CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2. NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP TRÍCH LY VÀ THU NHẬN STG
3.2.1. Nghiên cứu xác định dung môi trích ly phù hợp
Trong quá trình trích ly STG, việc lựa chọn được loại dung môi phù hợp là rất quan trọng, sao cho vừa đảm bảo được hiệu quả trích ly và hiệu quả kinh tế, cũng như đảm bảo yêu cầu an toàn thực phẩm. Dịch chiết STG không chỉ chứa một lượng STG mà còn chứa rất nhiều hợp chất hòa tan khác nhau như cellulose, protein, glucid và lipid, cũng như các chất mầu hữu cơ… Có nhiều loại dung môi được dùng để chiết STG từ cỏ ngọt như nước, methanol, ethanol, hệ dung môi... nên cần phải nghiên cứu. Tiến hành trích ly STG từ cỏ ngọt S. Rebaudiana KST01 với các loại dung môi nước, ethanol, methanol hệ dung môi , ethanol 80% và methanol 80% được thực hiện theo chương 2, mục 2.2.1.1.
Kết quả được trình bày ở hình 3.1 cho thấy cả hai trường hợp sử dụng hệ dung môi ethanol 80% và methanol 80% đều cho hiệu suất trích ly cao hơn so với việc sử dụng các loại dung môi nguyên chất. Sử dụng hệ dung môi methanol 80%
đồng thời cho cả hiệu suất trích ly chất khô và STG cao nhất, đạt 33,77 % và 65,80%, tương ứng. Tiếp theo là dung môi methanol cho hiệu suất trích ly chất khô và STG là 31, % và 59,60 13 %, tương ứng. Trong khi đó, phân tích thống kê bằng phần mềm SPSS 18 cũng chỉ ra, sử dụng dung môi nước và hệ dung môi ethanol 80% không có sự khác nhau về kết quả hiệu suất trích ly chất khô cũng như STG (với mức ý nghĩa p = 0,139 > 0,05). Sử dụng dung môi ethanol riêng lẻ cho hiệu suất trích ly STG thấp nhất ng tro quá trình trích ly cỏ ngọt, chỉ đạt 43,97%.
Hình 3.1. So sánh hiệu quả của các dung môi sử dụng cho trích ly cỏ ngọt ethanol
Hệ dung môi m cũng được biết đến là dung môi trích ly hiệu quả STG từ lá cỏ ngọt [40], nhưng vì lý do an toàn thực phẩm, chúng tôi lựa chọn dung môi là nước để trích ly cỏ ngọt mà không dùng methanol. Điều này cũng phù hợp với nhiều nghiên cứu gần đây của Abelyan và cộng sự (2010) [10]; Markosyan (2013) [52]; Tôn Nữ Liên Hương và cộng sự (2015) [4] khi đều lựa chọn nước là dung môi trích ly STG.
Do đó, nước đã được lựa chọn là dung môi để trích ly STG từ cỏ ngọt trong các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2. Nghiên cứu sử dụng enzyme trong quá trình trích ly STG từ cỏ ngọt 3.2.2.1. Nghiên cứu lựa chọn loại enzyme thích hợp cho quá trình trích ly STG từ cỏ ngọt
Các nghiên cứu đều chỉ ra, cấu trúc của thành tế bào bao gồm bộ khung cellulose và mạng lưới pectin đan xen, tạo ra một cấu trúc vững chắc. Trong đó, cellulose là các polymer mạch thẳng của các liên kết β-1,4 glucose và các hemicelluose như là các xyloglucan và xylan. Khi sử dụng enzyme cho quá trình trích ly STG từ cỏ ngọt, mỗi loại enzym có hoạt độ khác nhau và thường tham gia xúc tác đặc trưng cho một loại cơ chất nào đó. Nhiệm vụ đặt ra là xác định một enzym thích hợp để trích ly STG từ cỏ ngọt đạt được hiệu suất cao nhất. Các loại chế phẩm enzym sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm: Pectinex Ultra SP-L, Cellulast 1.5L và Viscozyme L của hãng Novo (Đan Mạch) được bổ sung với tỷ lệ % so với khối 1 lượng cỏ ngọt (v/w). Tiến hành các thí nghiệm được mô tả trong mục 2.2. 2, kết quả 1.
hiệu suất trích ly chất khô và STG được minh họa trong hình 3.2.
