Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http //www lrc tnu edu vn BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT Nguyễn Thị Hằng TẠO DÒNG TẾ BÀO LAI SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG KHÁNG KHÁN[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - - Nguyễn Thị Hằng TẠO DÒNG TẾ BÀO LAI SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DỊNG KHÁNG KHÁNG NGUN A (NHĨM MÁU A) TRÊN MÀNG TẾ BÀO HỒNG CẦU NGƢỜI Chuyên ngành sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS Nguyễn Thị Trung HÀ NỘI, 12/2015 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết đƣợc công bố luận văn hồn tồn trung thực, xác chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Học viên Nguyễn Thị Hằng Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ii LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Nguyễn Thị Trung chủ nhiệm đề tài KC04.13/11-15 hết lòng giúp đỡ, động viên tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành luận văn tốt nghiệp Tiếp theo, xin gửi lời cảm ơn tới thầy, cô trường Đại học Thái Nguyên, Viện Sinh thái Tài Nguyên sinh vật thầy, Viện Cơng nghệ sinh học nhiệt tình giảng dạy cho suốt thời gian tham gia khóa học Tơi xin chân thành cảm ơn TS Lê Văn Phan, ThS Vũ Thị Thu Hằng, BSTY Thân Đức Dương cán phòng kiểm nghiệm – Công ty cổ phần phát triển công nghệ nông thôn tạo điều kiện để thực luận văn tốt nghiệp Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến GS TS Trương Nam Hải cán phòng Kỹ thuật di truyền, người thân gia đình bạn bè ln hỗ trợ, động viên, khuyến khích tơi suốt q trình học tập Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Học viên Nguyễn Thị Hằng Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ix MỞ ĐẦU NỘI DUNG Chƣơng Tổng quan 1.1 Tổng quan miễn dịch 1.1.1 Hệ miễn dịch 1.1.2 Hệ thống miễn dịch bẩm sinh 1.1.3 Hệ thống miễn dịch thích ứng 1.1.3.1 Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào 1.1.3.2 Đáp ứng miễn dịch dịch thể 1.1.4 Kháng nguyên 1.1.5 Kháng thể 10 1.2 Khái quát hệ thống nhóm máu ngƣời 12 1.2.1 Phân loại hệ thống nhóm máu ngƣời 12 1.2.2 Hệ thống nhóm máu ABO 13 1.2.3 Vai trò máu y học 14 1.2.4 Truyền máu nguyên tắc truyền máu 14 1.2.5 Phƣơng pháp xác định nhóm máu hệ ABO 15 1.3 Kháng thể đơn dòng 16 1.3.1 Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng 16 1.3.2 Sản xuất kháng thể đơn dịng cơng nghệ tế bào lai 19 1.3.3 Vai trò kháng thể đơn dòng 20 1.3.4 Tình hình sản xuất kháng thể đơn dịng đặc hiệu kháng ngun nhóm máu hệ ABO 21 1.4 Động lực học sinh trƣởng sản xuất tế bào động vật 21 Chƣơng Vật liệu phƣơng pháp 25 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iv 2.1 Vật liệu 25 2.1.1 Động vật 25 2.1.2 Hồng cầu mẫu 25 2.1.3 Dòng tế bào myeloma 25 2.1.3 Hóa chất 25 2.1.4 Máy móc thiết bị 26 2.2 Phƣơng pháp 26 2.2.1 Gây miễn dịch 26 2.2.2 Chuẩn bị tế bào 27 2.2.3 Nuôi cấy tế bào myeloma 28 2.2.4 Dung hợp tạo dòng tế bào lai 29 2.2.5 Tách dòng tế bào lai 31 2.2.6 Phản ứng ngƣng kết hồng cầu đĩa 96 giếng 32 2.2.7 Phản ứng ngƣng kết hồng cầu phiến kính 33 2.2.8 Phƣơng pháp đếm tế bào 33 2.2.9 Xây dựng đƣờng cong sinh trƣởng để nghiên cứu sinh trƣởng sản xuất kháng thể dòng tế bào lai 33 2.2.10 Xác định loại globulin miễn dịch 34 2.2.11 Loại bỏ phenol ammonium sulfate 35 2.2.12 Tạo sinh phẩm xác định nhóm máu A 36 2.2.13 Xác định độ đặc hiệu 36 2.2.14 Xác định hiệu giá 36 2.2.15 Xác định cƣờng độ tính 36 Chƣơng Kết 38 3.1 Đánh giá hiệu gây miễn dịch hồng