.8 TS SB 0.6 0.4 T Nước KT TS PE KT (+) TB LB PE SB TS TBD TBcb TBD TB A T PE KT TS 0.2 LB KT SB T KT TBD TB T T B LB PE SB (-) M TS T KT TS T KT TS T KT TS TB TBD (-) M TS T KT TS T KT TS kDa 116.0 − 66.2 − 45.0 − 35.0 − 25.0 − C 18.4 − 14.4 − Hình 4.5 Phân tích kết ni cấy chủng E coli Rosetta biểu EG9 môi trường khác Chú thích: A Sinh khối tế bào thời điểm thu mẫu; B Kiểm tra hoạt tính endoglucanase pha protein tổng số (TS), tan (T), không tan (KT); C: Phân tích protein tổng hợp mơi trường khác SDS-PAGE (-) Dòng tế bào Rosetta mang pET22b(+); (+): cellulase (Sigma); M: Protein chuẩn (Fermentas) Mũi tên vị trí EG9 Kết điện di protein hình 4.5C cho thấy protein EG9 (~ 49 kDa) biểu môi trường nghiên cứu Đặc biệt EG9 nhìn thấy biểu pha tan môi trường LB, PE SB Mặc dù môi trường TB TB cải biến xuất băng vạch đậm tương đương kích thước EG9 chủ yếu lại nằm pha không tan (pha tủa) Kết kiểm tra hoạt tính thủy phân CMC đĩa thạch hình 4.5B cho thấy, dịng đối chứng khơng có khả phân hủy CMC chủng tái tổ hợp mang gen eg9 nuôi cấy môi trường đểu thể hoạt tính 27 thủy phân CMC tạo vịng sáng xung quanh khoanh giấy thấm dịch Trong pha tổng số, hoạt tính EG9 thể mạnh tế bào nuôi cấy môi trường LB, PE SB Hầu hết protein biểu pha không tan khơng có hoạt tính sinh học có yếu Chứng tỏ biểu dạng không tan, cấu trúc bậc enzyme khơng hồn thiện dẫn đến enzyme khơng có hoạt tính sinh học Trong đó, tất pha tan tế bào môi trường nuôi cấy có hoạt tính tốt Thậm chí, phần nhỏ EG9 biểu TB TBD thể hoạt tính sinh học Nhìn tổng thể thấy môi trường PE vừa cho sinh khối tế bào cao, vừa giúp enzyme biểu pha tan 25oC enzyme lại thể hoạt tính tốt Do vậy, thí nghiệm chúng tơi lựa chọn môi trường PE cho biểu enzyme EG9 lựa chọn nhiệt độ 25oC để biểu gen 4.5 Ảnh hưởng nồng độ IPTG đến biểu protein EG9 Nồng độ chất cảm ứng yếu tố có ảnh hưởng lớn đến mật độ tế bào hiệu suất biểu protein tái tổ hợp Vì vậy, việc thăm dị nồng độ chất cảm ứng có ý nghĩa thiết thực cho q trình sản xuất Nồng độ IPTG sử dụng cho cảm ứng sinh tổng hợp EG9 khảo sát 0,05; 0,1; 0,3; 0,6 0,9 mM Điều kiện nuôi cấy sinh tổng hợp EG9 môi trường PE với nhiệt độ cảm ứng 25ºC, lắc 170 vòng/phút Kết so sánh mật độ tế bào OD 600 từ mẫu cảm ứng cho thấy mẫu không cảm ứng cho sinh khối cao Tuy nhiên, cảm ứng nồng độ IPTG tăng dần, sinh khối tế bào thu có thấp so với đối chứng sai khác không đáng kể Do nói việc cảm ứng sinh tổng hợp EG9 không gây ảnh hưởng tới sinh trưởng chủng 28 Tổng số EG9nuôi cấy cảm ứng Sinh khối tế bào sau kDa 116.0 − OD600 nm 2.5 2.0 0.05 0.1 0.3 0.6 0.9 M 0.05 0.1 0.3 0.6 0.9 M 0.05 0.1 0.3 0.6 0.9 45.0 − 45.0 − 1.0 kDa 116.0 − 66.2 − 66.2 − 1.5 Tủa Tan 35.0 − 35.0 − 25.0 − 25.0 − 18.4 − 14.4 − 18.4 − 0.5 0.0 0.05 0.1 0.3 0.6 Nồng độ IPTG (mM) 0.9 Hình 4.6 Phân tích kết ni cấy chủng E coli Rosetta biểu EG9 nồng độ chất cảm ứng khác Chú thích: M: Protein chuẩn (Fermentas) Kết kiểm tra biểu protein EG9 phương pháp điện di SDS-PAGE cho thấy mẫu protein tổng số protein không tan thu nhận từ tế bào E coli Rosetta1 mang pET22-eg9 cảm ứng biểu IPTG sinh tổng hợp protein EG9 nồng độ chất cảm ứng IPTG thấp 0,05 mM Nhìn điện di thấy lượng enzyme tái tổ hợp biểu nồng độ IPTG khác khơng khác Trong đó, khoảng nửa EG9 biểu pha tan Trong nghiên cứu này, chọn nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,1 mM để biểu EG9 thí nghiệm sau Ngồi ra, chúng tơi tiến hành biểu EG9 nhiệt độ 20oC để xem với nhiệt độ thấp liệu enzyme có biểu tốt pha tan hay không Tuy nhiên, kết cho thấy tế