Trang 1 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------Phạm Thị Hồng Nhung NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN THỤ THỂ NEUROKININ-1 NGƯỜI TÁI TỔ HỢP TRÊN DÒNG TẾ BÀO
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - - Phạm Thị Hồng Nhung ận Lu NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN vă THỤ THỂ NEUROKININ-1 NGƯỜI TÁI TỔ HỢP n th TRÊN DÒNG TẾ BÀO CHO ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG ạc TRONG NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN DƯỢC PHẨM sĩ oa kh họ c LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - - Phạm Thị Hồng Nhung NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN Lu THỤ THỂ NEUROKININ-1 NGƯỜI TÁI TỔ HỢP ận TRÊN DÒNG TẾ BÀO CHO ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG vă TRONG NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN DƯỢC PHẨM n Chuyên ngành : Di truyền học : 9420101.21 ạc th Mã số sĩ LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC kh oa NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC họ PGS.TS Đinh Đoàn Long PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung c XÁC NHẬN NCS ĐÃ CHỈNH SỬA THEO QUYẾT NGHỊ CỦA HỘI ĐỒNG ĐÁNH GIÁ LUẬN ÁN Chủ tịch hội đồng đánh giá Thay mặt tập thể cán hướng dẫn Luận án Tiến sĩ PGS.TS Trịnh Hồng Thái PGS.TS Đinh Đoàn Long Hà Nội - 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu tơi hướng dẫn PGS.TS Đinh Đoàn Long PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung Các kết trình bày luận án trung thực, phần công bố tạp chí Khoa học - Cơng nghệ báo cáo hội nghị khoa học, phần lại chưa cơng bố cơng trình khác Mọi trích dẫn ghi rõ nguồn gốc Lu Hà Nội, tháng 08 năm 2020 ận TÁC GIẢ n vă Phạm Thị Hồng Nhung ạc th sĩ oa kh c họ LỜI CẢM ƠN Trong q trình nghiên cứu hồn thành luận án này, nhận nhiều ủng hộ, giúp đỡ quí báu thầy cô giáo, nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực, bạn bè, đồng nghiệp gia đình Trước tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Đinh Đoàn Long PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung tận tình hướng dẫn bảo suốt q trình tơi nghiên cứu thực luận án Nghiên cứu nhận hỗ trợ từ đề tài “Nghiên cứu sản xuất Lu số thụ thể ứng dụng sàng lọc phát triển thuốc từ nguồn dược ận liệu Việt Nam”, mã số ĐT-PTNTĐ2011-G/04 PGS.TS Đinh Đồn Long vă chủ trì Nếu khơng có hỗ trợ tài từ đề tài hỗ trợ chun mơn từ n nhóm nghiên cứu, tơi khó hồn thành nội dung nghiên cứu ạc th luận án Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới nhóm nghiên cứu PGS.TS Võ Thị Thương Lan, PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân, TS sĩ Trịnh Tất Cường, PGS.TS Nguyễn Lai Thành, ThS Bùi Thị Vân Khánh kh phụ trách Các thầy bạn nhóm nghiên cứu tận tình oa giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho thực nghiên cứu họ Tơi chân thành cảm ơn thầy cán Phịng