Nghiên ứu công nghệ sản xuất đường chức năng steviol glycoside và rebaudioside a từ cỏ ngọt

11 Bảng 1.4 Tính chất hoạt động và các điều kiện tối ưu của các chế phẩm enzyme thương mại được sử dụng để trích ly đường từ cỏ ngọt23 Bảng 3.1 Hàm lượng STG, Stevioside và Rebaudioside

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1 HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 2

PGS TS Nguyễn Thị Minh Tú TS Trương Hương Lan

Hà Nội – 2018

MỤC LỤC

Trang

1.1.1 Nguồn gốc và đặc điểm thực vật của cây cỏ ngọt Stevia rebaudiana

Bertoni

3

1.2.1 Cấu tạo và tính chất của các loại đường từ cỏ ngọt 9

1.2.2.3 Tác dụng đối với bệnh cao huyết áp, tim mạch 15

1.3.2 Trích ly đường từ cỏ ngọt có sự hỗ trợ của sóng siêu âm 19 1.3.3 Trích ly đường từ cỏ ngọt có sự hỗ trợ của vi sóng 20

1.3.5 Trích ly đường từ cỏ ngọt bằng phương pháp enzyme 21

1.4.1 Kết tinh trực tiếp Rebaudioside A từ dịch STG của cỏ ngọt 24 1.4.2 Kết tinh Rebaudioside A từ STG của cỏ ngọt đã tách Stevioside 25

3.1 NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÁC CHẤT CHÍNH TRONG LÁ CỎ

NGỌT TRỒNG Ở VIỆT NAM

35

3.1.1 Xác định hàm lượng STG, Stevioside và Rebaudioside A trong lá

của một số giống cỏ ngọt khác nhau

35

3.1.2 Nghiên cứu cảm quan và xác định các thành dinh dưỡng trong lá

cỏ ngọt S rebaudiana KST01

36

3.2.2 Nghiên cứu sử dụng enzyme trong quá trình trích ly STG từ cỏ

3.2.3.1 Xử lý kết tủa tạp chất trong dịch trích ly bằng Ca(OH)2 và

3.2.4 Nghiên cứu các thông số công nghệ để thu nhận bột chế phẩm

STG từ dịch trích ly cỏ ngọt bằng phương pháp sấy phun

54

3.2.4.1 Xác định nồng độ chất khô trong dịch trích ly cỏ ngọt thích

hợp cho sấy phun

54 3.2.4.2 Xác định nhiệt độ không khí đầu vào của quá trình sấy phun 55

dịch trích ly cỏ ngọt

3.2.5 Xây dựng qui trình công nghệ sản xuất chế phẩm STG quy mô

phòng thí nghiệm (1 kg nguyên liệu lá cỏ ngọt/mẻ)

3.3.3 Xây dựng qui trình công nghệ sản xuất chế phẩm Rebaudioside A

90% qui mô phòng thí nghiệm (1 Kg nguyên liệu/mẻ)

67

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan, luận văn là công trình nghiên cứu khoa học độc lập của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Thị Minh Tú và TS Trương Hương Lan

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn được tập hợp từ nhiều nguồn tài liệu và liên hệ thực tế, các thông tin trong luận văn là trung thực và có nguồn gốc rõ ràng

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung của luận văn này

Nguyễn Thị Làn

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành tốt luận văn này, lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân

thành tới các thầy cô giáo trường Đại học Bách khoa Hà Nội và lòng biết ơn sâu sắc

nhất tới PGS.TS Nguyễn Thị Minh Tú, những người thầy đã dành cả tâm huyết, tận

tình hướng dẫn và trang bị cho tôi những kiến thức làm nền tảng để nghiên cứu, ứng

dụng trong luận văn này cũng như trong hoạt động thực tiễn

Đặc biệt, tôi xin chân thành cảm ơn TS Trương Hương Lan Chủ nhiệm Bộ -

môn Thực phẩm và Dinh dưỡng, TS Lại Quốc Phong và các anh chị em đồng

nghiệp tại Bộ môn Thực phẩm và Dinh dưỡng đã ủng hộ, tạo điều kiện thuận lợi về

cơ sở vật chất, trang thiết bị, dụng cụ thí nghiệm và tận tình hướng dẫn tôi hoàn

thành tốt công trình nghiên cứu của mình

Tôi xin gửi lời tri ân đến gia đình, bạn bè và những người thân đã luôn động

viên, giúp đỡ, tạo động lực cho tôi hoàn thành tốt luận văn này

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu,

chữ viết tắt

FAO Food and Agriculture Organization

of the United Nations

Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hợp Quốc

FDA Food and Drug Administration Cục Quản lý dược và Thực phẩm

Mỹ FSANZ Food Standards Australia New

Zealand

Các tiêu chuẩn thực phẩm Australia và New Zealand

JECFA Joint Expert Committee on Food

Additives

Ủy ban Chuyên gia về phụ gia thực phẩm

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.3 Đặc điểm và hàm lượng các STG trong lá cỏ ngọt S rebaudiana

khô

11

Bảng 1.4 Tính chất hoạt động và các điều kiện tối ưu của các chế phẩm

enzyme thương mại được sử dụng để trích ly đường từ cỏ ngọt

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của nồng độ chất khô của dịch trích ly cỏ ngọt tới hiệu

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ không khí đầu vào sấy phun đến hiệu suất

thu hồi sản phẩm và thành phần của chế phẩm STG

55 Bảng 3.12 Ảnh hưởng của tốc độ nhập liệu đến hiệu suất thu hồi sản phẩm và 56

đánh giá cảm quan của chế phẩm STG dạng bột

Bảng 3.14 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi ethanol đến hiệu suất kết tinh

Rebaudioside A và hàm lượng của Rebaudioside A trong tinh thể

61

Bảng 3.15 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi /cơ chất đến quá trình kết tinh

Rebaudioside A từ chế phẩm STG

62

Bảng 3.16 Tính chất của các chế phẩm RebA khi bổ sung RebA tinh khiết

Bảng 3.17 Một số chỉ tiêu chất lượng của chế phẩm Rebaudioside A 90% 66

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1 Quy trình sản xuất chế phẩm bột STG từ cỏ ngọt dự kiến 29 Hình 3.1 So sánh hiệu quả của các dung môi sử dụng cho trích ly cỏ ngọt 38 Hình 3.2 Ảnh hưởng của loại enzyme đến quá trình trích ly STG từ cỏ ngọt 39 Hình 3.3 Ảnh hưởng tỉ lệ nguyên liệu/nước đến hiệu suất trích ly chất khô từ

cỏ ngọt

41

Hình 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến hiệu suất trích ly từ cỏ ngọt 43 Hình 3.5 Ảnh hưởng của pH đến quá trình trích ly STG từ cỏ ngọt 45 Hình 3.6 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình trích ly STG từ cỏ ngọt 47 Hình 3.7 Hiệu suất trích ly chất khô của các lần trích ly khác nhau 48 Hình 3.8 Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm STG từ cỏ ngọt 58 Hình 3.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình kết tinh Rebaudioside A từ

MỞ ĐẦU

1 Sự cần thiết nghiên cứu đề tài

Cây cỏ ngọt Stevia rebaudiana là một loại cây bụi lâu năm của họ Cúc Compositae có nguồn gốc từ một số vùng của Nam Mỹ Thành phần chất ngọt

chính trong lá của S rebaudiana là Stevioside và Rebaudioside A, chiếm từ 3 –20

% khối lượng lá khô, tiếp theo là RebC, RebD chiếm khoảng 1 %, Dulcoside A chiếm khoảng 0,5 %…

Các loại chiết xuất Stevioside và Rebaudioside A được tách ra từ lá của cỏ ngọt S rebaudiana được sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới như là các tác nhân làm ngọt, các chất làm thay đổi vị và thay thế đường Stevioside và Rebaudioside A là hai hợp chất được sản xuất nhiều nhất, có độ ngọt gấp 250 đến 450 lần so với đường kính, được sử dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm của một số nước Các giá trị lâm sàng của Stevioside và Rebaudioside A bao gồm khả năng để thay thế đường

và khả năng kích thích sự tiết insulin tuyến tụy trong điều trị bệnh tiểu đường và các rối loạn khác của quá trình chuyển hóa hydratcarbon Các loại đường này đều là đường không năng lượng, phù hợp cho những người ăn kiêng không có khả năng , lên men nên tránh được nguy cơ sâu răng Nhờ tính bền nhiệt đến 2000C nên cả hai loại đường này đều có khả năng ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến thực phẩm Đặc biệt, Rebaudioside A được công nhận là thích hợp nhất nhờ vào độ ngọt

dễ chịu và có hậu vị đắng ít nhất

Các phương pháp chiết xuất Steviol glycoside (STG) thông thường từ lá cỏ ngọt bao gồm trích ly bằng nước hoặc cồn, tiếp theo là các giai đoạn tiền kết tủa, đông tụ và kết tinh Các kỹ thuật trích ly hiện đại, chẳng hạn như trích ly với sự hỗ trợ của sóng siêu âm; quá trình trích ly với sự hỗ trợ của vi sóng, trích ly bằng phương pháp lỏng siêu tới hạn đã được sử dụng để chiết xuất các hợp chất hoạt tính sinh học Tuy nhiên, các phương pháp này đều có mặt hạn chế và bất tiện như yêu cầu các trang thiết bị phức tạp, chịu áp suất cao… Do đó, cần có một kỹ thuật mới

sử dụng các tiếp cận công nghệ sinh học để sản xuất các STG từ cỏ ngọt và công nghệ trích ly bằng enzyme đã cho thấy tính khả thi và hiệu quả kinh tế cao