cầu mẫu A+ 38 3.2 Dung hợp tạo tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên A 39 3.3 Sàng lọc hỗn hợp tế bào lai sản xuất kháng thể kháng kháng nguyên A 41 3.4 Tạo dòng tế bào lai đơn sản xuất kháng thể đơn dòng kháng lại kháng nguyên A 43 3.5 Xác định phân lớp kháng thể dòng tế bào A6G11C9 sản xuất 44 3.6 Sự sinh trƣởng sản xuất kháng thể dòng tế bào lai A6G11C9 tiết kháng thể kháng kháng nguyên A 45 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn v 3.7 Hiệu giá kháng thể dịch nuôi cấy tế bào lai A6G11C9 49 3.8 Độ nhạy độ đặc hiệu kháng thể dòng tế bào lai A6G11C9 sản xuất 50 3.9 Loại bỏ phenol đỏ khỏi dịch nuôi cấy tế bào lai A6G11C9 phƣơng pháp tủa ammonium sulfate 52 3.10 Tạo sinh phẩm xác định nhóm máu A 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Thành phần đáp ứng miễn dịch bẩm sinh đáp ứng miễn dịch đặc hiệu Hình 1.2 Quá trình thực bào Hình 1.3 Cách tế bào NK protein bổ thể tạo lỗ màng để tiêu diệt tế bào lây nhiễm tác nhân gây bệnh Hình 1.4 Tế bào T bám vào kháng nguyên lạ liên kết với protein MHC Hình 1.5 Kháng nguyên đƣợc diện protein MHC Hình 1.6 Hàng rào miễn dịch tế bào T Hình 1.7 Hàng rào miễn dịch tế bào B Hình 1.8 Cấu trúc phân tử kháng thể 11 Hình 1.9 Kháng nguyên nhóm máu ngƣời 13 Hình 1.10 Sơ đồ truyền máu 15 Hình 1.11 Các phƣơng pháp sản xuất kháng thể đơn dòng 19 Hình 1.12 Cơng nghệ tế bào lai 20 Hình 1.13 Phản ứng ngƣng kết kháng nguyên - kháng thể 21 Hình 1.14 Đƣờng cong sinh trƣởng tế bào 24 Hình 2.1 Tế bào đại thực bào ni cấy tĩnh…………………………………… 28 Hình 2.2 Sơ đồ pha loãng tới hạn 31 Hình 2.3 Phản ứng ngƣng kết hồng cầu đĩa đáy chữ V 32 Hình 2.4 Cách đọc kết của phản ứng ngƣng kết hồng cầu đĩa 96 đáy chữ V 32 Hình 2.5 Buồng đếm tế bào 33 Hình 2.6 Cơ chế cách đọc kết phản ứng ELISA xác định phân lớp kháng thể 35 Hình 3.1 Phản ứng ngƣng kết huyết chuột đƣợc gây miễn dịch với hồng cầu mẫu A+, B+, O+ 38 Hình 3.2 Lách hạch vùng kheo thu đƣợc từ chuột đƣợc gây miễn dịch với hồng cầu mẫu A+ 39 Hình 3.3 Tế bào sau dung hợp 40 Hình 3.4 Tế bào lai hình thành sau ngày dung hợp 40 Hình 3.5 Tế bào lai sau ngày dung hợp giếng khác 41 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vii Hình 3.6 Sự phát triển tế bào lai 42 Hình 3.7 Sàng lọc giếng chứa hỗn hợp tế bào lai sản xuất kháng thể kháng kháng nguyên A 43 Hình 3.8 Sàng lọc dịng tế bào lai đơn sản xuất kháng thể kháng kháng nguyên A 44 Hình 3.9 Chọn dòng tế bào lai sản xuất kháng thể kháng kháng nguyên A tốt 44 Hình 3.10 Phản ứng ELISA xác định isotye kháng thể 45 Hình 3.11 Đƣờng cong sinh trƣởng dịng tế bào lai A6G11C9 mơi trƣờng DMEM + 10% FBS 47 Hình 3.12 Đƣờng cong sinh trƣởng dòng tế bào lai A6G11C9 ni cấy mơi trƣờng có nồng độ huyết thấp DMEM + 1%FBS 48 Hình 3.13 Đồ thị biểu thị hình thành kháng thể dịng tế bào A6G11C9 ni cấy môi trƣờng DMEM + 10% FBS 49 Hình 3.14 Đồ thị biểu thị hình thành kháng thể dịng tế bào A6G11C9 ni cấy mơi trƣờng DMEM + 1% FBS 49 Hình 3.15 Xác định hiệu giá kháng thể phƣơng pháp ngƣng kết hồng cầu 50 Hình 3.16 Phản ứng ngƣng kết hồng cầu đĩa 96 giếng đáy chữ V xác định độ đặc hiệu kháng thể 51 Hình 3.17 Phản ứng ngƣng kết hồng cầu phiến kính xác định tính kháng thể cƣờng độ phản ứng ngƣng kết 52 Hình 3.18 Dịch ni cấy trƣớc sau tủa ammonium sulphate 53 Hình 3.19 Độ đặc hiệu kháng thể trƣớc sau tủa 54 Hình 3.20 Hiệu giá kháng thể trƣớc sau tủa ammonium sulfate 54 Hình 3.21 Sinh phẩm A phản ứng ngƣng kết hồng cầu sinh phẩm với panel hồng cầu hệ ABO 56 