thí nghiệm trọng c điểm Công nghệ Enzym Protein - Đại học Quốc gia Hà Nội ln ủng hộ nhiệt tình giúp đỡ cho tơi có điều kiện tốt tiến hành thí nghiệm Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô cán Bộ môn Di truyền học - Khoa Sinh học giúp đỡ suốt thời gian học tập, nghiên cứu hồn thành luận án; đóng góp nhiều ý kiến q báu cho buổi seminar khoa học, báo cáo chuyên đề báo cáo tiểu luận tổng quan luận án Trong suốt thời gian học tập nghiên cứu, nhận ủng hộ, động viên, tạo điều kiện thuận lợi Ban lãnh đạo Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội giúp đỡ đồng nghiệp Bộ môn Y Dược học sở - Khoa Y Dược Nhân dịp này, xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc cho ủng hộ giúp đỡ Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới tồn thể gia đình tơi, chồng tơi ln động viên, tạo điều kiện thuận lợi cho suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận án Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ quý báu đó! ận Lu Hà Nội, tháng 08 năm 2020 TÁC GIẢ LUẬN ÁN vă Phạm Thị Hồng Nhung n ạc th sĩ oa kh c họ MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU 12 ận Lu ĐẶT VẤN ĐỀ 12 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 14 vă NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 14 n NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 15 th Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ GIÁ TRỊ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN 15 ạc CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 17 sĩ 1.1 THỤ THỂ KẾT CẶP G - PROTEIN 17 kh 1.1.1 Các dạng thụ thể phối tử 17 oa 1.1.2 Cấu trúc GPCR 19 họ 1.1.3 Cơ chế hoạt động GPCR 21 c 1.1.4 Các phương pháp phân tích GPCR 23 1.2 TACHIKININ VÀ CÁC THỤ THỂ NEUROKININ 26 1.2.1 Các phối tử tachykinin 26 1.2.2 Các dạng thụ thể neurokinin 28 1.3 SỰ BIỂU HIỆN CỦA NK1R TRÊN CÁC DÒNG TẾ BÀO 32 1.3.1 Các dạng thụ thể neurokinin-1 người 32 1.3.2 Đáp ứng tế bào kích hoạt phối tử SP thơng qua NK1R 35 1.3.3 Ứng dụng chất đối kháng NK1R 38 1.3.4 Phân tích chức thụ thể dựa vào thay đổi nồng độ Ca2+ nội bào 40 1.4 CÁC HỆ THỐNG BIỂU HIỆN THỤ THỂ TÁI TỔ HỢP 44 1.4.1 Hệ thống dịch mã phi tế bào 44 1.4.2 Hệ thống biểu tế bào nhân sơ 45 1.4.3 Hệ thống biểu nấm men 45 1.4.4 Hệ thống biểu tế bào côn trùng 46 1.4.5 Hệ thống biểu tế bào động vật có vú 47 1.5 SƠ LƯỢC VỀ CÁC CÂY THUỐC VÀ HOẠT CHẤT ĐƯỢC Lu THỬ NGHIỆM TRONG NGHIÊN CỨU 50 ận CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 55 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 55 vă 2.1.1 Các vector nhân dòng biểu 55 n th 2.1.2 Các mồi đoạn oligonucleotide dùng nghiên cứu 55 ạc 2.1.3 Các dịng tế bào mơi trường ni cấy 56 sĩ 2.1.4 Tinh chất dịch chiết methanol thực vật 56 kh 2.2 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 59 oa 2.2.1 Hóa chất nghiên cứu 59 2.2.2 Thiết bị địa điểm nghiên cứu 60 họ 