Các công nghệ tách chiết các loại đường đơn từ bột chiết STG của cỏ ngọt phổ biến nhất trong các patent quốc tế là sử dụng các loại dung môi hữu cơ như methanol và ethanol Người ta cũng đã kết tinh Rebaudioside A trực tiếp từ bột chiết STG của cỏ ngọt bằng ethanol với độ tinh khiết hơn 95% Trong khi đó ở Việt Nam, tách chiết Rebaudioside A từ cỏ ngọt vẫn còn là một lĩnh vực rất mới đối với các nhà nghiên cứu, cũng như sản xuất các loại đường có nguồn gốc từ cỏ ngọt Các chế phẩm đường thu nhận được tại Việt Nam ó độ tinh khiết chưa cao Trong luận cvăn này, hướng nghiên cứu của đề tài là tạo ra đường Rebaudioside A từ cỏ ngọt có

độ tinh khiết lên hơn 90%

Phạm vi nghiên cứu là cây cỏ ngọt trồng tại Việt Nam

4 Kết cấu của luận văn

Ngoài phần mở đầu và kết luận, nội dung của luận văn được chia thành 3 chương:

Chương 1: Tổng quan về các vấn đề liên quan đến cây cỏ ngọt, các loại đường chức năng và các phương pháp trích ly, kết( tinh, sấy ) thu nhận đường STG và Rebaudioside A từ cây cỏ ngọt

Chương 2: Trình bày về nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu giải quyết các nội dung của đề tài

Chương 3: Trình bày kết quả nghiên cứu và thảo luận

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN-

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY CỎ NGỌT

1.1.1 Nguồn gốc và đặc điểm thực vật của cây cỏ ngọt Stevia rebaudiana

Bertoni

Cây cỏ ngọt là một chi của cây bụi thuộc họ cúc , Asteraceae, có nguồn gốc

từ Nam Mỹ, ở Amambay phía đông bắc của Paraguay và một phần của Brazil, Argentina Ban đầu, cây có tên gọi là Eupatorium rebaudianum, sau nó được đổi thành Stevia rebaudiana Bertoni mang tên nhà sinh vật học lần đầu tiên mô tả chi tiết và phân loại thực vật cho cây từ năm 1905

Cỏ ngọt có thể phát triển chiều cao đến 1m, sống lâu năm với hệ rễ chùm và thân mảnh nhỏ Thân cây là gỗ và có lông ở phía dưới Thân rễ có nhánh rễ mảnh

Lá hình bầu dục từ 3 cm đến 4 cm, kéo dài hình ngọn giáo hay dạng thìa, có răng , cưa từ giữa đến đỉnh lá và toàn bộ phía dưới, không có cuống, phía trên bề mặt của

lá có lớp lông tơ mịn Hoa có 5 cánh, nhỏ, màu trắng sáng với cuống hoa màu tím nhạt, chụm lại bao quanh đài hoa Các đài hoa liên kết lỏng lẻo, không đều và kết lại thành chùm nhỏ từ 2 - 6 đài hoa Quả hình trục có năm gân cánh nhọn (Hình 1.1)

Hình 1.1 Cây cỏ ngọt Stevia rebaudiana Bertoni Cây cỏ ngọt thu hút được sự chú ý đối với nền kinh tế và sự quan tâm của khoa học nhờ vào độ ngọt và các dược tính của lá cây Trong lá cỏ ngọt khô chứa hàm lượng đường diterpene cao, chủ yếu là đường diterpenoid glycoside và stevia

b Cây cỏ ngọt (đã trổ hoa)

a Cây cỏ ngọt (chưa trổ hoa)

glycoside Trong số 230 loài thuộc giống Stevia, chỉ có loài rebaudiana và phlebophylla sinh ra các loại đường Steviol glycoside (STG) 9] [5

1.1.2 Thành phần dinh dưỡng của cỏ ngọt

Nhiều phân tích cho thấy, lá cỏ ngọt có chứa hầu hết các thành phần dinh dưỡng quan trọng như protein và các axit amin thiết yếu, lipid, carbonhydrate, và cả các vitamin, khoáng chất (bảng 1.1) Tuy nhiên, hàm lượng các chất thay đổi, tùy theo từng vùng và các điều kiện khí hậu [25]

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của lá cỏ ngọt S rebaudiana [25]

(tính theo khối lượngkhô)Thành phần dinh dưỡng

Các vitamin tan trong nước

Trong nghiên cứu của mình, Mishra (2010) đã cho thấy khả năng giữ nước

và khả năng hấp thụ chất béo của bột lá cỏ ngọt, chứng tỏ trong lá cỏ ngọt có chứa

một hàm lượng protein đáng kể 4][5 Lá cỏ ngọt cũng được xem là nguồn cung cấp các axit béo không no một nối đôi khá cao như axit oleic (43,6 g/kg dầu), và cả axit béo không no nhiều nối đôi như axit linoleic (93,2-124,0 g/kg dầu) [79] Các axít béo không no có ảnh hưởng quan trọng đến hệ thống miễn dịch của tế bào, axít linolenic có thể đóng góp lớn vào việc duy trì một tỷ lệ axit béo lý tưởng trong chế

độ ăn uống của con người

Stevia có chứa một lượng đáng kể các chất dinh dưỡng quan trọng, trong đó

có thành phần các chất khoáng cần thiết để bảo vệ cơ thể, điều tiết và duy trì quy trình trao đổi chất khác nhau Kali, canxi, magiê, natri là chất dinh dưỡng quan trọng đã được tìm thấy trong lá Stevia với ồng độ cao rất có lợi cho sức khỏe n , Hàm lượng kali cao được xác định trong hầu hết các nghiên cứu Kẽm và sắt được tìm thấy trong các loại thực phẩm có nguồn gốc thực vật và động vật và cũng có mặt trong lá cỏ ngọt Stevia Từ lá cỏ ngọt cũng có thể được sử dụng để tạo các chế phẩm để chống thiếu sắt, thiếu máu, một loại rối loạn dinh dưỡng chủ yếu ở các nước đang phát triển Nghiên cứu của tác giả Abou-Arab (2010) đã xác định có tổng cộng 17 axit amin trong lá cỏ ngọt, trong đó có 9 axit amin thiết yếu (7,67 mg/100g trọng lượng khô) và 8 axit amin không thiết yếu (3,72 mg/100g) Điều này cho thấy

lá cỏ ngọt chứa gần như tất cả các axit amin không thể thiếu, bao gồm cả tyrosine

và cysteine [11] Như vậy, sau khi trích ly từ lá, các axit amin thiết yếu có thể là một nguồn các chất vi lượng có giá trị không thể thiếu cho các sản phẩm y tế

1.1.3 Các hoạt chất sinh học trong lá cỏ ngọt

Cây cỏ ngọt S rebaudiana được coi là một loại nguyên liệu quan trọng và có nhiều tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, thức ăn chăn nuôi cũng như trong y học do có chứa các hợp chất chống oxy hóa, hợp chất kháng khuẩn và các hợp chất tạo ngọt [25]

1.1.3.1 Các hợp chất diterpene

Lá cỏ ngọt có chứa nhiều hợp chất diterpene steviol glycoside Các glycoside phân tách được từ thực vật đều có chung nhóm steviol (dạng aglycone của stevioside), chỉ khác nhau về số lượng các gốc saccharide [28] Hầu hết các hợp

chất glycoside này đều là chất tạo ngọt tự nhiên với độ ngọt cao, nó không chuyển hóa trong cơ thể con người, do đó không cung cấp năng lượng khi ăn [54]

1.1.3.2.Các hợp chất chống oxy hóa

Nhiều tác giả đã phát hiện ra khả năng chống oxy hoá đáng kinh ngạc nhờ các hợp chất chống oxy hoá trong lá cỏ ngọt, chủ yếu là các hợp chất phenolic và flavonoid Tadhani và cộng sự (2006b) đã công bố rằng, lá có ngọt có chứa 25,18 g/kg hợp chất phenolic tổng số và 21,73 g/kg flavonoid tính theo khối lượng khô [72] Một nghiên cứu khác sử dụng nước để chiết tách hợp chất phenolic (cathechin) từ lá cỏ ngọt với hàm lượng là 130,67 g/kg, trong khi hàm lượng flavonoid (quercetin) là 15,64 g/kg [25] Hàm lượng cao nhất các hợp chất chống oxy hoá đã được tìm thấy trong dịch trích ly Stevia rebaudiana Bertoni với dung môi acetone và methanol Thử nghiệm ức chế sự hình thành hydroperoxide trong dầu cá mòi đã cho thấy, chiết xuất lá Stevia thể hiện hoạt tính chống oxy hoá cao hơn cả 2 dạng D và L- -α tocopherol hay chiết xuất trà xanh Hoạt tính chống oxy hoá của chiết xuất lá Stevia đã được báo cáo do khả năng bẫy các gốc tự do và các hợp chất superoxit [76]

