Đường từ cỏ ngọt thường được trích ly bằng các dung môi hữu cơ. Thêm vào đó, một vài nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng, đường có thể được trích ly bằng cách sử dụng một số phương pháp ưu việt khác như: trích ly có sự hỗ trợ của sóng siêu âm; quá trình trích ly với sự hỗ trợ của vi sóng, trích ly bằng phương pháp lỏng siêu tới hạn, phương pháp trích ly có sự hỗ trợ của enzyme.
1.3.1. Trích ly đường cỏ ngọ có sự hỗ trợ của COt 2siêu tới hạn
Công nghệ trích ly sử dụng CO2 siêu tới hạn đã được ứng dụng ở nhiều quốc gia. CO2 lỏng được sử dụng như một dung môi, và có thể gia nhiệt hoặc gia tăng áp suất để hỗ trợ quá trình trích ly. Tại Ấn Độ, công nghệ này dùng để trích ly tinh chất trong gia vị và thảo dược; tại New Zealand, Ba Lan ứng dụng trên hoa hublông và thảo dược; tại Tây Ba Nha ứng dụng để xử lý nút bần rượu vang nhằm tạo ra sản phẩm không mùi, không ảnh hưởng đến rượu; tại Đức, Ý ứng dụng để loại caffein
trong trà, cà phê; tại Đài Loan dùng để xử lý thuốc trừ sâu trong gạo cho sản phẩm gạo “sạch”; tại Hàn Quốc ứng dụng để sản xuất dầu mè…
Sử dụng CO2 siêu tới hạn (SCD) là một phương pháp tốt để trích ly đường từ cỏ. Tan (1988) đã được cấp bằng sáng chế của Nhật Bản cho việc sản xuất các STG bằng cách chiết xuất theo phương pháp trích ly lỏng siêu tới hạn bằng CO2 và 1 chất dung môi (methanol hoặc ethanol hoặc acetone) 3][7 . Giai đoạn tinh chế được thực hiện bằng cách cho hấp thụ các tạp chất lên các cột nhựa trao đổi ion. Ở Mỹ, Kienle (1992) cũng được cấp bằng sáng chế tương tự [41]. Một trong những nhược điểm của phương pháp trích ly bằng CO2 siêu tới hạn đó là khả năng phân cực yếu của CO2 lỏng siêu tới hạn ở các điều kiện trích ly thông thường và có thể hình thành một vài dạng liên kết dung môi chất tan đặc biệt. Việc thêm một lượng nhỏ các - dung môi phân cực như methanol, ethanol, nước, methylene chloride hay hexan…
để thay đổi tính phân cực giúp tăng khả năng trích ly của dung môi CO2. 1.3.2. Trích ly đường cỏ ngọt có sự hỗ trợ của sóng siêu âm (UAE)
Trong quá trình trích ly, đôi khi sóng siêu âm cũng được áp dụng để tăng hiệu quả trích ly. Sóng siêu âm với cường độ cao(20-42 kHz) thường được sử dụng để phá vỡ cấu trúc tế bào, làm tăng sự hòa tan của chất tan vào dung môi và tăng quá trình khuyếch tán chất tan, thúc đẩy quá trình trích ly.
Việc sử dụng sóng siêu âm toàn bộ lá cỏ ngọt đã được thực hiện để chiết xuất steviosides, hiệu suất thu hồi đạt được 43,62% stevioside và 28,96% Rebaudioside A [47]. Zulkarnain (201 ) 3 đã cho thấy sóng siêu âm cũng là kỹ thuật phù hợp để trích ly Steviol glycosides từ hỗn hợp bột cỏ ngọt khô 1]. [8 Theo đó, với mức điện năng 280W, năng suất trích ly Steviol glycosides tối ưu có thể đạt được trong thời gian chiết 30 phút ở nhiệt độ là 400 và tỷ lệ ethanol 80% (R2 = 0,992) Sử dụng . sóng siêu ẩm kết hợp dung môi isopropyl thích hợp cho việc chiết Rebaudioside A từ lá cỏ ngọt, hàm lượng Rebaudioside A thu được đạt 35,61 g/100g trong thời gian xử lý là 18 phút, điện năng tiêu thụ là 360W [30].
Tuy nhiên, do khả năng xuyên sâu kém, hoạt động của sóng siêu âm chỉ giới hạn trong khu vực lân cận của đầu phát siêu âm nên việc sử dụng thường ở quy mô
phòng thí nghiệm. Kỹ thuật này cũng tiêu tốn nhiều năng lượng, do đó việc nhân rộng quy trình sẽ không khả thi bởi vì các chi phí lớn liên quan đến việc sử dụng.