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 60 c 2.3.1 Phát triển hệ thống vector SFV biểu NK1R 62 2.3.2 Phiên mã in vitro từ vector biểu vector hỗ trợ 67 2.3.3 Tạo hạt SFV mang trình tự NK1R người 68 2.3.4 Biểu NK1R tái tổ hợp thông qua lây nhiễm SFV 69 2.3.5 Đánh giá mức độ biểu hoạt tính NK1R 70 2.3.6 Nghiên cứu dược lý in vitro dịch chiết methanol tinh chất số dược liệu Việt Nam NK1R tái tổ hợp 72 2.3.7 Các phương pháp phân tích, xử lý số liệu 74 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 76 3.1 THIẾT KẾ HỆ VECTOR SFV BIỂU HIỆN NK1R TÁI TỔ HỢP CỦA NGƯỜI 76 3.1.1 Thiết kế cặp mồi khuếch đại gen PCR 76 3.1.2 Thiết kế vector biểu pSFV-KLEPT1.2 78 3.1.3 Tạo vector tái tổ hợp pSFV-KLEPT1.2-NK1 80 3.1.4 Tạo vector tái tổ hợp pSFV-EGFP-NK1 83 3.1.5 Nhân dòng, tách chiết bảo quản vector 85 Lu 3.2 TẠO HẠT SFV MANG TRÌNH TỰ NK1R TÁI TỔ HỢP CỦA ận NGƯỜI 87 3.2.1 Phiên mã in vitro từ vector biểu vector hỗ trợ 87 vă 3.2.2 Tạo hạt SFV tái tổ hợp từ tế bào BHK-21 88 n th 3.3 ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN NK1R TRÊN MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO ạc ĐỘNG VẬT 90 sĩ 3.4 ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN NK1R TÁI TỔ HỢP TRÊN TẾ BÀO kh BUỒNG TRỨNG CHUỘT HAMSTER TRUNG QUỐC (CHO) 91 oa 3.4.1 Đánh giá động học biểu protein 91 3.4.2 Kiểm tra biểu NK1R tế bào CHO qua lai Western 92 họ 3.4.3 Phép thử chức thụ thể Fura-2AM 94 c 3.5 NGHIÊN CỨU DƯỢC LÝ IN VITRO DỊCH CHIẾT METHANOL VÀ TINH CHẤT CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU VIỆT NAM TRÊN NK1R TÁI TỔ HỢP 95 3.5.1 Xác định thông số dược lực học chất chủ vận chất đối kháng đặc hiệu NK1R 95 3.5.2 Đánh giá tương tác thụ thể NK1R tái tổ hợp với dịch chiết methanol tinh chất thu từ 10 loài dược liệu Việt Nam 97 CHƯƠNG BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 104 4.1 PHÁT TRIỂN VECTOR SFV BIỂU HIỆN NK1R CỦA NGƯỜI TRÊN TẾ BÀO CHO 104 4.2 NGHIÊN CỨU CÁC DẠNG BIẾN THỂ CỦA THỤ THỂ 113 4.3 NGHIÊN CỨU DƯỢC LÝ IN VITRO CÁC HOẠT CHẤT HƯỚNG ĐÍCH THỤ THỂ NK1R TÁI TỔ HỢP 118 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 125 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN Lu QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 127 PHỤ LỤC ận TÀI LIỆU THAM KHẢO 129 n vă ạc th sĩ oa kh c họ DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT Cấu trúc không gian chiều/3 chiều AA Aarachidonic acid AC Adenylate cyclase AM Gốc este acetoxymethyl AP Aprepitant (chất đối kháng đặc hiệu NK1R) BHK Dòng tế bào thận chuột Hamster Baby (Baby Hamster Kidney) BSA Albumin huyết bò (Bovine serum albumin) cDNA AMP vòng (cyclic adenosine monophosphate) ận cAMP Lu 2D/3D DNA bổ sung với mRNA tạo từ phản ứng phiên mã vă ngược (complementary DNA) n Dòng tế bào buồng trứng chuột Hamster Trung Quốc th CHO ạc (Chinese Hamster Ovary) Dòng tế bào CHO biểu thụ thể NK1R tái tổ hợp COS Dòng tế bào nguyên