1.1.3.3 Các hợp chất kháng khuẩn

Các hợp chất kháng khuẩn tiềm năng trong lá cỏ ngọt được tìm thấy như: fructo oligosaccharit dạng inulin, tanin, đặc biệt là các loại tinh dầu và các chất tạo hương [38] Savita và cộng sự (2004) đã tìm thấy hàm lượng cao các hợp chất kháng khuẩn trong dịch chiết lá cỏ ngọt bằng nước như axit oxalic và tanin với hàm lượng 2.295 và 0,01mg/100g, tương ứng 8][6 Tomita và cộng sự (1997) đã chỉ ra hoạt tính diệt khuẩn trên vi khuẩn đường ruột Escherichia coli của dịch lên men từ dịch chiết cỏ ngọt S rebaudiana Bertoni bằng nước nóng [74] Khả năng của Stevia

ức chế sự phát triển của một số vi khuẩn giúp giải thích cách sử dụng truyền thống trong điều trị vết thương, vết loét và bệnh nướu răng Nó cũng có thể giải thích tại sao cây thảo mộc này lại được tin dùng cho những người dễ bị nhiễm trùng nấm hoặc tái nhiễm trùng liên cầu [26]

Trong khi đó, Braz de Oliveria và cộng sự (2011) đã chứng minh rằng trong

rễ và lá cỏ ngọt S rebaudiana còn chứa các hợp chất polysaccharide chức năng như fructo oligosaccharit dạng inulin và các chất xơ tiêu hóa, các hợp chất này đã được chứng minh là có tác dụng như prebiotic và tiền kháng sinh Nhóm tác giả cũng đã thu được fructo oligosaccharit từ rễ và lá của cây với hàm lượng tương ứng là 4,6 %

và 0,46 % [17] Lá cỏ ngọt chứa nhiều hoạt chất có tác dụng kháng sinh chống vi khuẩn nên được thử nghiệm để điều trị khối u hay chữa viêm tế bào Lá, cành và rễ cây cỏ ngọt còn có thể được trộn lẫn làm sợi dệt áo quần, khăn bàn, màn giấy , chống vi khuẩn

1.1.4 Sản xuất và tiêu thụ cỏ ngọt

1.1.4 1 Trên thế giới

Cây cỏ ngọt Stevia vẫn là một loại cây quý hiếm trong môi trường tự nhiên Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng Stevia đã được trồng từ xa xưa và được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau trên khắp thế giới Trong nhiều thế kỷ, các bộ tộc Guarani của Paraguay và Brazil sử dụng loài Stevia (chủ yếu là S rebaudiana),

được họ gọi là ka’a he’ê, như một viên ngọt trong các loại trà và trà thuốc để điều trị ợ nóng và các đau nhức trong cơ thể [16]

Nhật Bản là đất nước Châu Á đầu tiên trồng cây cỏ ngọt để chiết xuất Stevioside dưới dạng viên nén trong thức ăn và công nghiệp dược Năm 1980, Nhật công bố sáng chế JP5516562 về “đường năng lượng thấp” Đường này có thể cho vào cà phê, nước trái cây hay các thức uống khác vì vị của nó rất ngon Năm 2010, các nhà nghiên cứu cải tiến độ ngọt của cỏ ngọt bằng phương pháp trồng cỏ ngọt mới: cỏ ngọt được chiếu tia bức xạ để làm biến đổi đặc điểm di truyền Ngày nay, việc canh tác cỏ ngọt được lan rộng ra nhiều vùng khác trên toàn thế giới, từ châu

Mỹ (Mỹ, Canada, Mexico, Trung Mỹ), Châu Âu (Tây Ban Nha, Italia, Bỉ, Anh) và một phần Châu Á (Nhật Bản, Trung quốc, Đài Loan, Ấn Độ, Isarel, Malaysia, Hàn Quốc, Singapore, và Việt Nam) [31, 52 ]

Các loại đường từ cỏ ngọt được dùng thay thế đường mía, để điều trị bệnh đái tháo đường Cỏ ngọt có vai trò như là một nguyên liệu tự nhiên cho ngành công

nghiệp thực phẩm sức khỏe và hóa mỹ phẩm…[45] Cỏ ngọt đã được nghiên cứudùng để tạo hương cho thuốc lá [71], làm đồ uống cho người ăn kiêng, bệnh tiểu đường, béo phì, tăng huyết áp và ngăn ngừa bệnh loãng xương như trà, sữa, nước ép trái cây, bánh ăn liền [45, 78 ].

Ngày 4 tháng 7 năm 2008, Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hợp Quốc (FAO) phê chuẩn và Cục Quản lý dược và Thực phẩm Mỹ (FDA) cho phép (ngày 17 tháng 12 năm 2008) về việc sử dụng cây cỏ ngọt để chế xuất chất làm ngọt Đường chiết xuất từ cây cỏ ngọt đang trở thành mặt hàng thiết yếu và an toàn Các hãng thực phẩm lớn trên thế giới như Coca, Pepsi, Cargill, Nestea… đang sử dụng đường cỏ ngọt thay đường mía Trên thị trường Pháp, giá cỏ ngọt rất cao, khoảng 10 15 Euro cho 50 g bột tinh chất Công ty Phare Ouest đã đưa vào thị -trường sản phẩm nước giải khát Breihz Cola với đường làm từ cỏ ngọt Stevia Từ các chế phẩm đường STG có thể sản xuất các sản phẩm dạng viên (Stevia sweet), dạng bột (Truvia) hoặc dạng lỏng (Stevia Concentrate) … Chúng được kết hợp với các mùi hương khác nhau như mùi chocolate, mùi dâu (berry), mùi nho giúp đa dạng hóa sản phẩm Dự đoán, chỉ trong vòng 5 năm tới, cỏ ngọt sẽ có thể chiếm được từ 20 25 % thị phần của đường thực phẩm.-

1.1.4 .2 Tại Việt Nam

Cây cỏ ngọt được trồng ở Việt Nam từ tháng 8 năm 1988 Một số nhà khoa học đã thành công trong việc nghiên cứu nâng cao năng suất và khả năng chống chịu của cây cỏ ngọt như các công trình nghiên cứu của Hoàng Chung (1991), Trần Đình Long, Mai Phương Anh (1993) Các nhà khoa học cũng đã tích cực đưa cây cỏ ngọt về trồng tại nhiều địa phương [2, 7] Từ năm 2010, cây cỏ ngọt đã được trồng thử nghiệm trên đồng đất xã Nghi Đồng, huyện Nghi Lộc, Diễn Châu… Theo các kết quả nghiên cứu, khảo nghiệm, sản xuất thử cho thấy cỏ ngọt phù hợp với thổ nhưỡng và khí hậu của nhiều vùng sinh thái tại Việt Nam Năng suất bình quân đạt

6 - 9 tấn lá khô/ha Ngày nay, cỏ ngọt đã được phát triển trên nhiều vùng ở trong nước, từ các tỉnh miền núi phía Bắc như Hà Giang, Cao Bằng, Bắc Giang, Vĩnh

Phúc, Hòa Bình, Hà Nội cho đến các tỉnh miền Trung và các tỉnh phía Nam như Lâm Đồng, Đắc Lắc

Hình 1.2 Trồng cỏ ngọt tại một số địa phương ở nước ta

Tại Việt Nam, các dạng STG được biết đến chủ yếu là các chiết xuất từ cỏ ngọt Cỏ ngọt có mặt trên thị trường với vai trò là nguyên liệu và các thành phẩm như: lá khô (làm trà đơn), dạng bột lá cỏ ngọt hoặc phối hợp với atiso dạng túi lọc (Sweet herb Vĩnh Tiến, Cỏ ngọt Vĩnh Tiến, Cỏ ngọt Thanh Huyền dạng tinh chất), (Đường cỏ ngọt Stevia, Đường cúc ngọt) hoặc chiết xuất để bổ sung vào các loại trà, cà phê, nước giải khát, chè ngọt, bánh mứt kẹo

1.2.1 Cấu tạo và tính chất của các loại đường từ cỏ ngọt

Steviol glycoside (STG) là chất chuyển hóa thứ cấp chịu trách nhiệm tạo ra

vị ngọt, được hình thành qua con đường sinh tổng hợp trong lá của cây cỏ ngọt STG có bản chất là các vòng tetracyclic diterpene (diterpene glycoside), thu được từ tiền chất kaurenoid giống như axit gibberallic [16] Hình 1.2, hình 1.3 và bảng 1.2trình bày cấu trúc hóa học và công trúc phân tử của các loại đường STG [29, 32]

Bảng 1.2 Cấu tạo các đường STG trong lá cỏ ngọt[32]

TT Tên các loại

đường

Công

thức hóa học

7 Rebaudioside D C50H80O28 β -Glc- -Glc(2 1) β →

β -Glc- -Glc(2 1) β → β-Glc (3 1) →

Hai hợp chất Stevioside và Rebaudioside A, chỉ được cấu tạo từ các gốc glucose, trong khi stevioside có hai phân tử glucose liên kết ở vị trí hydro trên đầu thì Rebaudioside A có ba phân tử glucose, trong đó gốc glucose ở giữa kết nối với cấu trúc steviol trung tâm Độ ngọt của Rebaudioside A tăng cùng với sự gia tăng số lượng gốc glucose liên kết với aglycone (steviol) [43 ]

Hàm lượng STG trong lá cỏ ngọt chiếm từ 10 20% trọng lượng khô [5- 2] Hai hợp chất được tìm thấy nhiều nhất trong lá cỏ ngọt là stevioside (4-13%) và Rebaudioside A (2-4%), các hợp chất có hàm lượng nhỏ hơn là Rebaudioside C (1-2%) và dulcoside (0,4-0,7) [46] Các hợp chất Steviobioside, Rebaudioside B, D, E

và F, dulcoside A và B được tìm thấy với lượng rất nhỏ Hàm lượng của các Stevioside và Rebaudioside A thường dao động rất lớn, phụ thuộc rất nhiều vào kiểu gen cũng như điều kiện canh tác [79 ]