Khi sử dụng sóng siêu âm để hỗ trợ trích ly cần xem xét, tính toán và thiết kế công suất của đầu phát siêu âm với thể tích bể siêu âm cho phù hợp.
1.3.3. Trích ly đường t c ừ ỏngọ ới sự ỗt v h trợ ủ c a vi sóng
Việc sử dụng vi sóng hỗ trợ việc trích ly vật liệu ở quy mô phòng thí nghiệm được áp dụng thay thế cho trích ly truyền thống (như trích ly bằng Soxhlet) do rút ngắn thời gian trích ly xuống còn từ vài chục giây tới 15-20 phút. Chiếu xạ vi sóng vào môi trường có chứa vật liệu có kích thước nhỏ và dung môi phân cực, các phân tử dung môi và các chất phân cực sẽ dao động và nóng lên nhanh chóng làm tăng khả năng hòa tan các chất vào dung môi. Vi sóng cũng làm phá hủy cấu trúc vách tế bào thực vật, làm các chất tan giải phóng trực tiếp vào dung môi trích ly, làm cho quá trình trích ly chuyển thành hòa tan đơn giản. Điều này làm cho việc trích ly nhanh hơn nhưng cũng làm dịch trích ly nhiều tạp chất hơn do đó cần có quy , trình loại tạp tiếp theo.
Jaitak và cộng sự (2009) đã so sánh 3 phương pháp trích ly cỏ ngọt: trích ly lạnh thông thường được thực hiện ở 250C trong 12 giờ, trích ly bằng sóng siêu âm được thực hiện ở nhiệt độ 35±50C trong 30 phút và trích ly bằng lò vi sóng (MAE) được thực hiện ở mức công suất 80W trong 1 phút ở 50oC. Kết quả cho thấy, phương pháp MAE thu được stevioside và Rebaudioside Audioside-A có hàm lượng lớn nhất, tương ứng là 8,64 và 2,34%. Trong khi với kỹ thuật thông thường và siêu âm cho hàm lượng stevioside và Rebaudioside A thấp hơn, đạt 6,54 &
1,20% và 4,20 & 1,98%, tương ứng. Điều này cho thấy MAE là phương pháp nhanh và hiệu quả để trích ly stevioside và Rebaudioside Audioside-A. Lợi thế là chiết xuất và sàng lọc nhanh một số lượng lớn các mẫu S. rebaudiana để đánh giá các loại nguyên liệu cỏ ngọt đã trồng [37].
1.3.4. Trích ly đường từ cỏ ngọt bằng dung môi
Trích ly bằng dung môi là kỹ thuật cổ điển nhất được biết đến. Tùy theo từng loại vật chất trích ly mà chọn dung môi trích ly cho phù hợp. Về nguyên tắc, để
trích ly các chất kém phân cực (chất béo, tinh dầu, carotenoid, các triterpen và steroide tự do...) thì phải sử dụng các dung môi kém phân cực. Để trích ly các chất phân cực (các glycoside, các muối của alkaloid, các hợp chất polyphenol...) thì phải sử dụng các dung môi phân cực. Trên thực tế, cồn với các độ cồn khác nhau là dung môi hay được dùng. Cồn có thể hòa tan được nhiều nhóm hoạt chất, không độc, rẻ tiền và dễ kiếm.
Quá trình tách chiết STG theo phương pháp truyền thống được mô tả theo các bước giống nhau như của Phillip (1987) 1]. Lá [6 Stevia được chiết xuất bằng nước nóng hoặc cồn. Trong 1 số trường hợp, lá khô được xử lý trước bằng dung môi không phân cực như là chloroform hoặc hexan để loại bỏ dầu, lipid, chlorofyll và các chất không phân cực. Chất chiết sau đó được tách tạp hất và khử mầu bằng c cách kết tủa với muối hoặc kiềm và lọc qua than hoạt tính. Dịch chiết sau đó được cô đặc và hòa loãng lại trong cồn để kết tinh glycoside. Các tinh thể được tạo thành chính là Stevioside tinh khiết.
Sáng chế đầu tiên của Nhật Bản cũng đã đề cập đến công nghệ trích ly Stevioside từ Stevia. Theo công nghệ này, chồi, nụ và lá cỏ ngọt được rửa sạch bằng nước, nấu sôi, sấy khô và được đem chiết theo phương thức cổ truyền như với chloroform để thu được Stevioside. Markosyan (2013) đã nghiên cứu và tách chiết được STG ở dạng tinh thể màu trắng hoặc vàng sáng, hòa tan trong nước và ethanol.