bào sợi thận khỉ DMEM Môi trường Dulbecco’s Modified Eagle (DMEM Medium) DMSO Dimethylsulfoxide DNA Deoxyribose nucleic acid EC50 Nồng độ hiệu lực 50% (Median effective concentration) EC80 Nồng độ hiệu lực 80% (so với hiệu lực tối đa - 100%) E coli Chủng vi khuẩn Escherichia coli eGFP Protein huỳnh quang lục mạnh (Enhanced Green Fluorescent sĩ CHO-NK1R oa kh c họ Protein) EGFR Thụ thể thúc đẩy tăng trưởng biểu mô (epidermal growth factor receptor) ER Mạng lưới nội chất (endoplasmic reticulum) 184 Violin J D., Crombie A L., Soergel D G., Lark M W (2014), “Biased ligands at G-protein-coupled receptors: promise and progress”, Trends in Pharmacological Sciences 35(7), pp 308-316 185 Vogel H.G., Vogel W.H (2008), Drug Discovery and Evaluation: Pharmacological Assays., Springer Verlag 186 Waugh D S (2011), “An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags”, Protein Expr Purif 80(2), pp 283-293 187 Winter-Vann AM, Martinez L, Bartus C, Levay A, Turner GJ (2001), Lu “G protein-coupled expression in Halobacterium salinarum.”, In: ận Kuehne SR, de Groot H, Eds Perspectives on Solid State NMR in Biology, Dordrecht: Kluwer, pp 141-159 vă 188 Woszczek G., Fuerst E (2015), “Ca2+ mobilization assays in GPCR n th drug discovery”, Methods in Molecular Biology 1272, pp 79-89 ạc 189 Xiong C., Levis R., Shen P., Schlesinger S., Rice C M., Huang H V sĩ (1989), “Sindbis virus: an efficient, broad host range vector for gene kh expression in animal cells”, Science 243(4895), pp 1188-1191 oa 190 Yamaguchi K., Kumakura S., Murakami T., Someya A., Inada E., Nagaoka I (2017), “Ketamine suppresses the substance P-induced of IL-6 and IL-8 họ production by human U373MG c glioblastoma/astrocytoma cells”, International Journal of Molecular Medicine 39(3), pp 687-692 191 Yamanaka R., Xanthopoulos K.G (2004), “Development of improved Sindbis virus-based DNA expression vector”, DNA Cell Biol 23(2), pp 75-80 192 Yin J., Chapman K., Clark L D., Shao Z., Borek D., Xu Q., Wang J., Rosenbaum D M (2018), “Crystal structure of the human NK1 154 tachykinin receptor”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 193 Ying H., Zaks T.Z., Wang R.-F., Irvine K.R., Kammula U.S., Marincola F.M., Lettner W.W, Restifo N.P (1999), “Cancer therapy using self-replicating RNA vaccine”, Nat Medicine 5, pp 823-827 194 Yokota Y., Sasai Y., Tanaka K., Fujiwara T., Tsuchida K., Shigemoto R., Kakizuka A., Ohkubo H., Nakanishi S (1989), “Molecular characterization of a functional cDNA for rat substance P receptor”, Lu The Journal of Biological Chemistry 264(30), pp 17649-17652 ận 195 Yoshino-Furukawa T., Maeda Y., Kikuchi A., Sakuma H., Imazumi K., Yamakuni H., Sogabe H., Matsuo M., Manda T., Uchida W (2013), vă “Pharmacological properties of FK886, a new, centrally active n th neurokinin-1 receptor antagonist”, Biological & Pharmaceutical ạc