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1 Hƣỡng dẫn đọc kết phƣơng pháp huyết mẫu 16 Bảng Hƣỡng dẫn đọc kết phƣơng pháp hồng cầu mẫu 16 Bảng Môi trƣờng sử dụng……………………………………………………… .25 Bảng 2 Một số dung dịch 26 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ix DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết đầy đủ Từ viết tắt MHC Major histocompatibility complex APC Antigen presenting cell ISBT International society of blood transfusion EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EBV Epstein – Barr virus scFv Single chain fragment variable VH Variable domains of the heavy VL Variable domains of the light RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay hmAb Human monoclonal antibody HGPRT Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase PEG Polyethylene glycol HAT Hypoxanthyl aminoteptrin thymidine DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium FBS Fetal bovine serum FCA Freund’s complete adjuvant FIA Freund’s incomplete adjuvant HT Hypoxanthine thymine DMSO Dimethylsulfoxide Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 47 Hình 3.11 Đƣờng cong sinh trƣởng dịng tế bào lai A6G11C9 mơi trƣờng DMEM + 10% FBS Dòng tế bào lai A6G11C9 đƣợc nuôi cấy môi trƣờng DMEM + 1% FBS để nghiên cứu khả thích ứng dịng tế bào với mơi trƣờng có nồng độ huyết thấp Kết cho thấy, tế bào tăng sinh mơi trƣờng có nồng độ huyết thấp nhiên thời gian pha tiềm phát kéo dài ni cấy mơi trƣờng có 10% huyết không quan sát đƣợc pha cân đƣờng cong sinh trƣởng dịng tế bào ni cấy mơi trƣờng có 1% huyết Mật độ tế bào tối đa đạt đƣợc 2.105 tế bào/ml sau khoảng 70 nuôi cấy với tốc độ sinh trƣởng 0,006 h-1 hầu hết tế bào chết sau khoảng 150 ni cấy (hình 3.12) Sự sinh trƣởng tế bào sử dụng mơi trƣờng có nồng độ huyết khác khác Bởi vì, huyết nguồn cung cấp yếu tố sinh trƣởng có tác động khác đến biệt hóa dòng tế bào khác Tế bào sinh trƣởng mơi trƣờng có nồng độ huyết thấp phát triển chậm sinh trƣởng mơi trƣờng có nồng độ huyết cao Điều chứng tỏ huyết đóng vai trị quan trọng tăng sinh dòng tế bào lai A6G11C9 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 48 Hình 3.12 Đƣờng cong sinh trƣởng dịng tế bào lai A6G11C9 ni cấy mơi trƣờng có nồng độ huyết thấp DMEM + 1%FBS Dịch nuôi cấy tế bào lai A6G11C9 đƣợc thu hàng ngày sau xác định hiệu giá kháng thể để đánh giá khả sản xuất kháng thể dòng tế bào Sự hình thành kháng thể dịng tế bào lai A6G11C9 tăng suốt pha lũy thừa trình ni cấy, hiệu giá kháng thể đạt cực đại sau khoảng 100 nuôi cấy không thay đổi tế bào chết hoàn toàn Dữ liệu quan sát đƣợc ni cấy dịng tế bào A6G11C9 môi trƣờng DMEM + 10% FBS mơi trƣờng có nồng độ huyết thấp DMEM + 1% FBS Khi nuôi cấy môi trƣờng DMEM + 10% FBS hiệu giá đạt cực đại 29 cịn mơi trƣờng DMEM + 1% FBS 27 (hình 3.13, hình 3.14) Trong khoảng thời gian sau 50-100 ni hàm lƣợng kháng thể tăng mạnh, đạt cực đại sau khoảng 100 trì không thay đổi Điều cho thấy sau tế bào đạt đến mật độ tối đa tế bào bắt đầu chết, sau khoảng 100 ni cấy số lƣợng tế bào giảm mạnh chứng tỏ kháng thể đƣợc giải phóng hồn tồn tế bào bị phân giải Mặt khác, hàm lƣợng kháng thể hình thành ni tế bào hai mơi trƣờng có nồng độ huyết khác khác Điều đƣợc lý giải nhƣ sau: mật độ tế bào tối đa mơi trƣờng có nồng độ huyết cao so với mơi trƣờng có nồng độ huyết thấp hàm lƣợng kháng thể hình thành cao Nhƣ vậy, hàm lƣợng kháng thể đƣợc sản xuất tế bào A6G11C9 có liên quan đến số lƣợng tế bào