Hình 3.2. Ảnh hưởng của loại enzyme đến quá trình trích ly STG từ cỏ ngọt Kết quả thu được ở hình 3.2 cho thấy, tất cả các mẫu được xử lý bằng enzyme đều cho hiệu suất trích ly chất khô và hiệu suất trích ly STG cao hơn đáng
kể so với mẫu đối chứng không xử lý enzyme. Hiệu suất chất khô cao nhất đạt giá trị là 36,37% khi sử dụng chế phẩm enzyme Pectinex Ultra SP-L, cao hơn nhiều so với mẫu đối chứng không bổ sung enzyme là 28,34% và cao hơn 2 mẫu bổ sung chế phẩm enzyme Cellulast 1.5L, Viscozyme L, tương ứng là 31,58% và 31,70%. Hình 3.2 cũng cho thấy hiệu suất trích ly STG đạt giá trị cao nhất đối với mẫu bổ sung enzym Pectinex Ultra SP-L là 66,32%, cao hơn 26 % so với mẫu đối chứng,5 . Các giá trị này giảm dần đối với mẫu bổ sung enzym Cellulast 1.5L và Viscozyme L, tương ứng là 61,53%; và 60,85%. Điều này được giải thích do Pectinex Ultra SP-L là enzyme pectinase có khả năng xúc tác thủy phân ngẫu nhiên các liên kết hóa học trong chuỗi pectin, phá vỡ liên kết 1,4- -D- galactosiduronic, phá vỡ khung tế bào, giải phóng các phân tử đường trong nguyên liệu cỏ ngọt đã xay nhỏ với tốc độ nhanh hơn, thu được hiệu suất trích ly chất khô và hiệu suất trích ly STG lớn hơn so với chế phẩm Cellulast 1.5L có hoạt tính phân giải cellulose nhờ enzyme cellulase.
Kết quả, STG sẽ được trích ly một cách dễ dàng vào nước từ mẫu cỏ ngọt được xử lý bằng Pectinex Ultra SP-L hơn là mẫu được xử lý với Cellulast 1.5L. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng tương tự như nghiên cứu của Abelyan và cộng sự (2010) [10].
Nghiên cứu trước đây của Choudhari và Ananthanaraya (2007) cũng báo cáo rằng, việc sử dụng enzyme pectinase cho quá trình xử lý cà chua nguyên quả đã làm tăng hiệu quả trích ly Lycopene hơn so với sử dụng enzyme cellulase [24].
Trong khi đó, một nghiên cứu khác của Shahidi (2012) ại cho thấy hiệu quả l của enzyme Cellulase trong trích ly Stevioside từ cỏ ngọt, hàm lượng Stevioside cao nhất thu được là là 16.230 ± 0,3àg/ml ở 400C [69]. Puri và cộng sự (2012) thu được hàm lượng stevioside cao nhất là 369,23àg khi sử dụng enzyme Hemicellulase, trong khi hàm lượng Stevioside khi sử dụng enzyme Cellulase và Pectinase Ultra SP-L chỉ đạt 359 àg và 333 àg, tương ứng [60].
Từ những nghiên cứu trên, chúng tôi chọn enzyme Pectinex Ultra SP-L cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.1.2. Nghiên cứu tỉ lệ nguyên liệu /nước cho quá trình trích ly STG từ cỏ ngọt Tỉ lệ nguyên liệu/ thể tích dung môi ảnh hưởng lớn đến khả năng hòa tan của STG. Nếu tỉ lệ nước quá thấp, hiệu quả hòa tan kém không trích ly được hết STG ra khỏi cỏ ngọt. hưng nếu lượng nước ban đầu đưa vào quá nhiều, một mặt sẽ trích N ly cả những hợp chất không phải là STG, mặt khác còn gây tốn kém năng lượng cho các quá trình trích ly và thu hồi STG 2][5 . Do vậy, việc nghiên cứu tỉ lệ khối lượng cơ chất dung môi là rất quan trọng để trích ly tối đa hàm lượng STG trong lá cỏ / ngọt đồng thời đạt hiệu quả kinh tế. iến hành 6 mẫu thí nghiệm với tỉ lệ khối lượng T mẫu lá cỏ ngọt khô/thể tích nước khác nhau là 1/3; 1/5; 1/7; 1/9; 1/11 và 1/13 trong cùng điều kiện trích ly như đã được mô tả ở mục 2.2.1.2.
Hình 3.3. Ảnh hưởng tỉ lệ nguyên liệu/nước đến hiệu suất trích ly chất khô từ cỏ ngọt
3 ,
Từ kết quả ở hình 3. cho thấy hiệu suất trích ly chất khô và hiệu suất trích ly STG tăng dần theo tỉ lệ nguyên liệu/nướ . Với tỉ lệ 1/3 cho hiệu suất trích ly chất c khô và hiệu suất trích ly STG thấp nhất, chỉ đạt 17,25% và 42,26%, tương ứng.