Bulletin 36(1), pp 76-81 sĩ 196 Zajakina A., Spunde K., Lundstrom K (2017), “Application of kh Alphaviral Vectors for Immunomodulation in Cancer Therapy”, oa Current Pharmaceutical Design 23(32), pp 4906-4932 197 Zappasodi R., Merghoub T (2015), “Alphavirus-based vaccines in họ melanoma: rationale and potential improvements in immunotherapeutic c combinations”, Immunotherapy 7(9), pp 981-997 198 Zhang R., Xie X (2012), “Tools for GPCR drug discovery”, Acta Pharmacologica Sinica 33(3), pp 372-384 199 Zhao D., Kuhnt-Moore S., Zeng H., Pan A., Wu J S., Simeonidis S., Moyer M P., Pothoulakis C (2002), “Substance P-stimulated interleukin-8 expression in human colonic epithelial cells involves Rho family small GTPases”, The Biochemical Journal 368(Pt 2), pp 665672 155 PHỤ LỤC ận Lu Sơ đồ cấu trúc vector sử dụng nghiên cứu n vă Phụ lục I ạc th Phụ lục II Thành phần cách chuẩn bị số dung dịch sử dụng nghiên cứu sĩ Phụ lục III Kết giải trình tự đồn chèn vector tái tổ hợp pSFV-KLEPT1.2-NK1 kh oa Phụ lục IV So sánh trình tự cDNA vector pJET1.2-NK1 vector pSFV-KLEPT1.2-NK1 c họ Phụ lục V Kết điện di SDS-PAGE protein tổng số thu từ tế bào CHO biểu NK1R Phụ lục VI Kết định lượng số hợp chất dịch chiết methanol dược liệu Hồ tiêu, Bình vơi Hòe Phụ lục I Sơ đồ cấu trúc vector sử dụng nghiên cứu ận Lu n vă ạc th sĩ oa kh c họ Hình I.1 Sơ đồ vector pJET1.2-NK1 PT7: T7 RNA polymerase promoter, MCS: vùng nhân dòng đa điếm, NK1R eco47IR: gen NK1R eco47IR, PlacUV5: promoter phục vụ biểu eco47IR, rep (pMB1): đơn vị chép có nguồn gốc từ plasmit pMB1 chịu trách nhiệm chép pJET1.2-NK1, bla (Ampr): gen β-lactamase tạo đề kháng với ampicillin ận Lu n vă ạc th sĩ kh IE: Human cytomegalovirus oa Hình I.2 Sơ đồ vector pEGFP-NK1 PCMV họ (CMV) immediate early promoter, MCS: vùng nhân dòng đa điếm, NK1R: c gen mã hóa NK1R, EGFP: gen mã hóa protein huỳnh quang lục mạnh eGFP, SV40 polyA: tín hiệu polyadenyl hóa sớm mRNA SV40, f1 ori: điểm khởi đầu chép DNA sợi đơn, PSV40e: SV40 early promoter, Kanr/Neor: gen tạo đề kháng với kanamycin/neomycin, HSV TK polyA: tín hiệu polyadenyl hóa mRNA từ gen mã thymidine kinase Herpes simplex virus, pUC ori: điểm khởi đầu chép plasmit pUC ận Lu n vă ạc th sĩ kh oa Hình I.3 Sơ đồ vector pSFV2 SP6: SP6 promoter, nsP1-4: gen mã hóa protein phi cấu trúc cấu thành nên enzym RNA replicase, poly(A): trình tự họ polyadenine, ori: điểm khởi đầu chép plasmit, MCS: vùng nhân dòng c đa điếm, Amp: gen tạo đề kháng với ampicillin ận Lu n vă th ạc Hình I.4 Sơ đồ vector pSFV-Helper2 SP6: SP6 promoter, nsP19-4: vùng sĩ gen mã hóa cho protein phi cấu trúc bị cắt ngắn, C: gen mã hóa cho vỏ oa kh capsit, E1: glycoprotein màng E1 có vai trị cảm ứng dung hợp màng vật chủ màng virut, P62: phức hai glycoprotein màng E2 E3, 6K: protein vỏ c tạo đề kháng với ampicillin họ nặng kDa liên quan đến trình lắp ráp virion nảy chồi