sống Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 49 Hình 3.13 Đồ thị biểu thị hình thành kháng thể dịng tế bào A6G11C9 ni cấy mơi trƣờng DMEM + 10% FBS Hình 3.14 Đồ thị biểu thị hình thành kháng thể dịng tế bào A6G11C9 nuôi cấy môi trƣờng DMEM + 1% FBS Nhƣ vậy, tiến hành nghiên cứu ni cấy dịng tế bào lai A6G11C9 nhận thấy tế bào sinh trƣởng sản xuất kháng thể tốt nuôi cấy tế bào mơi trƣờng có 10% huyết với mật độ tế bào ban đầu 105 tế bào/ml Mật độ tế bào đạt cực đại 11x106 tế bào/ml sau khoảng 50 nuôi cấy hiệu giá kháng thể đạt cực đại 29 sau khoảng 100 nuôi cấy đối Do đó, ni cấy tế bào tiến hành cấy chuyển tế bào sau khoảng 40-50 nuôi cấy với tỷ lệ cấy truyền 1/10 để mật độ nuôi cấy ban đầu đạt 105 tế bào/ml nuôi tế bào để thu đƣợc lƣợng kháng thể nhiều tiến hành thu dịch ni cấy sau khoảng 100 nuôi cấy 3.7 Hiệu giá kháng thể dịch nuôi cấy tế bào lai A6G11C9 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 50 Dịng tế bào lai A6G11C9 ni cấy in – vitro tiết kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên A môi trƣờng nuôi cấy Tùy thuộc vào loại dòng tế bào lai mà hàm lƣợng kháng thể tiết mơi trƣờng ni cấy nhiều Hiệu giá kháng thể đƣợc sử dụng để đánh giá tƣơng đối hàm lƣợng kháng thể Hiệu giá cao hàm lƣợng kháng thể nhiều Hiệu giá kháng thể độ pha loãng kháng thể lớn mà phản ứng ngƣng kết hồng cầu xảy Dòng tế bào lai A6G11C9 đƣợc nuôi cấy môi trƣờng DMEM + 10%FBS, sau ngày thu dịch nuôi cấy để xác định hiệu giá Độ pha loãng lớn kháng thể dòng tế bào lai A6G11C9 sản xuất mà ngƣng kết xảy 1/512 Hiệu giá kháng thể kháng kháng nguyên A dòng tế bào lai A6G11C9 sản xuất 512 (29) cao so với kháng thể kháng A dòng A907 báo cáo Fouad Sadiq năm 2005 256 (28) thấp so với huyết mẫu hãng Biorad 1024 (210) [28] Nhƣ vậy, hiệu giá kháng thể dịch ni cấy dịng tế bào A6G11C9 sản xuất tƣơng đối cao tức hàm lƣợng kháng thể dịch ni cấy tƣơng đối nhiều khả sản xuất kháng thể dòng tế bào lai A6G11C9 tốt Hình 3.15 Xác định hiệu giá kháng thể phƣơng pháp ngƣng kết hồng cầu 3.8 Độ nhạy độ đặc hiệu kháng thể dòng tế bào lai A6G11C9 sản xuất Độ đặc hiệu đề cập đến khả vị trí liên kết kháng nguyên kháng thể phản ứng với loại kháng nguyên Nếu dòng tế bào lai A6G11C9 sản xuất kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên A màng hồng cầu làm phản ứng ngƣng kết với panel hồng cầu nhóm máu hệ ABO (nhóm máu A+, nhóm máu B+, nhóm máu O+) ngƣng kết quan sát đƣợc phản ứng dịch nuôi cấy với hồng cầu A+ mà không quan sát đƣợc phản ứng dịch nuôi cấy tế bào với hồng cầu B+ phản ứng dịch nuôi cấy với hồng cầu O+ Khi tiến hành xác định độ đặc hiệu kháng thể dòng tế bào A6G11C9 sản xuất kháng thể ngƣng kết với Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 51 hồng cầu mẫu A+ mà không ngƣng kết với hồng cầu mẫu B+ O+ nhƣ kháng thể kháng nguyên A dòng tế bào lai A6G11C9 đặc hiệu cho kháng nguyên A Hình 3.16 Phản ứng ngƣng kết hồng cầu đĩa 96 giếng đáy chữ V xác định độ đặc hiệu kháng thể Độ nhạy kháng thể đƣợc đánh giá thông qua tính kháng thể cƣờng độ phản ứng kháng nguyên – kháng thể Ái tính tổng độ mạnh nhiều định kháng nguyên với kháng thể đa hóa trị đƣợc đánh giá thời gian cần thiết để quan sát mắt thƣờng dấu hiệu phản ứng ngƣng kết hồng cầu Ái tính kháng thể có dịch nuôi cấy tế bào lai A6G11C9 đƣợc xác định phản ứng ngƣng kết dịch nuôi cấy tế bào lai A6G11C9 hồng cầu mẫu A+ 10% khoảng giây để nhận biết đƣợc dấu hiệu phản ứng ngƣng kết huyết mẫu A Biorad khoảng giây Cƣờng độ đánh giá độ mạnh phản ứng