bào sinh trưởng chậm 20oC, nguồn lượng sử dụng cho nuôi cấy tốn lượng enzyme tái tổ hợp thu pha tan không cải thiện so với 25oC Vì sau lựa chọn điều kiện cho biểu gen, thấy EG9 biểu tốt với khoảng 50% enzyme dạng tan tế bào E coli Rosetta mang gen eg9 nuôi cấy môi trường PE, với nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,1 mM, 25oC 29 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Gen eg9 từ liệu giải trình tự metagenome vi khuẩn mùn xung quanh khu nấm mục trắng thủy phân gỗ mã hóa endoglucanase GH8 biểu thành công E coli Trong mơi trường PE có 0,1 mM IPTG, tế bào E coli Rosetta mang gen eg9 sinh tổng hợp khoảng 50% EG9 dạng tan, có hoạt tính sinh học thủy chất CMC Đã biểu thành công gen eg9 mã hóa endoglucanase GH8 vi khuẩn mùn xung quanh khu nấm mục trắng thủy phân gỗ tế bào E coli Chủng E coli Rosetta biểu eg9 tốt so với chủng JM109, Origami, Soluble, C43 Trong mơi trường PE có 0,1 mM IPTG, tế bào E coli Rosetta mang gen eg9 sinh tổng hợp khoảng 50% EG9 dạng tan, có hoạt tính sinh học thủy chất CMC 5.2 Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu tinh chế enzyme để xác định đặc điểm sinh học enzyme, đánh giá khả ứng dụng enzyme vào thực tiễn 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO Aygan, A., L Karcioglu, B Arikan 2011 “Alkaline Thermostable and Halophilic endoglucanase from Bacillus Licheniformis C108” African Journal of Biotechnology 10(5): 789–96 Barbosa, Fernando c.s 2020 “Optimization of cello-oligosaccharides production by enzymatic hydrolysis of hydrothermally pretreated sugarcane straw using cellulolytic and oxidative enzymes” Biomass and Bioenergy 141: 105697 Bhat, M K., S Bhat 1997 “Cellulose Degrading Enzymes and Their Potential Industrial Applications” Biotechnology Advances 15(3): 583– 620 Chellapandi, P., Himanshu M Jani 2008 “Production of Endoglucanase by the Native Strains of Streptomyces Isolates in Submerged Fermentation” Brazilian Journal of Microbiology 39(1): 122–27 Davies, G J, B Henrissat 2002 “Structural Enzymology of CarbohydrateActive Enzymes: Implications for the Post-Genomic Era” Biochemical Society transactions 30(2): 291–97 Davies, Gideon J c.s 1993 “Structure and Function of Endoglucanase V” Nature 365(6444): 362–64 Henrissat, B c.s 1989 “Cellulase Families Revealed by Hydrophobic Cluster Analysi” Gene 81(1): 83–95 Hirvonen, Mika, Anastassios C Papageorgiou 2003 “Crystal Structure of a Family 45 Endoglucanase from Melanocarpus Albomyces: Mechanistic 31 Implications Based on the Free and Cellobiose-Bound Forms” Journal of Molecular Biology 329(3): 403–10 Karnaouri, Anthi c.s 2019 “Valorization of waste forest biomass toward the production of cello-oligosaccharides with potential prebiotic activity by utilizing customized enzyme cocktails” Biotechnology for Biofuels 12 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6902470/ (5 Tháng Giêng 2021) 10 Lin, Ling, Chenggen Fu, Weiqian Huang 2016 “Improving the Activity of the Endoglucanase, Cel8M from Escherichia Coli by Error-Prone PCR” Enzyme and Microbial Technology 86: 52–58 11 Lü, Jing, Con Sheahan, Pengcheng Fu 2011 “Metabolic Engineering of Algae for Fourth Generation Biofuels Production” Energy & Environmental Science 4(7): 2451–66 12 Ontañon, Ornella M c.s 2019 “A Thermostable GH8 Endoglucanase of Enterobacter Sp R1 Is Suitable for β-Glucan Deconstruction” Food Chemistry 298: 124999 13 Sambrook, Joseph, David William Russell 2001 Molecular Cloning: A Laboratory Manual CSHL Press 32