CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1.Phương pháp công nghệ: Quy trình chiết tách STG từ lá cỏ ngọt dự kiến theo hình 2.1
Hình 2.1. Quy trình chiết tách STG từ lá cỏ ngọt dự kiến [10]
Lọc tinh Nghiền Hòa trong dung môi
Lọc thô Lá cỏ ngọt khô
Enzyme
Thu nhận sản phẩm
Bột chiết Steviol glycoside
Trích ly
Tinh chế
2.2.1.1. Xác định dung môi thích hợp cho quá trình trích ly các STG từ cỏ ngọt Các dung môi được sử dụng cho quá trình trích ly các STG từ cỏ ngọt là:
nước, ethanol, methanol, hệ dung môi ethanol 80% (ethanol/nước = 80/20, v/v), hệ dung môi methanol 80% (methanol/nước = 80/20, v/v). .
100 g lá cỏ ngọt đã nghiền mịn được trích ly lần lượt với các dung môi trên theo phương pháp của Nikolai (2001) [55]. Dung môi được trộn với bột cỏ ngọt theo tỷ lệ là 5/1 (v/w) và giữ trong thời gian 7h, sau đó lọc qua giấy lọc. Dịch lọc được cô quay chân không ở 450C cho đến khô. Xác định hàm lượng STG (%) và chất hòa tan tổng số (%) trong hỗn hợp STG thu được.
2.2.1.2. Nghiên cứu sử dụng enzyme trong quá trình trích ly STG từ cỏ ngọt - Xác định loại enzyme thích hợp
100 g lá cỏ ngọt đã nghiền mịn được trích ly bằng nước theo tỷ lệ 5/1 (v/w), theo quy trình dự kiến ở hình 2.1. Các chế phẩm enzyme được sử dụng là Pectinex Ultra SPL, Cellulast 1.5L, Viscozym L của hãng Novo – Đan Mạch được bổ sung 1 ,
% vào hỗn hợp trích ly của cỏ ngọt trong nước.
- Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình trích ly STG từ cỏ ngọt bằng enzyme
Thay đổi các điều kiện của quá trình trích ly STG từ cỏ ngọt có sử dụng enzyme như tỷ lệ nguyên liệu nước từ : / 1/3 1 3, w/v– /1 ; tốc độ khuấy từ 0 – 300 vòng/ phút; tỉ lệ enzyme Pectinex Ultra SP-L từ 0, –5 3 %; pH từ –3 7,5; nhiệt độ trích ly 32 –600C; thời gian trích ly 1h 12h; – số lần trích ly 1 3 lần, xác định nồng - độ chất khô hòa tan, nồng độ STG trong dịch trích ly và tính hiệu suất trích ly chất khô và hiệu suất trích ly STG thu được.
2.2.1.3. Tinh sạch và thu hồi sản phẩm STG từ cỏ ngọt - Kết tủa dịch trích ly
Dịch trích ly được loại bỏ các tạp chất và chất mầu nhờ phương pháp kết tủa bằng cách bổ sung Ca(OH)2 đến pH = 10 và khuấy liên tục 150 v/p, nhiệt độ 550C, trong 45 phút. Tiếp theo làm nguội khối dịch về nhiệt độ thường và bổ sung FeCl3
đến pH = 7, nhiệt độ 550C, trong 15 phút để tạo kết tủa. Lọc, tách kết tủa để thu hồi dịch trích ly trong suốt mầu xanh đen nhạt.
- Tinh chế dịch trích ly
Dịch trích ly tiếp tục được khử ion và khử mầu bằng cột trao đổi cation Amberlite FPC23 H, sau đó là cột anion Amberlite FPA51. Tiếp theo, khử màu dịch trích ly thu được bằng than hoạt tính Norit CN1 với nồng độ 0,25 – 0,5 %; nhiệt độ từ 30 – 800C, thời gian từ 10 – 90 phút. Dịch trích ly sau đó được lọc, tách than và tạp chất rồi đánh giá kết quả thông qua hàm lượng STG, OD600 và tính chất cảm quan.
- Sấy phun tạo chế phẩm STG từ quá trình trích ly cỏ ngọt
Dịch trích ly cỏ ngọt đã qua xử lý ion và mầu được cô đặc chân không tạo ra hỗn hợp có nồng độ chất khô 20 30 % để đưa vào máy sấy phun nhằm xác định - nồng độ hỗn hợp tối ưu dựa vào hiệu suất thu hồi, độ ẩm và hàm lượng STG trong sản phẩm của mỗi mẫu sấy phun trên thiết bị thí nghiệm Umato. Xác định các điều kiện sấy phun thích hợp để thu nhận được chế phẩm STG cần nghiên cứu bao gồm:
nồng độ cơ chất ban đầu của dịch sấy phun từ 20 30 %; nhiệt độ không khí đầu - vào sấy phun từ 100 - 1500C và tốc độ nhập liệu cho sấy phun từ 2,5 - 10 ml/phút.
2.2.1.4. Xác các điều kiện kết tinh Rebaudioside A từ bột STG của cỏ ngọt
- Hòa tan bột STG với tỷ lệ dung môi ethanol 70 95 % so với cơ chất từ 2/1 –- 7/1, gia nhiệt 550C, trong 15 phút, khuấy 50 v/p. Hạ nhiệt độ về 250C và bổ sung mầm tinh thể Rebaudioside A 95 % với tỷ lệ từ 0,5 – 2,5 % so với khối lượng STG ban đầu để khởi động quá trình kết tinh.
- Kết tinh Rebaudioside A Rebaudioside A : được để cho kết tinh ở nhiệt độ 5 – 450C, trong từ 4 - 12 giờ, duy trì khuấy 50 v/p.