virut, Apr: gen Phụ lục II Thành phần cách chuẩn bị số dung dịch sử dụng nghiên cứu 1) Đệm TAE 50x Nồng độ cuối 2M 1M 50 mM Hoá chất Tris-HCl Axit acetic Disodium EDTA Nước cất Pha L 242 g 57,1 mL 18,61 g Đến L 2) Dùng cho tạo hạt SFV chuyển gen NK1R Lu Đệm TN (pH 7.4) ận Nồng độ cuối 50 mM 100 mM 0,5 mM Pha 500 ml 242 g 2,9 g 200 µL Đến 500 mL n vă Thành phần Tris-HCl NaCl EDTA 0,25M; pH 8,0 Nước khử ion ạc th Chỉnh pH 7,4 HCl 1N; Khử trùng 120ºC 15 phút kh Nồng độ cuối 0,5 mM oa Pha 100 ml 99,8 mL 0,2 mL Đến 100 mL c họ Thành phần Đệm TN pH 7,4 EDTA 0,25M; pH 8,0 Nước khử ion sĩ Đệm TNE Dung dịch sucrose 200g/kg Hòa tan 20 g Sucrose đệm TNE Bổ sung đệm TNE đến 100g bảo quản hóa chất -20ºC 3) Gel acrylamit Dung dịch acrylamide 40% Hoá chất acrylamide Methylene bisacrylamide Nước cất Nồng độ cuối 38% 2% Pha 50 mL 19 g 1g Đến 50 mL Lớp gel tách 12% Hoá chất Nước cất Dung dịch acrylamide 40% Tris 1,5M pH 8,8 SDS 10% APS 10% TEMED (thêm trước đổ gel) Pha mL 1716 µL 1,2 mL mL 40 µL 40 µL µL Lớp gel 4% (nằm phủ gel tách) Pha mL 1258 µL 0,2 mL 0,5 mL 20 µL 20 µL µL ận Lu Hoá chất Nước cất Dung dịch acrylamide 40% Tris 1,5M pH 6,8 SDS 10% APS 10% TEMED (thêm trước đổ gel) n vă Đệm Laemmli 2x Nồng độ cuối 4% 20% 125 mM 0,1% sĩ oa kh Pha L 200 mL 200 mL 125 mL 1g Đến L c họ Hoá chất SDS 20% Glycerol Tris-HCl, 1M pH 6,8 Bromophenol Blue Nước cất ạc th 4) Đệm dùng lai Western Trước dùng bổ sung β-mercaptoethanol vào với tỷ lệ 950l Laemmli + 50l βmercaptoethanol Đệm điện di SDS-PAGE Hoá chất Tris base Glycine SDS Nước cất Nồng độ cuối 25 mM 192 mM 0,1% Pha L 3.03 g 14,4 g 1g Đến L Đệm chuyển Nồng độ cuối 25 mM 192 mM 20% Hoá chất Tris base Glycine Methanol Nước cất Pha L 3.03 g 14,4 g 200 ml Đến L Đệm TBS 10x Nồng độ cuối 250 mM 1,5 M Hoá chất Tris base NaCl Nước cất Pha L 24,2 g 80 g Đến L Lu Chỉnh pH đến 7,6 HCl 1N ận Đệm TBST 1x 0,1% Pha L 100 mL mL Đến L ạc th sĩ Nồng độ cuối 1x 5% oa kh Hoá chất Đệm TBST 1x BSA 25 mM Tris/0,15M NaCl (1x) n Đệm khóa BSA Nồng độ cuối vă Hoá chất TBS 10X Tween-20 Nước cất Pha L Đến L 5g Pha 500 mL 250 mL 125 mL 6,25 mL 12,5 mL 106,25 mL c Hoá chất Nước cất EOS Dev A EOS Dev B EOS Dev C Nước cất họ 5) Dung dịch hình (E.O.S DEV., AGFA Health Care) lai Western 6) Dung dịch cố định (E.O.S Fix / E.O.S, AGFA Health Care) lai Western Hoá chất Nước cất EOS Fix A EOS Fix B Nước cất Pha 500 mL 300 mL 100 mL 25 mL 75 mL Phụ lục III Kết giải trình tự đoạn chèn vector tái tổ hợp pSFV-KLEPT1.2-NK1 ận Lu vă n ạc th sĩ oa kh c họ Hình III.1 Kết giải trình tự plasmit pSFV-KLEPT1.2-NK1 chiều 5’→ 3’ ận Lu vă n ạc th sĩ oa kh c họ Hình III.2 Kết giải trình tự plasmit pSFV-KLEPT1.2-NK1 chiều 3’→5’ Phụ lục IV So sánh trình tự vùng gen mã hóa NK1R pJET1.2-NK1 pSFV-KLEPT1.2-NK1 >lcl|query_6029 Length=1338 Query 806 Sbjct 601 265 Query 866 60 Sbjct 661 325 Query 926 120 Sbjct 721 385 Query 986 180 Sbjct 781 CACAAAGGAATGAGGACAGTGACGAACTATTTTCTGGTGAACCTGGCCTTCGCGGAGGCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CACAAAGGAATGAGGACAGTGACGAACTATTTTCTGGTGAACCTGGCCTTCGCGGAGGCC 445 Query 1046 240 Sbjct 841 TCCATGGCTGCATTCAATACAGTGGTGAACTTCACCTATGCTGTCCACAACGAATGGTAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TCCATGGCTGCATTCAATACAGTGGTGAACTTCACCTATGCTGTCCACAACGAATGGTAC 505 Query 1106 300 Sbjct 901 TACGGCCTGTTCTACTGCAAGTTCCACAACTTCTTTCCCATCGCCGCTGTCTTCGCCAGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TACGGCCTGTTCTACTGCAAGTTCCACAACTTCTTTCCCATCGCCGCTGTCTTCGCCAGT 565 Query 1166 360 Sbjct 961 ATCTACTCCATGGCGGCTGTGGCCTTTGATAGGTACATGGCCATCATACATCCCCTCCAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATCTACTCCATGGCGGCTGTGGCCTTTGATAGGTACATGGCCATCATACATCCCCTCCAG 625 Query 1226 420 Sbjct 1021 CCCCGGCTGTCAGCCACAGCCACCAAAGTGGTCATCTGTGTCATCTGGGTCCTGGCTCTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCCCGGCTGTCAGCCACAGCCACCAAAGTGGTCATCTGTGTCATCTGGGTCCTGGCTCTC 685 Query 1286 480 Sbjct 1081 CTGCTGGCCTTCCCCCAGGGCTACTACTCAACCACAGAGACCATGCCCAGCAGAGTCGTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTGCTGGCCTTCCCCCAGGGCTACTACTCAACCACAGAGACCATGCCCAGCAGAGTCGTG 745 Query 1346 540 Sbjct 1141 TGCATGATCGAATGGCCAGAGCATCCGAACAAGATTTATGAGAAAGTGTACCACATCTGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGCATGATCGAATGGCCAGAGCATCCGAACAAGATTTATGAGAAAGTGTACCACATCTGT 805 Query 1406 600 Sbjct 1201 Query 326 Sbjct 121 Query 386 Sbjct 181 Query 446 Sbjct 241 Query 506 Sbjct 301 Query 566 Sbjct 361 Query 626 Sbjct 421 Query 686 Sbjct 481 Query 746 Sbjct 541 ận vă n ACGGTCATTGTGGTGACCTCTGTGGTGGGCAACGTGGTAGTGATGTGGATCATCTTAGCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACGGTCATTGTGGTGACCTCTGTGGTGGGCAACGTGGTAGTGATGTGGATCATCTTAGCC ạc th 925 GTCTCTGCCAAGCGCAAGGTGGTCAAAATGATGATTGTCGTGGTGTGCACCTTCGCCATC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTCTCTGCCAAGCGCAAGGTGGTCAAAATGATGATTGTCGTGGTGTGCACCTTCGCCATC 985 TGCTGGCTGCCCTTCCACATCTTCTTCCTCCTGCCCTACATCAACCCAGATCTCTACCTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGCTGGCTGCCCTTCCACATCTTCTTCCTCCTGCCCTACATCAACCCAGATCTCTACCTG 1045 AAGAAGTTTATCCAGCAGGTCTACCTGGCCATCATGTGGCTGGCCATGAGCTCCACCATG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAGAAGTTTATCCAGCAGGTCTACCTGGCCATCATGTGGCTGGCCATGAGCTCCACCATG 1105 sĩ TACAACCCCATCATCTACTGCTGCCTCAATGACAGGTTCCGTCTGGGCTTCAAGCATGCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TACAACCCCATCATCTACTGCTGCCTCAATGACAGGTTCCGTCTGGGCTTCAAGCATGCC TTCCGGTGCTGCCCCTTCATCAGCGCCGGCGACTATGGGGGGCTGGAAATGAAATCCACC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTCCGGTGCTGCCCCTTCATCAGCGCCGGCGACTATGGGGGGCTGGAAATGAAATCCACC CGGTATCTCCAGACCCAGGGCAGTGTGTACAAAGTCAGCCGCCTGGAGACCACCATCTCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGGTATCTCCAGACCCAGGGCAGTGTGTACAAAGTCAGCCGCCTGGAGACCACCATCTCC c 61 