Bảng 1 Đặc điểm và hàm lượng các 3 STG trong lá cỏ ngọtS rebaudiana khô [14]

Các hợp ch t ấ

STG Trọng lượng phân tử

Độ ng t ọ tương đối Điể chảy m nóng Độ trong nướ hòa tan c Hàm lượng (%)

Theo Jackson, 2006 thì Rebaudioside A là một loại glycoside trong cỏ ngọt

có vị ngọt nhất (từ 200 450 lần so với đường saccharoza) và là một chất ngọt - không năng lượng có khả năng thương mại cao [36] Từ năm 1982, Giovanetto đã thu nhận được từ cỏ ngọt 2 loại chất ngọt glycoside chính là Stevioside và Rebaudioside A và tìm thấy rằng hương vị khác biệt đáng kể giữa hai thành phần này Hậu vị xuất hiện trong các mẫu Stevioside ngay cả ở các nồng độ lớn hơn 99 %

độ tinh khiết Ngược lại, Rebaudioside A không có hậu vị và có hương vị ngọt tương đương với đường kính Nhìn chung, trong số các STG, người ta đã công nhận rằng Rebaudioside A là thích hợp nhất để sử dụng như các loại đường không năng lượng cho công nghiệp thực phẩm nhờ vào độ ngọt dễ chịu của nó, được phê chuẩn

sử dụng, đánh giá cao của khách hàng và có hậu vị đắng ít nhất Ngoài Rebaudioside A thì các loại glycoside khác cỏ ngọt đều ít nhiều có hậu vị không mong muốn (thường là hậu vị đắng) Sterebin (một nhóm các hợp chất diterpen được biết tới thường xuyên là “dầu vàng” trong dịch trích ly cỏ ngọt) có vị rất đắng, ngay cả ở nồng độ rất nhỏ [34]

1.2.2.Vai trò của các loại đường cỏ ngọt

Chất chiết xuất từ Stevia rebaudiana Bertoni đã được sử dụng làm chất làm ngọt từ thời cổ đại Tiêu thụ thường xuyên các hợp chất STG làm giảm hàm lượng đường, chất phóng xạ và cholesterol trong máu [12], cải thiện sự tái tạo tế bào và đông máu, ngăn chặn sự tăng trưởng của tế bào ung thư và tăng cường mạch máu[50] Cỏ ngọt không gây sâu răng, bảo vệ răng miệng và giúp làm lành các vết thương ngoài da [15] Các loại đường chức năng này có tác dụng như là loại đường không năng lượng, phù hợp cho những người ăn kiêng

1.2.2.1 Tác dụng đối với bệnh tiểu đường

Tác dụng đối với dung nạp và chuyển hóa glucose

Khi sử dụng, đường cỏ ngọt không làm tăng hàm lượng đường trong máu giống như các loại đường khác Ngay từ năm 1986, Curi đã nghiên cứu tác dụng của

lá cỏ ngọt trên sự dung nạp glucose ở 16 người tình nguyện, với liều sử dụng là cứ 6 giờ bổ sung 5g lá trong 3 ngày Kết quả cho thấy nếu dùng lá cỏ ngọt, đường huyết

tăng ít hơn và nhanh trở về bình thường hơn so với người không dùng cỏ ngọt Kết quả nghiên cứu của trường đại học Maringa, Brazil cho thấy dịch chiết lá cỏ ngọt có khuynh hướng chuyển glucose vào trong tế bào, làm giảm lượng đường trong máu

Do vậy, cỏ ngọt là thực phẩm tuyệt vời cho bệnh nhân tiểu đường [20]

Năm 2004, Rascovic đã nghiên cứu tác dụng của một chế phẩm giàu Stevioside từ lá cỏ ngọt trên đường huyết ở chuột nhắt trắng bị tiểu đường do alloxan và nhận thấy chế phẩm này có tác dụng ức chế sự tăng đường huyết do alloxan 4] [6 Cũng trong năm này, Gregersen đã thử nghiệm lâm sàng tác dụng của Stevioside trên bệnh nhân bị tiểu đường typ 2 (mỗi nhóm 12 người cho cả đối chứng và thử nghiệm) Nhóm đối chứng sử dụng 1 g Stevioside, nhóm thử nghiệm

sử dụng 1 g bột ngô Sau đó đo hàm lượng đường trong máu sau khi ăn ở các thời điểm 30 phút, 60 phút cho đến 240 phút Kết quả cho thấy ở nhóm thử nghiệm, đường cong đáp ứng glucoza thấp hơn 18% so với đối chứng và chỉ số insulin tăng xấp xỉ % so với nhóm đối chứng40 [33]

Trong một nghiên cứu của Maki và cộng sự (2008) đã tiến hành thử nghiệm đánh giá ảnh hưởng của việc tiêu thụ 1000 mg Rebaudioside A ở nam giới và phụ

nữ có tuổi đời từ 33 75 năm tuổi bị bệnh đái tháo đường ty- pe 2 (n = 60) ong vòng tr

16 tuần so với giả dược (n = 62) Những kết quả nghiên cứu đều cho thấy rằng sử dụng lâu dài 1000 mg Rebaudioside A không làm thay đổi cân bằng glucose cũng như áp suất máu ở những người bị tiểu đường type 2 [50]

Gần đây, nhóm tác giả Rizzo (2013) đã nghiên cứu ảnh hưởng của bốn chất chiết xuất Stevia thương mại đối với hoạt động vận chuyển glucose trên các tế bàobạch cầu HL 60 và tế bào thần kinh SH- -SY5Y ở người Kết quả nghiên cứu đã cho thấy các chiết xuất này có thể làm tăng sự hấp thu glucose trong cả hai dòng tế bào Các hợp chất STG có thể hoạt động bằng cách điều tiết sự chuyển vị các tác nhân vận chuyển glucose thuận lợi (GLUT - Facilitative glucose transporters) qua con đường PI3K/Akt như khi điều trị bằng insulin Chiết xuất STG cũng tăng phosphoryl hóa PI3K và Akt Hơn nữa, nó có thể phục hồi những ảnh hưởng của việc giảm hấp thu glucose gây ra bởi methylglyoxal –một chất ức chế thụ thể insulin/PI3K/Akt

Những kết quả này chứng minh giả thuyết cho rằng, chiết xuất STG có tác động giống như insulin trong điều chỉnh đường đi của PI3K/Akt [65]

Tác dụng điều tiết insulin

Ở các bệnh nhân đái tháo đường, insulin không được tổng hợp đầy đủ, dẫn đến sự tăng đường huyết cùng với những thay đổi về hàm lượng glucose và chuyển hoá lipid trong máu [66] Một số nghiên cứu đã chỉ ra, đường cỏ ngọt có tác dụng trợ giúp tuyến tạng tiết insulin Trong nghiên trên vitro,Chen và cộng sự (2006) đã chứng minh rằng stevioside làm tăng bài tiết insulin nội bào trên chuột và do đó có thể có vai trò như một chất chống tăng đường huyết trong điều trị đái tháo đường type 2 [23]

Saravanan và cộng sự (2012) đã đánh giá hiệu quả hạ đường huyết của Rebaudioside A đối với các hoạt động của các enzyme trong gan tham gia vào quá trình chuyển hóa carbohydrate chuột nhắt bị tiểu đường ở Theo dõi những con

chuột nhắt bị tiểu đường được uống Rebaudioside A với liều lượng 50, 100 và 200 mg/kg thể trọng trong 45 ngày Kết quả cho thấy, có sự giảm đường huyết đáng kể (p <0,05) và sự điều chỉnh các enzyme chuyển hóa carbohydrate ở gan một cách có

ý nghĩa Cơ chế hoạt động của Rebaudioside A có thể có tương quan với tác dụng

hạ đường huyết của sulphonylurea thông qua việc kích thích tiết insulin bằng cách đóng kênh K+, ATP, sự khử cực màng và sự kích thích dòng Ca2+ Đây đều là cácbước cơ bản ban đầu trong quá trình bài tiết insulin từ các tế bào còn sót lại cũng β như từ tế bào β tái sinh của tuyến tụy [67] Các nghiên cứu cho thấy, nồng độ insulin huyết thanh được giữ ở mức bình thường để duy trì hàm lượng glucose homeostasis bằng cách tăng cường glycolysis và glycogen tổng hợp trong cơ xương [51], đồng thời với việc làm giảm glycogenolysis trong gan và cơ xương [70] Sự thay đổi mô bệnh học của tuyến tụy đã khẳng định tác dụng bảo vệ của Rebaudioside A ở chuột nhắt Những kết quả về Rebaudioside A có hoạt tính hạ đường huyết đã cung cấp thêm bằng chứng trong kiểm soát bệnh tiểu đường của Rebaudioside A

Tại Việt Nam, năm 1994, các tác giả Trần Thúy, Bùi Bích Nguyệt, Trần ĐứcLong đã đưa ra thông báo về tác dụng lâm sàng của trà cỏ ngọt trên 10 bệnh nhân tiểu đường trên tạp chí Y học Cổ truyền Việt Nam Theo đó, bệnh nhân được điều trị bằng trà bào chế từ cỏ ngọt và các vị thuốc nam phối hợp Kết quả nghiên cứu cho thấy trà thuốc này có tác dụng làm giảm đường huyết, không gây tác dụng phụ, bệnh nhân có thể dùng lâu dài Tiếp đó, vào năm 1996, nhóm tác giả này lại khẳng định một lần nữa về kết luận cỏ ngọt dạng trà thuốc có tác dụng ổn định đường huyết trên bệnh nhân tiểu đường type 2 [9]