2.2.2. Phương pháp phân tích hóa lý
- Xác định độ ẩm: Sấy đến 105oC trong 3 giờ đến trọng lượng không đổi TCVN 3700 90.–
- Xác định nồng độ chất khô hòa tan: được xác định bằng khúc xạ kế Milwaukee MR 32 (Phần Lan) với thang đo 0Brix (0-99) ở 250C.
- Xác định độ trong của dịch trích ly bằng máy đo đo quang phổ UV-VIS Halo DB- 200 (Pháp) ở bước sóng 600 nm theo phương pháp được mô tả bởi Arab – Abou và cộng sự (2010) [11].
- Đo pH: 30ml mẫu được lấy ra cho vào cốc mẫu. Giá trị pH được xác định trực tiếp bằng máy đo pH ORION Model 410 A (Đức được chuẩn với dung dịch đệm pH), = 4,0 và pH = 7,0.
- Phương pháp xác định độ hòa tan của sản phẩm: Lấy 10g bột, hòa tan trong 200 ml nước cất, ly tâm 3 00 vòng/phút trong 10 phút. Sau đó lấy phần dịch ở trên đem .0 đi sấy khô.
Khối lượng thu được sau khi sấy Độ hòa tan = (%)
Khối lượng mẫu ban đầu (10g)
- Xác định hàm lượng các đường chức năng STG (Stevioside và Rebaudioside A) bằng HPLC [10, 11].
Bột cỏ ngọt khô
Cân 5g mẫu bột lá cỏ ngọt đã được sấy khô và nghiền mịn vào bình nón, bổ sung 50ml nước cất và lắc đều, sau đó đun cách thủy 100 0C, trong 30 phút, có lắc.
Tiếp theo, lọc qua giấy lọc và chiết thêm 3 lần như trên. Sau đó, gộp dịch lọc và định mức dịch lọc vừa đủ 100 ml, để nguội và lọc qua màng lọc 0,45 àm, trước khi mang đi phân tích STG bằng HPLC.
Siro STG cỏ ngọt, các chế phẩm STG và Rebaudioside A
Rebaudioside A Cân 1g mẫu siro STG cỏ ngọt hoặc chế phẩm STG và đã được sấy khô và nghiền mịn vào bình nón, bổ sung 20ml nước cất và lắc đều, sau đó đun cách thủy 1000C, trong 30 phút, có lắc cho tan hết. Sau đó, để nguội và định mức dịch lọc vừa đủ 100 ml rồi và lọc qua màng lọc 0,45 àm, trước khi mang đi phân tích bằng HPLC.
Điều kiện HPLC
- Cột sắc ký: Supelco LC-NH2 250x4,6 mm, 5àm
- Pha động: acetonitrile/nước (70/30) và tốc độ dòng: 1,5 ml/phút - Nhiệt độ buồng cột: 300C và detector PDA ở bước sóng 210nm
- Stevioside và Rebaudioside A tinh khiết 99,9 % của Sigma (Đức) được sử dụng làm chất chuẩn.
Hàm lượng đường Stevioside và Rebaudioside A: được tính theo tỷ lệ diện tích peak giữa chất phân tích và đường chuẩn được lập ra từ các diện tích peak của chất chuẩn ở các nồng độ tăng dần từ 0 đến 240 ppm đối với Stevioside và từ 0 đến 125 ppm đối với Rebaudioside A.
Hàm lượng STG được tính bằng tổng hàm lượng Stevioside và Rebaudioside A: của mỗi mẫu cỏ được phân tích bằng HPLC.
2.2.3. Phương pháp phân tích vi sinh
- Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí theo TCVN 5165:90.
- Xác định Coliforms theo TCVN 4882:2007.
- Xác định tổng số nấm men, mốc theo TCVN 5166:90.
2.2.4. Phương pháp phân tích kim loại nặng
- Xác định hàm lượng tro: được xác định theo AOAC 930.05.
- Xác định hàm lượng chì xác định theo AOAC 999.11.
- Xác định hàm lượng asen theo AOAC 986.15.
2.2.4. Phương pháp toán học 2.2.4.1. Tính hiệu suất
- Hiệu suất trích ly chất khô (%) được tính theo công thức:
Trong đó: - X: Hiệu suất trích ly chất khô (%)
- V: Thể tích dịch thu được sau khi trích ly (ml) - C: Nồng độ chất khô thu được (0Bx)
- m: Khối lượng nguyên liệu cỏ ngọt ban đầu đưa vào trích ly (g) - Hiệu suất trích ly STG (%) được tính theo công thức:
Trong đó: - H: Hiệu suất trích ly STG (%)
- V: Thể tích dịch thu được sau khi trích ly (L)
- C1: Nồng độ STG (g/L)
- Co: Tỉ lệ STG có trong nguyên liệu (g/100g)
- m: khối lượng STG trong nguyên liệu ban đầu (kg) - Hiệu suất thu hồi STG trong sản phẩm sấy phun (kết tinh) [14].
Trong đó : - H: Hiệu suất thu hồi STG trong sản phẩm sấy phun (kết tinh) (%) - m1: Khối lượng STG thu được sau sấy phun (kết tinh)
- m0: Khối lượng STG trong nguyên liệu đưa vào sấy phun (kết tinh) 2.2.4.2. Phương pháp xử lý số liệu
- Các kết quả được trình bày trong phần kết quả của nghiên cứu này là kết quả trung bình của 3 thí nghiệm lặp lại của cùng một điều kiện thí nghiệm.
- Xử lý số liệu bằng phần mềm Excel 2010 và SPSS 18.