ngƣng kết kháng nguyên – kháng thể đƣợc xác định phản ứng ngƣng kết dịch nuôi cấy tế bào lai A6G11C9 hồng cầu mẫu A 10% thủy tinh, kết đƣợc đánh giá sau phút tạo cụm ngƣng kết: 4+) hạt dịch trong, (3+) vài hạt dịch trong, (2+) vài hạt nhỏ dịch đục, (+1) nhiều hạt nhỏ dịch đục, (-) không ngƣng kết Cƣờng độ phản ứng ngƣng kết dịch nuôi cấy tế bào lai A6G11C9 hồng cầu mẫu A 10% 3+ có vài cụm ngƣng kết dịch cƣờng độ phản ứng ngƣng kết huyết Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 52 mẫu A Biorad hồng cầu mẫu A 10% 4+ Thông qua đánh giá tính kháng thể cƣờng độ phản ứng ngƣng kết hồng cầu nhận thấy kháng thể có dịch ni cấy dịng tế bào lai A6G11C9 có độ nhạy cao Hình 3.17 Phản ứng ngƣng kết hồng cầu phiến kính xác định tính kháng thể cƣờng độ phản ứng ngƣng kết 3.9 Loại bỏ phenol đỏ khỏi dịch nuôi cấy tế bào lai A6G11C9 phƣơng pháp tủa ammonium sulfate Dịch ni cấy tế bào lai A6G11C9 có chứa kháng thể kháng kháng nguyên A với protein kháng thể có nguồn gốc từ huyết bị (Fetal Bovine Serum – FBS) Tuy nhiên, kiểm tra độ đặc hiệu kháng thể có dịch ni cấy tế bào lai A6G11C9 với hồng cầu mẫu A+, B+, O+ kháng thể dịch ni cấy nhận diện đặc hiệu kháng nguyên A màng hồng cầu Do dịch nuôi cấy chứa kháng thể kháng kháng nguyên A có lẫn tạp với protein huyết bị khơng ảnh hƣởng đến độ đặc hiệu kháng thể kháng nguyên A Nhƣ vậy, sử dụng trực tiếp dịch nuôi cấy tế bào lai A6G11C9 để làm thuốc thử xác định nhóm máu A Tuy nhiên sinh phẩm xác định nhóm máu đƣợc thƣơng mại, kháng thể kháng A, kháng B kháng AB đƣợc pha với chất màu khác để phân biệt tránh nhầm lẫn xảy xác định nhóm máu Đối với kháng thể kháng A, sản phẩm thƣơng mại có màu xanh Để tạo màu cho sản phẩm cần tiến hành pha dịch nuôi cấy tế bào với chất màu Tuy nhiên, mơi trƣờng ni cấy tế bào có sử dụng chất thị môi trƣờng phenol đỏ để tạo màu xanh cho sản phẩm trƣớc hết cần phải tiến hành loại bỏ phenol đỏ khỏi dịch nuôi cấy tế bào Để loại bỏ phenol đỏ phƣơng pháp đơn giản tủa ammonium sulfate Nhƣ vậy, Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 53 tinh kháng thể phƣơng pháp tủa với ammonium sulfate bão hòa 50% với mục đích loại bỏ phenol đỏ khỏi dịch nuôi cấy Để thấy rõ khả loại bỏ phenol phƣơng pháp tủa ammonium sulfate, tiến hành nuôi cấy thu lƣợng nhỏ dịch nuôi cấy sau tế bào phát triển đến pha log Thu dịch ni cấy lúc nhìn rõ màu phenol đỏ cịn thu sau tế bào chết hồn tồn lúc mơi trƣờng chuyển vàng Sau dịch nuôi cấy đƣợc tủa với ammonium sulfate, tiến hành ly tâm để thu cặn có chứa kháng thể loại bỏ dịch có chứa phenol đỏ Tủa sau đƣợc rửa để loại bỏ hồn tồn phenol đỏ tái huyền phù vào đệm PBS 1X Không quan sát thấy diện phenol đỏ sau tái huyền phù tủa vào đệm Nhƣ vậy, loại bỏ thành công phenol đỏ khỏi kháng thể Hình 3.18 Dịch ni cấy trƣớc sau tủa ammonium sulphate Sau tinh sạch, kháng thể đƣợc làm phản ứng ngƣng kết phiến kính với hồng cầu mẫu A+ B+ để đánh giá lại độ đặc hiệu kháng thể có thay đổi sau tủa muối hay không Nhận thấy rằng, kháng thể trƣớc sau tủa muối (cô đặc lần hịa với thể tích ban đầu) nhận diện đặc hiệu kháng nguyên A Nhƣ vậy, độ đặc hiệu kháng thể sau tủa muối không thay đổi nhƣng cƣờng độ ngƣng kết thay đổi Kháng thể đƣợc đặc lần cƣờng độ ngƣng kết mạnh so với dịch nuôi cấy ban đầu kháng thể sau tủa đƣợc hòa thể tích với thể tích ban đầu cƣờng độ ngƣng kết giảm Điều hàm lƣợng kháng thể bị thay đổi, trình tủa khơng phải tồn kháng thể mong muốn tủa mà thể bị phần hàm lƣợng kháng thể giảm dẫn