1.2.2.2 Tác dụng đối với bệnh béo phì, ăn kiêng

Savita (2004) đã phân tích lá cỏ ngọt trên cơ sở trọng lượng khô và đã tính toán năng lượng của 1 g lá cỏ ngọt là 2,7 kcal [68] Điều này có nghĩa rằng các đường cỏ ngọt là chất ngọt có năng lượng thấp, dựa trên vị ngọt mạnh của nó so với các chất ngọt thương mại khác như đường Acesulfame K, Aspartame, Saccharin và Sucraloza Năng lượng được sinh ra từ chế độ ăn uống các hợp chất đường được coi

là cao khi nó được chuyển hóa hoàn toàn vào cơ thể, có thể gây ra tình trạng thừa cân Trong bối cảnh này, việc sử dụng đường cỏ ngọt như là một chất làm ngọt có năng lượng thấp có thể hạn chế hoặc kiểm soát lượng calo trong chế độ ăn uống một cách hiệu quả Điều này có thể góp phần đáp ứng nhu cầu cho các thành phần thực phẩm ít calo với các đặc tính dinh dưỡng, điều trị và chức năng Qua đó, có thể giúp

đỡ những người cần hạn chế lượng carbonhydrate hoặc giảm chỉ số đường huyết trong chế độ ăn uống, thưởng thức vị ngọt với lượng calo tối thiểu Giáo sư Margaret Ashwell người Anh (2015) cũng đã chỉ ra tiềm năng của các đường Stevia như một công cụ giúp giảm lượng năng lượng ăn vào qua đó giảm và phòng ngừa bệnh béo phì

1.2.2.3 Tác dụng đối với bệnh cao huyết áp, tim mạch

Những tác dụng làm giảm huyết áp mới được ghi nhận đối với stevioside Nghiên cứu của Hsu và cộng sự (2002) đã cho thấy tác dụng hạ huyết áp đáng kể của stevioside ở các dòng chuột khác nhau với liều 50 mg/kg Dữ liệu cũng cho thấy stevioside ở nồng độ 100, 200 và 400 mg/kg làm giảm huyết áp trong liều phụ thuộc

trêu những con chuột bị cao huyết áp Tuy nhiên, huyết áp đã trở lại mức trước đó sau khi thuốc đã ngưng dùng trong 2 3 ngày Uống 0,1% dung dịch stevioside có -thể có tác dụng chống cao huyết áp cho những con chuột trưởng thành và cũng ngăn ngừa bệnh cao huyết áp ở những con chuột chưa trưởng thành [35] Tiếp đó, năm

2003, nhóm nghiên cứu của Liu cũng chỉ ra stevioside hiệu quả hạ huyết áp đáng kể

ở những con chó bị cao huyết áp, phụ thuộc liều lượng ghiên cứu này cũng khẳng Nđịnh rằng stevioside là một sản phẩm tự nhiên có hiệu quả chống cao huyết áp hiệu quả, và cơ chế hạ huyết áp có thể là do sự ức chế dòng Ca (2+) [46]

Gần đây nhất, Onakpoya và Heneghan (2015) đã thực hiện nghiên cứu với 9

sự tham gia của 756 người có nguy cơ tim mạch cao Bằng chứng từ những thử nghiệm ngẫu nhiên có đối chứng (RCTs- Randomised controlled trials) và phân tích meta cho thấy stevioside có thể làm giảm huyết áp và đường huyết lúc đói Tuy nhiên, kích cỡ của các hiệu ứng là nhỏ Trong khi đó, Rebaudioside A dường như không có tác động đáng kể nào đối với huyết áp hoặc các yếu tố nguy cơ tim mạch [56]

1.2.3 Tính ổn định của các đường cỏ ngọt

STG có khả năng chịu được nhiệt độ cao lên đến 2000C, rất phù hợp để sử dụng trong chế biến thực phẩm [45] Các glycoside ổn định ở giải pH và khoảng nhiệt độ rộng, không sinh năng lượng, không có giá trị dinh dưỡng, không bị lên men Ủ tinh thể rắn Stevioside ở nhiệt độ cao trong 1h cho thấy sự ổn định tốt lên đến 1200C mà không bị hóa nâu hay bị caramen hóa [11], trong khi ở nhiệt độ vượt quá 1400C bắt đầu có sự phân hủy [44] Stevioside có sự ổn định nhiệt độ cao sau 1h đun nóng ở 1000C trong điều kiện pH từ 3 9 Tuy nhiên, nó lại bị phá hủy nhanh -chóng ở pH kiềm 2] [4

Trong các đồ uống có độ axit, cả stevioside và Rebaudioside A đều được tìm thấy trạng thái ổn định ở nhiệt độ phòng trong thời gian ít nhất là ba tháng [21] Nghiên cứu của Clos và cộng sự (2008) đã đề cập đến khả năng chịu ánh sáng của Rebaudioside A và Stevioside trong nước ngọt có ga Nhóm tác giả đã không tìm thấy dấu hiệu phân hủy của Rebaudioside A và Stevioside sau một tuần tiếp xúc với ánh sáng mặt trời ở nhiệt độ quanh nhiệt độ phòng [19] Tương tự như vậy,

WölwerRieck và cộng sự (2010) cũng so sánh sự ổn định của Stevioside và Rebaudioside A sử dụng trong sản phẩm nước ngọt Theo kết quả của nhóm nghiên cứu, Rebaudioside A ổn định hơn so với Stevioside, mức độ giảm lên đến 70% được quan sát thấy sau 72 giờ lưu trữ ở 800C [58]

Trong một nghiên cứu rộng hơn, Prakash và cộng sự (2008) đã chứng minh tính khả thi của đường Rebaudioside A với độ tinh khiết cao để sử dụng như chất làm ngọt Theo đó, nhóm nghiên cứu đã thấy Rebaudioside A ổn định ở pH lớn hơn 2 Rebaudioside A cũng không bị phân hủy khi được thêm vào sữa chua hoặc bánh trắng Sự ổn định của một vài STG đã được thử nghiệm trong một phạm vi đa dạng các loại thực phẩm Hiện vẫn chưa có bất kỳ bằng chứng nào về sự phân hủy STG trong các nghiên cứu Vì vậy, có thể yên tâm rằng việc bổ sung STG đối với thực phẩm sẽ không làm thay đổi chất lượng hoặc thời gian bảo quản thực phẩm [58] 1.2.4 Tính an toàn của các loại đường cỏ ngọt

Các thống kê tính tới năm 2012 cho thấy trên thế giới có khoảng 400 công trình nghiên cứu về cây cỏ ngọt và các chất tạo ngọt từ loại cây này Điều đó chứng

tỏ mức độ quan tâm của các nhà khoa học về khả năng ứng dụng của đường cỏ ngọt cũng như tính an toàn của nó với sức khỏe con người

Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy stevioside không gây đột biến, không gây quái thai hay ung thư 5, 79][7 Hơn nữa, các phản ứng dị ứng không xuất hiện trên người tham gia thử nghiệm khi chúng được sử dụng như chất làm ngọt trong thức ăn Stevioside và steviol có độc tính cấp tính rất thấp ở các loài chuột thí nghiệm với giá trị LD50 lớn Stevioside ở liều cao đến 15g/kg thể trọng không gây

tử vong cho chuột nhắt Tác giả Aze (1991) đã tách Stevioside từ lá cỏ ngọt và nghiên cứu độc tính bán trường diễn dùng đường uống cho chuột cống trắng (15 cá thể cho mỗi thí nghiệm) Kết quả cho thấy không có sự thay đổi nào đáng kể giữa các nhóm đối chứng và thử nghiệm, kể cả ở liều cao 50 % so với khẩu phần ăn Các nghiên cứu so sánh quá trình trao đổi chất cung cấp thêm bằng chứng xác nhận việc chuyển hóa của tất cả các loại STG giống với các loại đường thông thường và cũng như quá trình chuyển hóa chúng giống nhau giữa chuột và người [13]

Gần đây các nghiên cứu độc tính sinh sản của Rebaudioside A và các STG khác đã chứng minh chúng an toàn ngay cả với chế độ ăn uống có hàm lượng cao của các loại đường từ cỏ ngọt này [32] Rebaudioside A với độ tinh khiết cao được sản xuất theo các tiêu chuẩn về thực phẩm là an toàn cho tiêu dùng của con người

để sử dụng như một chất làm ngọt [18] Năm 1999, JECFA báo cáo rõ rằng không

có dấu hiệu tiềm tàng gây ung thư của stevioside [7 ] Ngày 14/4/2010, cơ quan an 7toàn thực phẩm châu Âu đã đưa ra liều dùng an toàn của các chất ngọt chiết xuất từ cây Stevia là 4 mg/kg trọng lượng cơ thể.

Nếu như ở châu Âu, cỏ ngọt mới chỉ được công nhận trong công nghiệp thực phẩm thì tại Việt Nam, qua kinh nghiệm sử dụng người ta nhận thấy, cỏ ngọt có khả năng làm giảm nhu cầu chất đường và chất bột của người bệnh và cung cấp năng lượng cho cơ thể ở mức thấp, không gây tác dụng phụ và không độc hại o đó, các Dlương y khuyên những người mắc bệnh tiểu đường, béo phì, tăng cholesterol trong máu và người cao tuổi nên dùng cỏ ngọt hoặc Stevioside thay thế các loại đường từ mía và củ cải

Đường từ cỏ ngọt thường được trích ly bằng các dung môi hữu cơ Thêm vào

đó, một vài nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng, đường có thể được trích ly bằng cách

sử dụng một số phương pháp ưu việt khác như: trích ly có sự hỗ trợ của sóng siêu âm; quá trình trích ly với sự hỗ trợ của vi sóng, trích ly bằng phương pháp lỏng siêu tới hạn, phương pháp trích ly có sự hỗ trợ của enzyme

1.3.1 Trích ly đường cỏ ngọ có sự hỗ trợ của COt 2siêu tới hạn

Công nghệ trích ly sử dụng CO2 siêu tới hạn đã được ứng dụng ở nhiều quốc gia CO2 lỏng được sử dụng như một dung môi, và có thể gia nhiệt hoặc gia tăng áp suất để hỗ trợ quá trình trích ly Tại Ấn Độ, công nghệ này dùng để trích ly tinh chất trong gia vị và thảo dược; tại New Zealand, Ba Lan ứng dụng trên hoa hublông và thảo dược; tại Tây Ba Nha ứng dụng để xử lý nút bần rượu vang nhằm tạo ra sản phẩm không mùi, không ảnh hưởng đến rượu; tại Đức, Ý ứng dụng để loại caffein

trong trà, cà phê; tại Đài Loan dùng để xử lý thuốc trừ sâu trong gạo cho sản phẩm gạo “sạch”; tại Hàn Quốc ứng dụng để sản xuất dầu mè…

Sử dụng CO2 siêu tới hạn (SCD) là một phương pháp tốt để trích ly đường từ

cỏ Tan (1988) đã được cấp bằng sáng chế của Nhật Bản cho việc sản xuất các STG bằng cách chiết xuất theo phương pháp trích ly lỏng siêu tới hạn bằng CO2 và 1 chất dung môi (methanol hoặc ethanol hoặc acetone) 3][7 Giai đoạn tinh chế được thực hiện bằng cách cho hấp thụ các tạp chất lên các cột nhựa trao đổi ion Ở Mỹ, Kienle (1992) cũng được cấp bằng sáng chế tương tự [41] Một trong những nhược điểm của phương pháp trích ly bằng CO2 siêu tới hạn đó là khả năng phân cực yếu của

CO2 lỏng siêu tới hạn ở các điều kiện trích ly thông thường và có thể hình thành một vài dạng liên kết dung môi chất tan đặc biệt Việc thêm một lượng nhỏ các -dung môi phân cực như methanol, ethanol, nước, methylene chloride hay hexan…

để thay đổi tính phân cực giúp tăng khả năng trích ly của dung môi CO2

1.3.2 Trích ly đường cỏ ngọt có sự hỗ trợ của sóng siêu âm (UAE)

Trong quá trình trích ly, đôi khi sóng siêu âm cũng được áp dụng để tăng hiệu quả trích ly Sóng siêu âm với cường độ cao(20-42 kHz) thường được sử dụng

để phá vỡ cấu trúc tế bào, làm tăng sự hòa tan của chất tan vào dung môi và tăng quá trình khuyếch tán chất tan, thúc đẩy quá trình trích ly

Việc sử dụng sóng siêu âm toàn bộ lá cỏ ngọt đã được thực hiện để chiết xuất steviosides, hiệu suất thu hồi đạt được 43,62% stevioside và 28,96% Rebaudioside

A [47] Zulkarnain (201 ) đã cho thấy sóng siêu âm cũng là kỹ thuật phù hợp để3trích ly Steviol glycosides từ hỗn hợp bột cỏ ngọt khô 1] [8 Theo đó, với mức điện năng 280W, năng suất trích ly Steviol glycosides tối ưu có thể đạt được trong thời gian chiết 30 phút ở nhiệt độ là 400 và tỷ lệ ethanol 80% (R2 = 0,992) Sử dụng sóng siêu ẩm kết hợp dung môi isopropyl thích hợp cho việc chiết Rebaudioside A

từ lá cỏ ngọt, hàm lượng Rebaudioside A thu được đạt 35,61 g/100g trong thời gian

xử lý là 18 phút, điện năng tiêu thụ là 360W [30]

Tuy nhiên, do khả năng xuyên sâu kém, hoạt động của sóng siêu âm chỉ giới hạn trong khu vực lân cận của đầu phát siêu âm nên việc sử dụng thường ở quy mô

phòng thí nghiệm Kỹ thuật này cũng tiêu tốn nhiều năng lượng, do đó việc nhân rộng quy trình sẽ không khả thi bởi vì các chi phí lớn liên quan đến việc sử dụng Khi sử dụng sóng siêu âm để hỗ trợ trích ly cần xem xét, tính toán và thiết kế công suất của đầu phát siêu âm với thể tích bể siêu âm cho phù hợp

1.3.3 Trích ly đường t c ừ ỏ ngọ ới sự ỗ trợ ủt v h c a vi sóng

Việc sử dụng vi sóng hỗ trợ việc trích ly vật liệu ở quy mô phòng thí nghiệm được áp dụng thay thế cho trích ly truyền thống (như trích ly bằng Soxhlet) do rút ngắn thời gian trích ly xuống còn từ vài chục giây tới 15-20 phút Chiếu xạ vi sóng vào môi trường có chứa vật liệu có kích thước nhỏ và dung môi phân cực, các phân

tử dung môi và các chất phân cực sẽ dao động và nóng lên nhanh chóng làm tăng khả năng hòa tan các chất vào dung môi Vi sóng cũng làm phá hủy cấu trúc vách tế bào thực vật, làm các chất tan giải phóng trực tiếp vào dung môi trích ly, làm cho quá trình trích ly chuyển thành hòa tan đơn giản Điều này làm cho việc trích ly nhanh hơn nhưng cũng làm dịch trích ly nhiều tạp chất hơn do đó cần có quy , trình loại tạp tiếp theo

Jaitak và cộng sự (2009) đã so sánh 3 phương pháp trích ly cỏ ngọt: trích ly lạnh thông thường được thực hiện ở 250C trong 12 giờ, trích ly bằng sóng siêu âm được thực hiện ở nhiệt độ 35±50C trong 30 phút và trích ly bằng lò vi sóng (MAE) được thực hiện ở mức công suất 80W trong 1 phút ở 50oC Kết quả cho thấy,

phương pháp MAE thu được stevioside và Rebaudioside Audioside-A có hàm lượng lớn nhất, tương ứng là 8,64 và 2,34% Trong khi với kỹ thuật thông thường

và siêu âm cho hàm lượng stevioside và Rebaudioside A thấp hơn, đạt 6,54 & 1,20% và 4,20 & 1,98%, tương ứng Điều này cho thấy MAE là phương pháp nhanh và hiệu quả để trích ly stevioside và Rebaudioside Audioside-A Lợi thế là chiết xuất và sàng lọc nhanh một số lượng lớn các mẫu S rebaudiana để đánh giá các loại nguyên liệu cỏ ngọt đã trồng [37]

1.3.4 Trích ly đường từ cỏ ngọt bằng dung môi

Trích ly bằng dung môi là kỹ thuật cổ điển nhất được biết đến Tùy theo từng loại vật chất trích ly mà chọn dung môi trích ly cho phù hợp Về nguyên tắc, để

trích ly các chất kém phân cực (chất béo, tinh dầu, carotenoid, các triterpen và steroide tự do ) thì phải sử dụng các dung môi kém phân cực Để trích ly các chất phân cực (các glycoside, các muối của alkaloid, các hợp chất polyphenol ) thì phải

sử dụng các dung môi phân cực Trên thực tế, cồn với các độ cồn khác nhau là dung môi hay được dùng Cồn có thể hòa tan được nhiều nhóm hoạt chất, không độc, rẻ tiền và dễ kiếm

Quá trình tách chiết STG theo phương pháp truyền thống được mô tả theo các bước giống nhau như của Phillip (1987) 1] Lá [6 Stevia được chiết xuất bằng nước nóng hoặc cồn Trong 1 số trường hợp, lá khô được xử lý trước bằng dung môi không phân cực như là chloroform hoặc hexan để loại bỏ dầu, lipid, chlorofyll

và các chất không phân cực Chất chiết sau đó được tách tạp hất và khử mầu bằng ccách kết tủa với muối hoặc kiềm và lọc qua than hoạt tính Dịch chiết sau đó được

cô đặc và hòa loãng lại trong cồn để kết tinh glycoside Các tinh thể được tạo thành chính là Stevioside tinh khiết

Sáng chế đầu tiên của Nhật Bản cũng đã đề cập đến công nghệ trích ly Stevioside từ Stevia Theo công nghệ này, chồi, nụ và lá cỏ ngọt được rửa sạch bằng nước, nấu sôi, sấy khô và được đem chiết theo phương thức cổ truyền như với chloroform để thu được Stevioside Markosyan (20 ) đã nghiên cứu và tách chiết 13được STG ở dạng tinh thể màu trắng hoặc vàng sáng, hòa tan trong nước và ethanol Các tinh thể này không mùi hoặc có mùi nhẹ đặc trưng Methanol được sử dụng trong hầu hết các quá trình trích ly và tinh chế Tuy nhiên methanol không an toàn cho người sử dụng 2][5 Phương pháp gần đây sử dụng hệ thống lọc nước mà không

sử dụng methanol để sản xuất sản phẩm thiên nhiên Nhà máy ở Brazil chỉ sử dụng nước để tách chiết STG và yêu cầu độ tinh khiết đạt 96 %, ví dụ như sản phẩm