Các tinh thể này không mùi hoặc có mùi nhẹ đặc trưng. Methanol được sử dụng trong hầu hết các quá trình trích ly và tinh chế. Tuy nhiên methanol không an toàn cho người sử dụng 2][5 . Phương pháp gần đây sử dụng hệ thống lọc nước mà không sử dụng methanol để sản xuất sản phẩm thiên nhiên. Nhà máy ở Brazil chỉ sử dụng nước để tách chiết STG và yêu cầu độ tinh khiết đạt 96 %, ví dụ như sản phẩm
“Stevia Crystal”.
1.3.5. Trích ly STG từ cỏ ngọt bằng phương pháp enzyme
Các kỹ thuật trích ly hiện đại, chẳng hạn như trích l bằng chất lỏng áp lực y cao, trích ly bằng nước nóng áp lực hoặc hơi nóng, trích ly bằng chất lỏng siêu tới hạn và trích ly có sự trợ giúp của lò vi sóng đã được sử dụng để chiết xuất các hợp
chất hoạt tính sinh học 9][5 . Tuy nhiên, các phương pháp này đều có mặt hạn chế và bất tiện như yêu cầu các thiết bị phức tạp, chịu áp và chi phí vận hành cao… Do đó, cần có một kỹ thuật mới sử dụng các tiếp cận công nghệ sinh học để sản xuất các STG từ cỏ ngọt, như trích ly bằng enzyme. Puri và cộng sự (2012) đã xử lý lá cây stevia với các enzym phân huỷ tế bào để tạo ra hỗn hợp steviol-glycosides (2,84 mg/100mg lá). Nhóm tác giả đã nâng cao hiệu suất chiết Stevioside lên 3 lần bằng cách sử dụng hỗn hợp các enzyme xenlulaza, hemixenlulaza và pectinaza so với đối chứng không sử dụng enzyme [60]. Trong khi đó, Abelyan, 2010 đã sử dụng enzyme Pectinex Ultra –SPL tỷ lệ 2 % so với khối lượng cỏ ban đầu để chiết xuất cỏ ngọt nhằm tạo ra chế phẩm STG có thành phần là dulcoside 3,2 %; Stevioside 60,4 %; Rebaudioside A 25,7 % và RebC 5,7 % [10].
Gần đây nhất, nhóm tác giả Rao và cộng sự (2015) đã phát triển một phương pháp rất mới sử dụng enzyme trung gian (Enzymelà -Mediated Extraction, EME)để trích ly Stevioside từ lá cỏ ngọt Stevia Rebaudiana Bertoni. Các lá cỏ stevia đã được tiền xử lý bằng enzym thủy phân có bổ sung thêm muối kim loại chuyển tiếp FeCl3. Sau đó, sử dụng phương pháp trích ly bằng nước nóng có áp suất cao (PHWE) để giải phóng stevioside. Sau khi hoàn thành quá trình chiết xuất, dịch chiết xuất thô đã được cho qua sàng kích thước 63 μm, dịch lọc thu được sau đó đưa qua hệ thống tách màng tích hợp, gồm màng vi lọc (MF), màng lọc cực đại (UF) và màng lọc nano (NF), để thu hồi stevioside có độ tinh khiết mong muốn Kết quả . nghiên cứu cho thấy, việc xử lý bằng enzyme cenlulase có bổ sung muối FeCl3 đã làm tăng hiệu suất thu hồi stevioside lên 72%, với độ tinh khiết 98%, cao hơn so với sử dụng cenlulase thông thường [63].
Bảng 1.4. Tính chất hoạt động và các điều kiện tối ưu của các chế phẩm enzyme thương mại được sử dụng để trích ly đường từ cỏ ngọt Tên chế
phẩm
Các enzyme hoạt động chính
Nhiệt độ tối ưu (0C)
pH tối ưu (0C)
Xuất xứ
Citrozyme CEO
Polygalacturonase 40 5,5 №vozymes,
Đan mạch Citrozyme
Ultra L
Polygalacturonase 50 4,5 №vozymes,
Đan mạch Pectinex
Ultra SP-L
Polygalacturonase 55 4,0 №vozymes,
Đan mạch Cellulast
1.5L
Cellulase 50 4,5 №vozymes,
Đan mạch Viscozyme L Pectinolytic,
hemicellulase, cellulase
50 4,0 №vozymes,
Đan mạch Peclyve EP Polygalacturonase
Pectin methylesterase, Pectin lyase
50 4,5 Lyven, Pháp
Peclyve LI Polygalacturonase Pectin methylesterase, Cellulase
45 4,0-5,0 Lyven, Pháp