đến Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 54 cƣờng độ ngƣng kết giảm, cịn đặc hàm lƣợng kháng thể tăng lên từ cƣờng độ ngƣng kết tăng theo Hình 3.19 Độ đặc hiệu kháng thể trƣớc sau tủa Để xem xét có phải hàm lƣợng kháng thể bị giảm sau tủa hay khơng chúng tơi tiến hành xác định hiệu giá kháng thể trƣớc sau tủa (cơ đặc hịa thể tích thể tích ban đầu) Kết hiệu giá cho thấy, kháng thể sau tủa có hàm lƣợng tƣơng đƣơng với với hàm lƣợng có dịch ni cấy ban đầu (hiệu giá 27), cịn đặc (thể tích giảm 1/5 so với ban đầu) hàm lƣợng kháng thể tăng lên lần đạt 29 Hình 3.20 Hiệu giá kháng thể trƣớc sau tủa ammonium sulfate Mặc dù hàm lƣợng kháng thể trƣớc sau tủa không thay đổi nhƣng cƣờng độ ngƣng kết kháng thể lại giảm Điều thành phần dịch ni cấy tế bào có ảnh hƣởng đến cƣờng độ phản ứng ngƣng kết hồng cầu bị loại bỏ Trong mơi trƣờng ni cấy tế bào có bổ sung thêm huyết bị Số hố Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 55 mà thành phần huyết BSA, BSA lại có tác động làm tăng tƣơng tác kháng nguyên kháng thể mà sau tủa hàm lƣợng BSA giảm ảnh hƣởng đến cƣờng độ ngƣng kết phản ứng kháng nguyên – kháng thể [9] 3.10 Tạo sinh phẩm xác định nhóm máu A Các thuốc thử thử anti-A đƣợc thƣơng mại có màu xanh chúng tơi cần xác định đƣợc chất màu bổ sung vào sinh phẩm Theo patent WO 2012083361, màu xanh thuốc thử anti-A thƣơng mại patent blue V Patent blue V chất màu axit với nhóm sulphonic, phân ly nƣớc tích điện âm hòa tan nhanh vào nƣớc [3] Để tạo đƣợc màu tƣơng ứng nhƣ sản phẩm thƣơng mại tiến hành xác định hàm lƣợng chất màu bổ sung vào sinh phẩm Hàm lƣợng patent blue V bổ sung vào sinh phẩm 0,000035 g/ml Thuốc thử nhóm máu đƣợc sử dụng điều kiện bình thƣờng khơng vơ trùng mà kháng thể có chất protein dễ bị phân cắt protease Trong khơng khí có nhiều vi khuẩn, để tránh nhiễm khuẩn vào mẫu kháng thể dẫn đến sản xuất protease làm kháng thể bị phân cắt hoạt tính chúng tơi tiến hành bổ sung chất bảo quản sodium azide với hàm lƣợng 0,01% để ngăn cản tạp nhiễm vi sinh vật vào sinh phẩm Phản ứng ngƣng kết hồng cầu xảy hiệu mơi trƣờng muối có nồng độ ion thấp, thông thƣờng sử dụng saline sử dụng đệm phosphate (PBS) để làm đệm pha kháng thể sau tinh Kháng thể đƣợc sử dụng để xác định nhóm máu chúng tơi bổ sung thêm thành phần chống đông cho máu EDTA với nồng độ cuối 10 mM EDTA Nhƣ xác định đƣợc thành phần bổ sung vào sinh phẩm chúng tôi: chất màu (Paten blue V sodium salt), chất chống vi sinh vật (sodium azide), môi trƣờng vật lý cho phản ứng ngƣng kết hồng cầu (đệm PBS 1X) chất chống đông (EDTA) Dịch nuôi cấy tế bào lai A6G11C9 đƣợc tinh phƣơng pháp tủa với ammonium sulfate để loại bỏ phenol đỏ Sau tủa, tủa kháng thể đƣợc rửa lần với ammonium sulfate bão hòa 50% Tủa sau rửa đƣợc huyền phù lại với đệm pha sinh phẩm với thể tích 1/5 thể tích ban đầu Thành phần đệm pha sinh phẩm A (0,0035% Patent blue V sodium salt + 0,01% sodium azide + 10mM EDTA PBS 1X, pH=7,8) Sau tạo sinh phẩm làm phản ứng ngƣng kết hồng cầu Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 56 phiến kính để đánh giá độ đặc hiệu, cƣờng độ ngƣng kết tính sinh phẩm Kết cho thấy sinh phẩm xác định nhóm máu A mà chúng tơi tạo đảm bảo yêu cầu thuốc thử xác định nhóm máu A thƣơng mại: sinh phẩm có màu xanh, sinh phẩm đặc hiệu kháng nguyên A với cƣờng độ (4+) ≥3+, tính (2 giây) ≤10 giây, hiệu giá (512) ≥128 [18] Hình 3.21 Sinh phẩm A phản ứng ngƣng kết hồng cầu sinh phẩm với panel hồng cầu hệ ABO Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Chúng