GGAATCACACTATGGGCCAGTGAGATCCCCGGGGACTCCTCTGACCGCTACCACGAGCAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGAATCACACTATGGGCCAGTGAGATCCCCGGGGACTCCTCTGACCGCTACCACGAGCAA họ Sbjct TCGGAACCCAATCAGTTCGTGCAACCAGCCTGGCAAATTGTCCTTTGGGCAGCTGCCTAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TCGGAACCCAATCAGTTCGTGCAACCAGCCTGGCAAATTGTCCTTTGGGCAGCTGCCTAC 865 oa 266 GTGACTGTGCTGATCTACTTCCTCCCCCTGCTGGTGATTGGCTGTGCATACACCGTAGTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGACTGTGCTGATCTACTTCCTCCCCCTGCTGGTGATTGGCTGTGCATACACCGTAGTG kh Query Lu Score = 2266 bits (1227), Expect = 0.0 Identities = 1227/1227 (100%), Gaps = 0/1227 (0%) Strand=Plus/Plus Query 206 GATATGGATAACGTCCTCCCGGTGGACTCAGACCTCTCCCCAAACATCTCCACTAACACC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct GATATGGATAACGTCCTCCCGGTGGACTCAGACCTCTCCCCAAACATCTCCACTAACACC 660 720 780 840 900 1165 960 1225 1020 1285 1080 ACAGTGGTGGGGGCCCACGAGGAGGAGCCAGAGGACGGCCCCAAGGCCACACCCTCGTCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACAGTGGTGGGGGCCCACGAGGAGGAGCCAGAGGACGGCCCCAAGGCCACACCCTCGTCC 1345 CTGGACCTGACCTCCAACTGCTCTTCACGAAGTGACTCCAAGACCATGACAGAGAGCTTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTGGACCTGACCTCCAACTGCTCTTCACGAAGTGACTCCAAGACCATGACAGAGAGCTTC 1405 AGCTTCTCCTCCAATGTGCTCTCCTAG ||||||||||||||||||||||||||| AGCTTCTCCTCCAATGTGCTCTCCTAG 1432 1227 Hình IV So sánh trình tự vùng gen mã hóa NK1R pSFV-KLEPT1.2-NK1 (chuỗi Query) pJET1.2-NK1 (chuỗi Sbjct) 1140 1200 Phụ lục V Kết điện di SDS – PAGE ận Lu n vă ạc th sĩ oa kh Hình V.1 Kết điện di SDS-PAGE protein tổng số thu từ tế bào CHO biểu NK1R CHO -NK1R: mẫu tế bào CHO phân tích 24 sau lây nhiễm hạt SFV-NK1R; M: thang chuẩn Precision Plus Protein™ Unstained (Biorad, Mỹ) c họ Phụ lục VI Kết định lượng số hợp chất dịch chiết methanol dược liệu Hồ tiêu, Bình vơi Hòe (Số liệu PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân, Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQGHN cung cấp) Hợp chất định lượng Loài Capsaicin Hồ tiêu (Piper nigrum L) Lu ận Piperine n vă Rotundin ạc th Bình vơi (Stephania cambodica) sĩ (*) Ginsenoside tổng số(*) (G1+G2+G3) Anthraquinon(*) Hàm lượng chất khô (%) 0,14 0,013 0,19 0,005 0,24 0,008 0,22 0,020 0,22 0,011 1,62 0,071 1,83 0,122 1,51 0,109 2,22 0,084 1,94 0,149 0,98 0,183 2,56 0,182 4,69 0,148 2,32 0,253 3,11 0,051 0,17 0,008 6,14 0,180 5,90 0,411 0,18 0,009 4,56 0,150 0,97 0,06 1,95 c Ba kích (Morinda officialis) họ Tam thất hoang (Panax bipinnatifidus) Rutin oa Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus) kh Hòe (Styphnolobium japonicum) Mẫu dược liệu PN 9701.1 PN 9701.2 PN 9701.3 PN 9701.4 PN 9701.5 PN 9701.1 PN 9701.2 PN 9701.3 PN 9701.4 PN 9701.5 SC 9700.1 SC 9700.2 SC 9700.3 SC 9700.4 SC 9700.5 SJ 9698.1 SJ 9698.2 SJ 9698.3 SJ 9698.4 SJ 9698.5 PB 100.6 PB 100.7 PB 100.8 PS 100.9 PS 100.10 MO1001.9 MO1001.0 MO1001.1 MO1001.2 MO1001.3 Lượng vết 1,60