“Stevia Crystal”

1.3.5 Trích ly STG từ cỏ ngọt bằng phương pháp enzyme

Các kỹ thuật trích ly hiện đại, chẳng hạn như trích l bằng chất lỏng áp lực y cao, trích ly bằng nước nóng áp lực hoặc hơi nóng, trích ly bằng chất lỏng siêu tới hạn và trích ly có sự trợ giúp của lò vi sóng đã được sử dụng để chiết xuất các hợp

chất hoạt tính sinh học 9][5 Tuy nhiên, các phương pháp này đều có mặt hạn chế và bất tiện như yêu cầu các thiết bị phức tạp, chịu áp và chi phí vận hành cao… Do đó, cần có một kỹ thuật mới sử dụng các tiếp cận công nghệ sinh học để sản xuất các STG từ cỏ ngọt, như trích ly bằng enzyme Puri và cộng sự (2012) đã xử lý lá cây stevia với các enzym phân huỷ tế bào để tạo ra hỗn hợp steviol-glycosides (2,84 mg/100mg lá) Nhóm tác giả đã nâng cao hiệu suất chiết Stevioside lên 3 lần bằng cách sử dụng hỗn hợp các enzyme xenlulaza, hemixenlulaza và pectinaza so với đối chứng không sử dụng enzyme [60] Trong khi đó, Abelyan, 2010 đã sử dụng enzyme Pectinex Ultra –SPL tỷ lệ 2 % so với khối lượng cỏ ban đầu để chiết xuất

cỏ ngọt nhằm tạo ra chế phẩm STG có thành phần là dulcoside 3,2 %; Stevioside 60,4 %; Rebaudioside A 25,7 % và RebC 5,7 % [10]

Gần đây nhất, nhóm tác giả Rao và cộng sự (2015) đã phát triển một phương pháp rất mới sử dụng enzyme trung gian (Enzymelà -Mediated Extraction, EME)để trích ly Stevioside từ lá cỏ ngọt Stevia Rebaudiana Bertoni Các lá cỏ stevia đã được tiền xử lý bằng enzym thủy phân có bổ sung thêm muối kim loại chuyển tiếp FeCl3 Sau đó, sử dụng phương pháp trích ly bằng nước nóng có áp suất cao (PHWE) để giải phóng stevioside Sau khi hoàn thành quá trình chiết xuất, dịch chiết xuất thô đã được cho qua sàng kích thước 63 μm, dịch lọc thu được sau đó đưaqua hệ thống tách màng tích hợp, gồm màng vi lọc (MF), màng lọc cực đại (UF) và màng lọc nano (NF), để thu hồi stevioside có độ tinh khiết mong muốn Kết quả nghiên cứu cho thấy, việc xử lý bằng enzyme cenlulase có bổ sung muối FeCl3 đã làm tăng hiệu suất thu hồi stevioside lên 72%, với độ tinh khiết 98%, cao hơn so với

sử dụng cenlulase thông thường [63]

Bảng 1 4 Tính chất hoạt động và các điều kiện tối ưu của các chế phẩm

enzyme thương mại được sử dụng để trích ly đường từ cỏ ngọt

Ultra L

Đan mạch Pectinex

Ultra SP-L

Đan mạch Cellulast

1.5L

Đan mạch Viscozyme L Pectinolytic,

hemicellulase, cellulase

Đan mạch Peclyve EP Polygalacturonase

Pectin methylesterase, Pectin lyase

Peclyve LI Polygalacturonase

Pectin methylesterase, Cellulase

45 4,0-5,0 Lyven, Pháp

1.4 KẾT TINH REBAUDIOSIDE A TỪ STG CỦA CỎ NGỌT

Rebaudioside A là một chất tan trong nước ít hơn so với trong các loại dung môi cồn như methanol, ethanol, propanol và n butanol , nhưng không tan trong các -loại dung môi ete, hexan, chloruaform [53] Rebaudioside A là chất có độ phân cực mạnh hơn Stevioside [58 ]

Dựa vào tính chất vật lý trên của Rebaudioside A, c 2 phương pháp để tách ó Rebaudioside A từ bột chiết STG của cỏ ngọt là kết tinh trực tiếp Rebaudioside A từ STG hoặc sử dụng dịch lọc từ STG sau khi đã tách Stevioside trước đó Ngoài ra, Rebaudioside A còn có thể được tách ra khỏi STG bằng một số phương pháp khác bằng cách sử dụng cột sắc ký, màng siêu lọc và các chất hấp thụ đặc hiệu

1.4.1 Kết tinh trực tiếp Rebaudioside A từ dịch Steviol glycoside của cỏ ngọt

Điểm qua các bằng sáng chế (Patent) và bài báo quốc tế mô tả những cố gắng nhằm sản xuất Rebaudioside A tinh khiết (>90%) từ dịch chiết hoặc bột chiết của lá cỏ ngọt cho thấy rất nhiều phương pháp sản xuất khác nhau yêu cầu sử dụng các loại dung môi hữu cơ và cột trao đổi ion hoặc nhựa, cũng như các loại màng siêu lọc đối với Rebaudioside A Nhưng chi phí cao để đáp ứng các yêu cầu trên làm hạn chế việc sử dụng các loại chất ngọt glycoside này trong công nghiệp thực phẩm, đồ uống…

Rebaudioside A hòa tan trong nước ít hơn so với trong các loại rượu ở điều kiện nhiệt độ thường Một số nghiên cứu cho thấy, Rebaudioside A lại bị kết tủa trong ethanol ở 11-120C [10], hoặc trong methanol và butanol ở nhiệt độ 20-250C [58] Tuy nhiên, Babcock (2010) đã thực hiện kết tinh Rebaudioside A trong ethanol ở nhiệt độ thường [14] Thông qua hiện tượng kết tinh có điều kiện, Rebaudioside A với độ tinh sạch khác nhau đã được thu nhận ở quy mô thí nghiệm cũng như thực nghiệm Nhiều patent trình bày việc thu nhận Rebaudioside A bằng cách kết tinh trực tiếp nhờ dung môi từ STG [10, 14, 36, 58], nhưng cũng có những patent khác thực hiện theo hướng ngược lại từ STG đã tách Stevioside trước đó [49, 57]

Kết tinh Rebaudioside A trực tiếp từ bột chiết STG của cỏ ngọt bằng cách sử dụng dung môi ethanol

Rebaudioside A Kết tinh khỏi dịch trích ly hoặc bột chiết STG của cỏ ngọt bằng dung môi ethanol đã từ lâu được thực hiện bởi Jackson (2006) [36], Jaitack (2009) [37], Abelyan (2010) [10], M omet (2011) 9] ag [4 cũng như của Babcock (2011) [14]… Nguyên tắc chung của các quy trình là hòa tan STG trong ethanol ở nhiệt độ cao (45-800C) và cho kết tủa Rebaudioside A ở nhiệt độ 20-220C, sau đó lọc, sấy và thu hồi tinh thể Rebaudioside A Trong một số trường hợp, STG ban đầu được hòa tan trong dung môi ethanol có nồng độ thấp, sau khi hòa tan hoàn toàn thì

bổ sung lượng ethanol tinh khiết còn lại cho phù hợp với tỷ lệ của nguyên liệu STG

so với dung môi [14] Ngoài ra, để nâng cao độ tinh khiết của tinh thể Rebaudioside

A thu được người ta đã sử dụng nhiều biện pháp khác nhau như: gia nhiệt hỗn hợp

nhiều lần trước khi cho kết tinh Rebaudioside A, bổ sung chất chống hòa tan vào hỗn hợp kết tủa, bổ sung mầm tinh thể Rebaudioside A, rửa kết tủa bằng dung môi, hoặc kết tinh lại trong dung môi

Kết tinh Rebaudioside A trực tiếp từ bột chiết STG của cỏ ngọt bằng cách sử dụng dung môi methanol và các dung môi khác

Trong một số ít quy trình đã được công bố, chủ yếu để lấy kết quả so sánh giữa các loại dung môi thì methanol đã được sử dụng ngay từ đầu thay cho ethanol

để thực hiện quá trình tách chiết Rebaudioside A khỏi bột chiết STG từ cỏ ngọt Liu(2011) đã tinh chế Rebaudioside A bằng cách cho hòa tan bột chiết STG vào methanol khan, khuấy đều ở 600C, sau đó, bổ sung thêm 12L axeton và khuấy đều trong 10 phút Tiếp theo, cho Rebaudioside A kết tinh ở nhiệt độ thường trong 24 h

để tạo ra các tinh thể hình kim, sau đó, lọc và sấy tinh thể Rebaudioside A ở 600C, ở điều kiện chân không Chế phẩm tinh thể thu được có hàm lượng Rebaudioside A là 83,7% [45] Babkock (2011) tinh chế Rebaudioside A từ Rebaudioside A thô theo các quy trình khác nhau phụ thuộc vào nồng độ của dung môi methanol được sử dụng để kết tinh Rebaudioside A từ bột chiết STG của cỏ ngọt có chứa hàm lượng Rebaudioside A ban đầu khác nhau Hàm lượng Rebaudioside A ban đầu trong bột chiết STG của cỏ ngọt càng thấp thì yêu cầu nồng độ dung môi methanol sử dụng cho quá trình kết tinh càng lớn Ví dụ như khi hàm lượng Rebaudioside A ban đầu của STG trước khi kết tinh là 42% thì nồng độ của dung môi ethanol được sử mdụng là 99% Trong khi đó, dung môi ethanol 85% được sử dụng để kết tinh mRebaudioside A khỏi bột STG có hàm lượng Rebaudioside A ban đầu là 62% [14] 1.4.2 Kết tinh Rebaudioside A từ STG của cỏ ngọt đã tách Stevioside

Nhiều công trình nghiên cứu đã tách Stevioside khỏi bột chiết STG của cỏ ngọt bằng phương pháp kết tinh trong methanol [14, 49, 57, 58] Dựa trên nguyên tắc chung là Stevioside có độ phân cực nhỏ, do đó ít tan trong methanol có độ phân cực lớn hơn Stevioside Dịch lọc STG thu được sau khi đã tách riêng kết tủa Stevioside thường được cô đặc và sấy nhờ sấy chân không hoặc sấy phun trước khi tiếp tục được xử lý để thu hồi Rebaudioside A tinh khiết Payzant (1999) đã cô đặc

chân không dịch lọc STG đã tách Stevioside có chứa methanol khan thành cao Hỗn hợp này sau đó được làm lạnh tới 00C, để qua đêm khoảng thời gian 16h Kết tủa tạo thành được lọc bằng cách lắc và rửa với một lượng nhỏ methanol lạnh, và được sấy khô tới khối lượng khô đổi có chứa 1,3 % Dulcoside; 79 % Rebaudioside A; 15,1 % RebC, và 4,7 % Stevioside Thao tác tinh sạch bổ sung của Rebaudioside A thu được ở trên có thể được thực hiện bằng kết tinh lại Rebaudioside A trong methanol để tạo Rebaudioside A có độ tinh sạch lớn hơn 95% [57] Magomet (2011), sau khi thu hồi dịch lọc STG, đã tách Stevioside bằng phương pháp kết tinh trong methanol đã cho kết tinh Rebaudioside A liên tiếp hai lần bằng ethanol 96,2%

và 92% ở 11-120C, tương ứng, mà không sử dụng methanol giống như Payzant (1999) Chế phẩm Rebaudioside A thu được có độ tinh khiết lớn hơn 98% [49, 57]

1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CỎ NGỌT TẠI VIỆT NAM

Ở Việt Nam, từ năm 1993 đến 1999 đã có một số nghiên cứu về việc chiết tách đường từ cỏ ngọt nhưng chỉ dừng lại ở nghiên cứu thử nghiệm Nhưng ngày nay, khi mà tình hình mắc bệnh tiểu đường đang tăng nhanh thì việc nghiên cứu và sản xuất ra một loại đường thay thế đường mía là rất đáng quan tâm Cỏ ngọt đã được xác định sơ bộ về thành phần hóa học ở Viện dược liệu và thử tác dụng lâm sàng dạng chè thuốc từ lá cây cỏ ngọt ở Viện Y học Cổ truyền Hà Nội Các nghiên cứu của Nguyễn Thanh Hồng, Nguyễn Thị Minh Viện Hóa học Thành phố Hồ Chí Minh cũng đã xác định được tổng lượng glucoside trong lá cỏ ngọt trồng ở Lâm Đồng là 9,43%, trong đó có 2,71 % là Stevioside Năm 2001, Nguyễn Kim Cẩn và

Lê Nguyệt Nga đã định lượng Stevioside trong lá cỏ ngọt khô là từ 3% đến 6% [1] Quy trình chiết tách Steviol glycoside bằng dung môi nước, sau đó trích ly lại bằng n-butanol đã được Phạm Thành Lộc và Lê Ngọc Thạch (2009) sử dụng tại Việt Nam thể hiện ở hình 1.4 Nhóm tác giả đã xác định được hàm lượng Stevioside trong lá cỏ ngọt khô là 3,38% [8]

Năm 201 , Trương Hương Lan và cộng sự đã xác định hàm lượng STG, 3Stevioside và Rebaudioside A trong lá của một số giống cỏ ngọt khác nhau trồng tại Việt Nam là SV1, S22, S77 và S99, cùng với lá khô của 1 giống cỏ ngọt HQ của

Hàn Quốc Theo kết quả này, giống cỏ ngọt S77 của Việt Nam cho hàm lượng đường Rebaudioside A và STG lớn nhất, tương ứng đạt 9,32 % và 11,53 % [5] Từ giống S77, nhóm tác giả đã thực hiện quá trình trích ly cỏ ngọt bằng nước có sử dụng enzyme pectinase để nâng cao hiệu suất trích ly Steviol glycoside, và tạo ra các chế phẩm Steviol glycoside 80% và Rebaudioside A 80% [6]

Năm 2015, Nguyễn Quốc Cường và Nguyễn Tấn Lê đã đưa vào trồng thử nghiệm giống cỏ ngọt ST88 tại huyện Hòa Vang, TP Đà Nẵng Bước đầu đánh giá cây cỏ ngọt ở giai đoạn thu hoạch đầu tiên (30 ngày tuổi) cũng cho hàm lượng đường stevioside khá tốt (7,1%) [3] Cũng trong năm này, tác giả Tôn Nữ Liên Hương và cộng sự tại Khoa Khoa học Tự nhiên, Đại học Cần Thơ đã nghiên cứu chiết xuất stevioside từ cây cỏ ngọt trồng tại thành phố Đà Lạt Kết quả cho thấy hiệu quả của nước nóng (650C) trong việc thu nhận cao thô chứa các đường có vị ngọt, hiệu suất thu được là 22,67% Nhóm tác giả đã so sánh 2 phương pháp tinh chế thu nhận Stevioside bằng sắc ký cột pha thường silicagel 60 và phương pháp lọc với chất hấp thụ celite Kết quả đã chỉ ra, quy trình tinh chế stevioside bằng sắc ký cột đạt hiệu suất 0,13%, kém hiệu quả hơn quy trình tinh chế stevioside bằng acid hóa với acid citric, lọc qua cột celite rồi đưa về pH = 7, với hiệu suất tinh chế là 1,28% [4]

Nhìn chung, có thể thấy độ tinh khiết của các chế phẩm đường thu nhận được tại Việt Nam vẫn còn thấp, trong khi thế giới đã sử dụng các chế phẩm đường từ cỏ ngọt với độ tinh khiết hơn 95% Trong luận văn này, hướng nghiên cứu của đề tài là khảo sát thêm một số giống cỏ ngọt mới cho hàm lượng đường cao, đồng thời nâng cao độ tinh sạch của đường Rebaudioside A từ cỏ ngọt lên hơn 90%

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ

- Chất chuẩn Stevioside và Rebaudioside A ,9 (Sigma 99 % – Đức)

- Các loại chế phẩm enzyme được cung cấp bởi Công ty Brentag tại Việt Nam: + Chế phẩm enzyme Pectinex Ultra SP-L (№vozyme – Đan Mạch): được sản xuất

từ nấm mốc Aspergillus chứa enzyme polygalacturonase, có hoạt tính 9.500 PGNU/ml, nhiệt độ hoạt động tối ưu 550C, pH 4,5

+ Chế phẩm enzyme Cellulast 1.5L (№vozyme – Đan Mạch) chứa enzyme cellulase, có hoạt tính 700 EGU/g, nhiệt độ hoạt động tối ưu 500C, pH 4

+ Chế phẩm enzyme Viscozyme L (№vozyme – Đan Mạch) chứa hỗn hợp enzyme arabanase, cellulase, -glucanase, hemicellulase và xylanase, β hoạt độ 100 FBG/g, nhiệt độ hoạt động tối ưu 500C, p 4,5 H

- Các hóa chất chính: FeCl3 và Ca(OH)2, ethanol và methanol (AR – Trung Quốc)

2.1.3 Thiết bị

- Các thiết bị phân tích: Máy đo pH ORION Model 410 A (Đức) hiết quang kế ; c

Milwauke (Phần Lan), cân phân tích AND GR-200 (Nhật Bản) máy đo quang phổ , UV-VIS Halo DB-200 (Pháp), hệ thống sắc ký lỏng cao áp HPLC ALLIANCE (Nhật Bản)

- Các thiết bị công nghệ:

+ Bình ổn nhiệt, máy khuấy đũa, máy khuấy từ IKA (Đức);Tủ sấy, tủ ấm, tủ lạnh SANYO (Nhật Bản); Máy voltex ZX3 (Italia); Máy lắc SI600 (Hàn Quốc)

+ Máy li tâm Sorvall RC6 (Đức); Máy cô chân không Buchi 1L và 20L (Thụy Sỹ) + Máy lọc khung bản (Đức).

+ Hệ thống cột trao đổi ion quy mô thí nghiệm (nhựa PVC) Việt Nam

+ Máy sấy phun UMATO, GB22 (Nhật), máy sấy chân không Shel lab (Mỹ)

- Các dụng cụ thí nghiệm khác: Bình tam giác, cốc đong, sinh hàn, bình định mức, ống nghiệm, đũa thủy tinh, giấy lọc (Đức), phễu thủy tinh, pipet, nhiệt kế

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1.Phương pháp công nghệ: Quy trình chiết tách STG từ lá cỏ ngọt dự kiến theo hình 2.1

Hình 2.1 Quy trình chiết tách STG từ lá cỏ ngọt dự kiến [10]

Lọc tinh

Nghiền Hòa trong dung môi

Tinh chế