thành công việc xây dựng phƣơng pháp để tạo tế bào lai sản xuất kháng thể kháng kháng nguyên A: thu nhận đƣợc hỗn hợp tế bào lai 12 dòng tế bào lai đơn sản xuất kháng thể kháng kháng nguyên A, chọn đƣợc dòng A6G11C9 dòng sản xuất kháng thể tốt - Đánh giá đƣợc vài tính chất kháng thể dòng tế bào lai A6G11C9 sản xuất: kháng thể có phân lớp chuỗi nặng IgM, chuỗi nhẹ kappa, kháng thể đặc hiệu kháng nguyên A với cƣờng độ ngƣng kết 3+ tính 2s, hiệu giá kháng thể đạt 29 - Đã tạo đƣợc sinh phẩm A xác định nhóm máu Kiến nghị - Tiếp tục hồn thiện quy trình sản xuất kháng thể quy mơ phịng thí nghiệm Số hố Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 58 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng anh Abhyankar A.V (2012), “Indigenously developed monoclonal antibody specific for human blood group B” Journal of Hematological Malignancies, (2), pp.24-18 ATTC (2011), Animal Cell Culture Basic: Tips and techniques for continuous cell line Ballerini D.R., Li X., Shen W (2012), Method and system for detection of blood types, Patent number WO 2012083361 A1 Costabile M (2010), “Determining the reactivity and titer of serum using a haemagglutination assay”, Journal of Visualized Experiments, (35), pp.1752 Dean L (2005), “Chapter Blood and the cells it contains”, Blood groups and red cell antigens, National Center for Biotechnology Information, Bethesda (MD) Dean L (2005), “Chapter Blood group antigen are surface marker on the red blood cell membrane”, Blood groups and red cell antigens, National Center for Biotechnology Information, Bethesda (MD) Dean L (2005), “Chapter Blood transfusionand the immune system”, Blood groups and red cell antigens, National Center for Biotechnology Information, Bethesda (MD) Edward A.G (2014), Antibodies: A laboratory manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York Fitzsimmons J.M and Morel P.A (2003), “The effects of red blood cell suspending media on hemagglutination and the antiglobulin test”, Transfution, (19), pp.85-81 10 Fulle A., Takahashi M and Hurrell J.G.R (1992), “Immunization of Mice”, Current Protocols in Molecular Biology 11 Grodzki A.C and Berenstein E., (2010), “Antibody Purification: Ammonium sulfate fractionation or gel filtration”, Springer 12 Hayter P.M (1989), An Investigation into factors that affect monoclonal antibody production by hybridomas in culture, Department of microbiology university of Surrey Guildford Surrey Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 59 13 Institutional Animal Care and Use Committee (2012), Footpad Injections Guidelines in Mice and Rats, the University of North Carolina at Chapel Hill 14 Iyer Y.S., Vasantha K., Manisha P., Jadhav S., Gupte S.C and Mohanty D (2006), “Production of murine monoclonal anti-B”, Indian Journal Medicin Research, (123), pp 561-564 15 John B Z (2009), Essential Clinical Immunology, Cambridge University Press, United Kingdom 16 Kamala T (2007), “Hock immunization: A humane alternative to mouse footpad injections”, Journal Immunol Methods 17 Kanrko M., Kato Y., Horiuchi H and Osawa M (2003), “Molecular characterization of a human monoclonal antibody to B antigen in ABO blood type”, Immunology Letters, (86), pp.51-45 18 Kathy D B and Paula R.H (2013), Basic & Applied Concepts of Blood Banking and transfusion practices 19 Khan F., Khan RH., Sherwani A., Mohmood S., Azfer MA., (2002) “Lectins as markers for blood grouping”, Medical