Hiệu suất trích ly STG có xu hướng gia tăng nhanh khi tăng tỷ lệ nguyên liệu/nước từ 1/3 lên tỷ lệ 1/ , từ 42,26% lên 79 3,46 %. Tuy nhiên, tăng tỷ lệ nguyên liệu/nước lên 1/11 và 1/13, hiệu suất trích ly STG tăng lên không đáng kể, chỉ đạt 73,83 và 74,02%, tương ứng. Trong khi, ở tỉ lệ 1/11 vẫn cho hiệu suất trích chất khô cao là 43,06%, và tăng lên 44,19% khi tăng tỉ lệ đến 1/13. Rõ ràng, có thể thấy, với tỉ lệ
nước cao lượng nước đưa vào nhiều sẽ trích ly cả chất hòa tan không phải là STG, , lại gây tốn năng lượng cho công đoạn xử lý về sau. Trong Patent US 7.838.044 B2, Abelyan và cộng sự (2010) cũng lựa chọn tỉ lệ nguyên liệu/nước là 1/10 cho nghiên cứu của mình [10].
Do vậy, để đảm bảo hiệu quả kinh tế mà vẫn thu được hiệu suất trích ly STG cao, chúng tôi lựa chọn tỷ nguyên liệu/nước là 1/9 cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.2.3. Nghiên cứu tốc độ khuấy thích hợp cho quá trình trích ly STG từ cỏ ngọt Quá trình khuấy trộn sẽ làm tăng bề mặt tiếp xúc của nguyên liệu với nước, qua đó làm tăng khả năng hòa tan STG và các chất tan vào dịch trích ly. Trong nghiên cứu này, tiến hành thay đổi tốc độ khuấy từ 50 đến 250 vòng/phút, có đối chứng (không khuấy) và xác định ảnh hưởng của tốc độ khuấy tới hiệu suất trích ly.
Kết quả được thể hiện trên bảng 3.3.
Bảng 3.3.Ảnh hưởng của tốc độ khuấy đến hiệu suất trích ly cỏ ngọt Tốc độ khuấy
(vòng/phút)
Hiệu suất trích ly chất khô1 (%)
Hiệu suất trích ly STG2 (%)
0 (Đối chứng) 26,30a ± 0,26 57,37a ± 0,15
50 31,17b ± 0,12 61,67b ± 0,15
100 35,23c 0,06 ± 65,60c ± 0,10
150 39,40d 0,30 ± 70,13d ± 0,12
200 41,37e ± 0,12 73,57e 0,15 ±
250 42,03f ± 0, 21 74,23f ± 0,45
300 42,27f ± 0,21 74,37f 0,21 ±
1, 2: Giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, n=3.
Các số với các chữ khác nhau thì khác nhau ở mức ý nghĩa 0,05
Bảng 3.3 cho thấy thí nghiệm khi tăng tốc độ khuấy lên từ 50, -300 vòng/phút, hiệu suất trích ly chất khô và STG đều tăng lên, cao hơn so với mẫu đối chứng từ 18,5 -60,6% và 7,7-29,7%, tương ứng Ở tốc độ 300 vòng/phút, hiệu suất . trích ly chất khô đạt được cao nhất là 42,27,35 ± 0,21% và hiệu suất trích ly STG cũng đạt cao nhất là 74,37± 0,21%. Tuy nhiên, kết quả phân tích thống kê bằng
phần mềm SPSS 18 cũng cho thấy, không có sự khác biệt về hiệu suất trích ly chất khô và hiệu suất trích ly STG khi tốc độ khuấy tăng lên 250-300 vòng/ phút (phụ lục 2, p = 0,799 và 0,984, tương ứng)
Do vậy, để tiết kiệm năng lượng và thu được hiệu suất trích ly STG cao là 74,23 ± 0,45%, hiệu suất trích ly chất khô đạt 42,03 ± 0,21%, chọn tốc độ khuấy 250 vòng/phút.
3.2.2.4. Nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ enzyme bổ sung thích hợp cho quá trình trích ly STG từ cỏ ngọt
Phản ứng enzyme là một phản ứng thuận nghịch, nó phụ thuộc nhiều yếu tố, trong đó tỷ lệ của enzyme so với cơ chất có ảnh hưởng đặc biệt tới khả năng phân giải cơ chất của enzyme. Để tìm được tỉ lệ enzyme Pectinex Ultra SP-L thích hợp cho quá trình trích ly STG từ cỏ ngọt là việc làm hết sức cần thiết, cho phép sử dụng enzyme một cách hiệu quả. Tiến hành khảo sát các tỉ lệ enzyme khác nhau là 0,5%, 1%; 1,0%; 1,5%; 2%, 2,5% và 3%. Kết quả thu được ở hình 3.4 cho thấy khi tỉ lệ enzyme ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất trích ly.
Hình 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến hiệu suất trích ly từ cỏ ngọt Nhìn chung, enzyme làm tăng hiệu qủa trích ly nhờ khả năng phá vỡ tế bào thực vật. Tuy nhiên, tỉ lệ enzyme bổ sung quá thấp hoặc quá cao đều ảnh hưởng
không có lợi tới hiệu quả của quá trình trích ly STG. Ở tỉ lệ enzyme thấp (0,5%) thì hiệu suất trích ly chất khô thu được rất thấp 31,8 %, hiệu suất trích ly STG cũng chỉ đạt 64,57%. Ở tỉ lệ enzyme cao nhất (3%), hiệu suất trích ly STG là 74,02%, thấp hơn so với khi nồng độ enzyme là 2,5% (đạt 76,83%). Điều này có thể giải thích, tỷ lệ enzyme bổ sung quá nhỏ khiến cho không có đủ lượng enzyme để tham gia xúc tác phân giải cơ chất có trong nguyên liệu cỏ ngọt. Trong khi, tỷ lệ enzyme bổ sung quá lớn lại có thể xúc tác cho quá trình phân giải cơ chất diễn ra quá nhanh, chính những sản phẩm của quá trình thủy phân có xu hướng ức chế hoạt động của enzyme. Ở tỉ lệ enzyme 2%, hiệu suất trích ly STG và hiệu suất trích ly chất khô đạt được cao nhất là 78,45 và 45,63%, tương ứng.
Ngoài ra, chúng tôi còn nhận thấy rằng tốc độ lọc dịch trích ly trong các mẫu có sử dụng enzym tăng lên đáng kể so với đối chứng không sử dụng enzyme. Hiện tượng này trùng hợp với các phát hiện của Puri (2012) và Abelyan (2010) khi sử dụng enzym Pectinex Ultra SP L để trích ly cỏ ngọt- [10, 60].
Do vậy, qua nghiên cứu này, lựa chọn được tỷ lệ chế phẩm enzyme Pectinex Ultra SP-L bổ sung bằng 2%, cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.2.5. Nghiên cứu lựa chọn pH thích hợp cho quá trình trích ly STG từ cỏ ngọt pH môi trường thường ảnh hưởng đến độ bền của enzyme, hoạt tính của enzyme, chính vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnh đến phản ứng của enzyme. Nhiều enzyme hoạt động rất mạnh của ở pH trung tính. Tuy nhiên cũng có nhiều enzyme hoạt động ở pH acid yếu. Một số loại khác lại hoạt động mạnh ở pH kiềm và pH acid. Mỗi enzyme chỉ hoạt động mạnh ở pH xác định gọi là pH hoạt động tối thích của enzyme. Vì vậy để nghiên cứu xác định độ pH thích hợp cho quá trình trích ly chúng tôi tiến hành các thí nghiệm với độ pH khác nhau từ 3-7,5. Kết quả thu được trong hình 3.5.
Hình 3.5. Ảnh hưởng của pH đến quá trình trích ly STG từ cỏ ngọt
Hình 3.5 cho thấy hiệu quả của việc trích ly các chất ngọt bị ảnh hưởng rất lớn bởi pH. Khi pH tăng dần từ 3 đến 7,5 thì hiệu suất trích ly STG tăng lên, đạt cao nhất ở pH = 5 là 82,64,0 % sau đó lại giảm dần và có xu hướng giảm mạnh khi tiến sang môi trường kiềm. Hiệu suất trích ly chất khô cũng đạt được cao nhất ở pH = 5,0 là 45,63%. Điều này có thể được giải thích là do giá trị pH quá cao hoặc quá thấp đều không thích hợp cho hoạt động của các enzyme được sử dụng trong nghiên cứu này. Các enzyme Pectinase có nguồn gốc từ nấm sợi, thường hoạt động mạnh ở pH từ 3-5 (catalogues, №Vozyme). Kết quả nghiên cứu của Markosyan (2013) còn cho thấy, quá trình trích ly cỏ ngọt ở pH=5,0 7,0 thu được hàm lượng Rebaudioside - A cao hơn ở vùng pH kiềm 2][5 . Kết quả này rất phù hợp với mục tiêu của đề tài là thu nhận STG cũng như Rebaudioside A cao.
Do vậy, điều chỉnh pH của nguyên liệu về 5,0 là thích hợp nhất cho quá trình quá trình trích ly cỏ ngọt bằng enzyme Pectinex Ultra SP-L.
3.2.2.6. Nghiên cứu lựa chọn nhiệt độ thích hợp đến quá trình trích ly STG từ cỏ ngọt
Nhiệt độ là một yếu tố rất quan trọng ảnh hưởng đến quá trình trích ly. Nhiệt độ càng lớn thì tốc độ khuyếch tán các chất tan vào trong dung môi càng cao. Nó ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng của enzyme. Vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác
tăng theo chiều tăng của nhiệt độ trong một giới hạn xác định. Khi vượt quá giới hạn này thì vận tốc phản ứng được xúc tác bởi enzyme bị giảm. Với dung môi có sử dụng enzyme, cần thiết lựa chọn nhiệt độ tối ưu để tạo điều kiện cho enzyme có hoạt tính tốt nhất. Khảo sát quá trình trích ly ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau, kết quả được trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4.Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình trích ly STG từ cỏ ngọt Nhiệt độ (0C) Hiệu suất trích ly STG1 (%) Hiệu suất trích ly chất khô2 (%)
32 49,40a ± 0,36 18,37a ± 0,15
35 55,13b ± 0,15 22,33b ± 0,25
38 62,17c ± 0,5 24,17c ± 0,5
40 77,63e ± 0,25 28,46d ± 0,31
42 79,23f ± 0,45 31,37e ± 0,32
45 82,57g ± 0,31 35,50f ± 0,44
48 83,67h ± 0,45 39,33g ± 0,31
50 86,23i ± 0,15 42,43h ± 0,21
52 88,73k ± 0,21 48,40i ± 0,26
55 85,40i ± 0,26 49,33k ± 0,21
58 80,73k ± 0,15 50,40l ± 0,20
60 74,97d ± 0,25 51,77m ± 0,15
1,2: Giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, n=3.
Các số với các chữ khác nhau thì khác nhau ở mức ý nghĩa 0,05
B ng 3.4 cho th y, hi u suả ấ ệ ất trích ly đạt giá tr cao nhị ất ở nhiệt độ 520C là 88,73 ± 0,21%. Nhiệt độ cao hơn không làm tăng hàm lượng STG được trích ly mà trái l i còn làm gi m d n, do enzyme b b t ho t. V i mạ ả ầ ị ấ ạ ớ ục đích nâng cao hiệu suất trích ly STG từ ỏ c ng t, chúng tôi lọ ựa chọn nhiệ ột đ trích ly thích h p là 52ợ 0C.
Do v y, t các k t qu ậ ừ ế ả thu được ở trên, l a ch n nhiự ọ ệt độ 520C để ử x lý nguyên li u c ng t trong các thí nghi m ti p theo. ệ ỏ ọ ệ ế
3.2.2.7. Nghiên cứu lựa chọn thời gian thích hợp đến quá trình trích ly STG từ cỏ ngọt
Thời gian tác động đến quá trình trích ly ở phương diện hiệu suất và chất lượng dịch thu được vì nếu kéo dài thời gian sẽ tăng tỉ lệ các chất khuyếch tán vào , dịch chiết. Tuy nhiên, việc trích ly ở nhiệt độ 520C trong thời gian kéo dài sẽ đòi hỏi lượng năng lượng cao hơn, do đó làm tăng chi phí cho quá trình trích ly. Khảo sát tác động của thời gian đến quá trình trích ly trong các khoảng thời gian từ 30 phút đến 240 phút.
Hình 3.6. Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình trích ly STG từ cỏ ngọt 6
Kết quả thu được theo hình 3. cho thấy hiệu suất trích ly STG tăng dần theo thời gian, đạt giá trị cao hơn 92,13% sau 120 phút. Tuy nhiên, sự chênh lệch về hiệu suất trích ly STG khi thời gian kéo dài từ 120 đến 240 phút không có ý nghĩa thống kê (p=0,266 > 0,05, phụ lục 2). Puri và cộng sự (2012) đã quan sát thấy hiệu quả trích ly stevioside bằng enzyme Pectinase đạt cao nhất ở 450C trong 1 giờ [60].
Trong khi Abelyan (2010) lại xử lý enzyme Pectinex Ultra SP L ở 60- 0C trong 5 giờ [10]. Nhìn chung, việc sử dụng enzyme thủy phân đã làm giảm thời gian trích ly các hợp chất STG hơn so với các phương pháp trích ly bằng dung môi thông thường, có thể lên tới 12 giờ [37].
Do vậy, với mục đích đạt hiệu suất trích ly cao, tiết kiệm thời gian, chúng tôi lựa chọn thời gian trích ly tối ưu là 120 phút cho nghiên cứu này.