Science Monitor, (8), pp 300-293 20 Kumagai I and Tsumoto K., (2001), “Antigen–Antibody Binding”, Encyclopedia of life science 21 Lee GM, Huard TK and Palsson BO (1989), “Effect of serum concentration on hybridoma cell growth and monoclonal antibody production at various initial cell densities”, Hybridoma, (8), pp.75-369 22 Levy M., Edelman L and Dighiero G (2001), “Molecular characterization of a monoclonal murine anti-blood group A antibody”, Immunology Letters, (76), pp.2315 23 National Research Council (1999), Monoclonal Antibody Production, National Academy Press, Washington 24 Ozzturk S S and Palsson O B (1990), “Effect of initial cell density on hybridoma growth, metabolism, and monoclonal antibody production”, Journal Biotechnology, (16), pp 278-259 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 60 25 Pandey S (2013), “Hybridoma technology for production of monoclonal antibodies”, International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research, (1), pp 94 – 88 26 Parham P (2009) The Immune System, third edition, Garland Science, London and NewYork 27 Peter J.D and Ivan M.R (2000), “The Immune System”, The New England Journal of Medicine, (343), pp.49-37 28 Sadiq F., Tissent A , Habti N., Radallah D., Amrani N E., Benchemsi N (2005), “Production of a new anti-A monoclonal reagent”, African Journal of Bioteachnology, (4), pp 846-844 29 Shimizu S (2004), “Routes of Administration”, The Laboratory Mouse, National Institute of Animal Health, Tsukuba, Japan 30 Wang S (2011), “Advances in the production of human monoclonal antibodies”, Antibody Technology Journal, 1, pp 4-1 Tài liệu tiếng việt 31 Đỗ Thị Thảo, Đỗ Thị Phƣơng, Đỗ Khắc Hiếu, Hà Thị Thu, Đinh Thƣơng Vân, Đinh Duy Kháng, Lê Trần Bình (2008), “Tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng protein vỏ VP28 virus gây bệnh đốm trắng tơm sú”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, (2), Tr 203–208 32 Nguyễn Hải Đăng (2008), Nghiên cứu tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng progesterone, Luận văn thạc sỹ, Trƣờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội, Hà Nội 33 Pham Văn Ty Nguyễn Lân Dũng (2004), “Miễn dịch học”, Nhà xuất đại học quốc gia, Hà Nội Tài liệu Web 34 Bioatla (2015), Antibody Isotypes, http://bioatla.com/educational- appendix/antibody-isotypes, ngày 7/12/2015 35 Bộ y tế (2013), Thông tƣ hƣớng dẫn hoạt động truyền máu, http://thuvienphapluat.vn/van-ban/The-thao-Y-te/Thong-tu-26-2013-TT-BYT-nam2013-huong-dan-hoat-dong-truyen-mau-214176.aspx, ngày 12/7/2015 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 61 36 Immunology Module (2015), The innate and adaptive immune systems, http://missinglink.ucsf.edu, ngày 12/7/2015 37 International Society of Blood Transfusion (2014), Table of blood group systems v4.0, http://www.isbtweb.org, ngày 12/7/2015 38 Jerry R B (2015), Blood transfusion, http://www.medicinenet.com, ngày 7/12/2015 39 Wikipedia (2015), Blood transfusion, https://en.wikipedia.org, ngày 7/12/2015 40 http://medical-dictionary.thefreedictionary.com/phagocytosis, ngày 7/12/2015 41 http://www.novimmune.com/science/antibodies.html, ngày 7/12/2015 42 http://www.buzzle.com/articles/blood-types-chart.html, ngày 7/12/2015 43 http://www.nature.com/nbt/journal/v25/n12/fig_tab/nbt1363_F1.html, ngày 7/12/2015 44 http://www.whatisthebiotechnology.com/blog/hybridoma-technology/, ngày 7/12/2015 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn