Nghiên cứu định lượng stevioside trong cây cỏ ngọt và sản phẩm từ cây cỏ ngọt bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao hplc

TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA HÓA -    - ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đề tài: Nghiên cứu định lƣợng Stevioside cỏ sản phẩm từ cỏ phƣơng pháp sắc kí lỏng hiệu cao HPLC Sinh viên thực : Trần Thị Minh Lớp : 49k – Hóa Thực Phẩm Giảng viên hƣớng dẫn: TH.S Lê Thế Tâm NGHỆ AN - 2013 sMỤC LỤC LỜI CẢM ƠN……………………………………………………………………….……3 Danh mục hình…………………………………………………………… Danh mục bảng……………………………………………………………….…… Danh mục từ viết tắt .6 MỞ ĐẦU 1.Lý chọn đề tài Nhiệm vụ nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài PHẦN I TỔNG QUAN 10 1.1 Chi Cúc 10 1.2 Giới thiệu cỏ 11 1.2.1 Nguồn gốc 11 1.2.2 Đặc điểm thực vật học 15 1.2.3 Thành phần hóa học 16 1.2.4 Ý nghĩa kinh tế .20 1.2.5 Sơ chế sản phẩm từ cỏ 20 1.3 Tìm hiểu chung hợp chất stevioside 22 1.3.1 Tính chất hóa học 22 1.3.2 Tính chất lý học 24 1.3.3 Tính chất cảm quan 24 1.3.4 Mối quan hệ độ số chất steviol glycoside 25 1.3.5 Ứng dụng thực phẩm 26 1.3.6 Độ an toàn 29 1.3.7 Nhu cầu sản phẩm dịch vụ chủ yếu thị trƣờng 31 1.4 Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC .34 1.4.1 Cơ sở lý thuyết…………………………………………………………… 34 1.4.2 Nguyên lý………………………………………………………………… 35 1.4.3 Các dạng sắc ký lỏng hiệu cao……………………………………… 35 1.4.4 Hệ thống HPLC…………………………………………………………… 36 1.4.4.1 Hệ thống cung cấp dung môi bơm cao áp………………………… 37 1.4.4.2 Hệ thống đƣa mẫu vào cột……………………………………………… 37 1.4.4.3 Cột sắc ký……………………………………………………………… 38 1.4.4.4 Detector………………………………………………………………… 38 1.4.5 Nguyên tắc chung trmg bị phƣơng pháp HPLC .39 PHẦN II PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 41 2.1 Phƣơng pháp lấy mẫu 41 2.2 Hóa chất thiết bị 41 2.2.1 Hóa chất 41 2.2.2 Thiết bị dụng cụ……………………………………………………… 41 2.3 Chuẩn bị mẫu……………………………………………………………… 43 PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN …………………………………… 46 3.1 Xác định khoảng tuyến tính định lƣợng mẫu…………………………… 46 3.2 Đánh giá phƣơng pháp định lƣợng ……………………………………… 52 3.2.1 Đánh giá hiệu suất thu hồi phƣơng pháp…………………………… 52 3.2.2 Đánh giá độ lặp phƣơng pháp………………………………………….53 PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ………………………… ………… 55 Kết luận……………………………………………………………………… ….55 Kiến nghị…………………………………………………………………… … 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO ………………………………………………… ……56 LỜI CẢM ƠN Đồ án đƣợc thực phịng thí nghiệm hóa thực phẩm_ Khoa Hóa Học_ Trƣờng Đại Học Vinh, Trung tâm Kiểm định An Tồn Thực Phẩm Mơi Trƣờng Trƣờng Đại Học Vinh Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin chân thành cảm ơn ThS Lê Thế Tâm - Khoa Hóa Học- Trƣờng Đại Học vinh giao đề tài, tận tình hƣớng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi suốt trình nghiên cứu hồn thành đồ án Tơi xin chân thành cảm ơn ThS.Chu Thị Thanh Lâm- Khoa Hóa Học- Trƣờng Đại Học Vinh tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi suốt q trình làm thí nghiệm, phân tích kết Nhân dịp này, tơi xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô, cán tổ hóa Thực Phẩm, Khoa Hóa Học, gia đình, bạn bè động viên giúp đỡ tơi hồn thành đồ án Nghệ An, tháng 12 năm 2012 Sinh viên Trần Thị Minh C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Danh mục hình Hình 1.1: Cây cỏ ngọt………………………………………………………… 11 Hình 1.2: Lá hoa cỏ ngọt……………………………………………… 15 Hình 1.3: Cấu trúc Stevioside…………………………………………… 16 Hình 1.4: Cơng thức cấu tạo chất taọ cỏ ngọt………… 16 Hình 1.5 Sản phẩm chiết xuất từ cỏ ngọt……………………………… 21 Hình 1.6: Cơng thức hóa học Stevioside, gồm nhóm steviol liên kết với phân tử β-D-Glucose sophorose……………………………………… 23 Hình 1.7: Sự liên kết Steviol carbohydrate để tạo thành steviolmonoside, steviolbioside, stevioside rebaudioside A……………… 24 Hình 1.8: Một số sản phẩm chiết xuất từ cỏ có thành phần stevioside .…… .…… 27 Hình 1.9 : Nƣớc giải khát ứng dụng steviolside………………………… ….28 Hình 1.10: Sản phẩm kết hợp stevioside, rebaudioside A loại chất làm khác .28 Hình 1.11: Một số loại trà chứa thành phần cỏ .29 Hình 1.12: Các loại đƣờng cỏ thị trƣờng………………… 34 Hình 1.13: Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Agilent 1100…… 36 Hình1.14: Sơ đồ nguyên lý máy sắc ký lỏng hiệu cao…………… .37 Hình 2.1: Các thiết bị đƣợc sử dụng phịng thí nghiệm……………… 43 Hình 2.2: Hình ảnh mẫu cỏ khơ, cỏ tƣơi trà cỏ ngọt………… …45 Hình 3.1: Đƣờng chuẩn biểu thị mối quan hệ diện tích peak nồng độ chuẩn Stevioside…………………………………………………… .47 Hình 3.2: Sắc đồ chuẩn stevioside 60 µg/ml……………………………… 47 Hình 3.3: Sắc đồ chuẩn stevioside 100 µg/ml…………………………… …48 Hình 3.4: Sắc đồ chuẩn stevioside 160 µg/ml…………………………… …48 Hình 3.5: Sắc đồ chuẩn stevioside200 µg/ml……………………………… .49 Hình 3.6: Sắc đồ cỏ khơ thêm chuẩn………………………………… …50 Hình 3.7: Sắc đồ cỏ khơ……………………………………………… 51 Hình 3.8: Sắc đồ trà cỏ ngọt………………………………………………… 51 Hình 3.9: Sắc đồ cỏ tƣơi……………………………………………… 52 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Danh mục bảng Bảng 1.1 Cấu trúc hố học chất cỏ stevia….…… 17 Bảng 1.2 Thành phần hóa học chất đƣờng cỏ ngọt………… ….17 Bảng 1.3 Mối quan hệ độ số chất steviol glycoside so với Sucrose .………….25 Bảng 1.4 Các loại cột thơng dụng……………………………………………… 38 Bảng 3.1 Diện tích peak stevioside tƣơng ứng với nồng độ chuẩn… 46 Bảng 3.2 Kết phân tích hàm lƣợng stevioside cỏ khô, cỏ tƣơi trà cỏ ngọt…………………………………………………………………… 50 Bảng 3.3 Kết xác định hiệu suất thu hồi phƣơng pháp 53 Bảng 3.4: Kết xác định độ lặp phƣơng pháp…………………………….53 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Danh mục từ viết tắt GC-MS: Sắc ký khí khối phổ UV – VIS: ultraviolet – spectrophotometer HPLC: Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao FAO: Food and Agriculture Organization (Tổ chức lƣơng thực nông nghiệp Liên Hợp Quốc) WHO: Would Health Organization (Tổ chức y tế giới) JECFA: Ủy ban chuyên gia quốc tế phụ gia thực phẩm ADI: Aceptable Daylinake (Liều lƣợng tối đa ngày không gây hại) FDA: Food and Drug Administration (Cục Quản Lý Thực Phẩm & Dƣợc Phẩm Hoa Kỳ) Htb :hiệu suất thu hồi trung bình RSD: độ lệch chuẩn tƣơng đối Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Đƣờng sản phẩm tạo thƣờng đƣợc cho nguyên nhân gây nhiều vấn đề sức khỏe, từ béo phì đến cao huyết áp Đƣờng kính phƣơng Tây đuợc gọi dƣới tên : “Cái chết trắng” Gọi nhƣ vì, đƣờng kính trắng có chứa tới 99% Carbohydrate thủ phạm hàng đầu gây béo phì, loại bệnh nhƣ cao huyết áp, tiểu đƣờng, tim mạch, đột quỵ Dĩ nhiên, đƣờng kính trắng xuất khắp nơi nhƣ bánh kẹo, nƣớc Để giảm tác hại đƣờng kính trắng ngƣời ta nghĩ tìm loại chất tạo thay đƣờng kính trắng mà bảo đảm an toàn cho sức khỏe Và nhƣ đƣờng ăn kiêng đời Đây loại đƣờng có độ thấp, chiết xuất tự nhiên từ thực phẩm, đƣợc xem loại đƣờng chuyên dụng dành cho bệnh nhân tiểu đƣờng có số đƣờng huyết thấp Ngoài ra, loại đƣờng cịn cung cấp lƣợng so với đƣờng kính, nên thích hợp cho ngƣời ăn kiêng hay cần giảm cân ngƣời quan tâm tới chế độ ăn lành mạnh để phòng ngừa quản lý bệnh béo phì, tiểu đƣờng xơ vữa động mạch Ƣu điểm loại đƣờng không gây tác dụng phụ nhƣ loại đƣờng hóa học Trong thiên nhiên có nhiều loại chứa đƣờng lƣợng thấp, với độ cao gấp hàng trăm lần đƣờng mía Chúng đƣợc dùng làm chất thay đƣờng cho ngƣời phải kiêng loại thực phẩm Cỏ loại nhƣ Cây cỏ đƣợc coi chất làm thiên nhiên thay cho đƣờng kính tuyệt vời Cây cỏ có hàm lƣợng chất steviosid có vị gấp 300 lần đƣờng thƣờng (saccharose, sucrose), đặc biệt không tạo calorie ổn định nhiệt độ cao 1980C Trong y học steviosid dùng cho ngƣời bị đái tháo đƣờng, xơ cứng động mạch, béo phì, cao huyết áp Trong cơng nghiệp thực phẩm chất phụ gia điều vị tạo không sinh lƣợng dùng để sản xuất thực phẩm cho đối tƣợng Cỏ ngày đƣợc sử dụng phổ biến rộng rãi toàn giới Nghiên cứu cho thấy có hợp chất tạo vị cỏ là: stevioside (5 10%), rebaudioside A (2 - 4%), rebaudioside C (1 - 2%) dulcoside A (0,5- 1%) Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Trong năm gần cỏ đƣợc đƣa thử nghiệm Việt Nam Tuy loại trồng hoàn toàn nƣớc ta, nhƣng tính thích ứng rộng nhiều loại đất vùng sinh thái khác nhau, vùng cao nguyên, trung du miền núi Kỹ thuật nhân giống, gieo trồng chăm sóc đơn giản, đầu tƣ không nhiều (trồng lần sau -10 năm phải trồng lại), việc thu hoạch sản phẩm dễ dàng, sản phẩm cành khơ nên sử dụng làm nguyên liệu phục vụ y học công nghiệp thực phẩm trực tiếp làm thành phẩm nhƣ loại trà giải khát, chữa bệnh… Công dụng chủ yếu cỏ sử dụng công nghiệp thực phẩm y dƣợc học Chất chủ yếu steviosid có cỏ chiếm từ - 8% cỏ khô Các chất cỏ sử dụng dạng thơ (lá khô) nhƣ trà cỏ (trà Stevia), nấu uống trộn với trà xanh, trà đen để uống, đƣợc chế biến thành xi rô, bột tinh thể steviosid, dùng để làm chất thay đƣờng, dùng công nghiệp thực phẩm: bánh mứt kẹo, nƣớc hoa quả… Ƣu điểm chất từ cỏ từ thiên nhiên có tính bảo quản cao, khó bị mốc meo Vì việc nghiên cứu xác định thành phần chất định lƣợng chất cỏ nhằm mục đích làm nguyên liệu cho thực phẩm chức tăng cƣờng sức khỏe ngƣời, có ý nghĩa khoa học thực tiễn cao Trong cỏ stevioside hợp chất đƣợc quan tâm nhiều chứa hàm lƣợng cao nên việc xác định hàm lƣợng hợp chất cỏ quan trọng cho biết hiệu suất thu hồi chất tạo cỏ có ý nghĩa to lớn với ngành cơng nghiệp thực phẩm y học Do tơi chọn đề tài “Nghiên cứu định lượng stevioside cỏ sản phẩm từ cỏ phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC” để biết xác hàm lƣợng stevioside nguyên liệu nhƣ nào? Nhiệm vụ nghiên cứu - Nghiên cứu tính chất vật lý, hóa học chất tạo cỏ - Nghiên cứu định lƣợng stevioside phƣơng pháp HPLC - Nghiên cứu hàm lƣợng stevioside cỏ trà cỏ - Đƣa số đề xuất việc sử dụng stevioside phần ăn hàng ngày Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Đối tƣợng nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu dịch chiết từ thân cỏ sản phẩm chế biến từ cỏ ngọt: trà cỏ Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Kết nghiên cứu nguồn tham khảo tốt cho nghiên cứu sâu ứng dụng cụ thể stevioside thu nhận từ nguồn thân cỏ để đƣa vào thực tiễn sản xuất thực phẩm chức đời sống nâng cao hiệu sử dụng phận khác cỏ Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 10 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Máy xay mẫu cân phân tích Máy cất quay chân khơng Máy li tâm Bể siêu âm Cột chiết pha rắn SPE Hình 2.1: Các thiết bị đƣợc sử dụng phịng thí nghiệm Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 44 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Các mẫu cỏ khô, cỏ tƣơi trà cỏ đƣợc cắt nhỏ sau đƣợc nghiền mịn, đồng máy nghiền mẫu Cân xác 1g mẫu cân phân tích, sau cho vào ống ly tâm dung tích 50ml, thêm 20ml dung dịch pha động (ACN: H2O =50:50) Sau làm đồng mẫu 60 phút máy siêu âm ly tâm vòng 15 phút tốc độ 5000 vòng/phút, dùng pipet hút dịch cho vào bình cầu lê Cơ dung dịch bình cầu máy cất quay chân khơng nhiệt độ 700C cạn Sau rửa thành bình 2ml dung dịch pha động Làm cột chiết pha rắn (SPE): Hoạt hóa cột SPE lần lƣợt với 10ml nƣớc 10ml MeOH:H2O=20:80 Chuyển toàn dịch chiết vào cột SPE, rửa bình hai lần với 2ml dung dịch pha động (ACN: H2O =50:50) Sau hút chân khơng liên tục qua cột SPE khô cột Đƣa ống ly tâm 50ml hứng dịch từ cột SPE Tiếp rửa giải stevioside từ SPE 10ml MeOH: H2O =80:20, hút đến hết dịch chảy khỏi SPE hút chân không thêm 10 giây Định mức tới vạch dung dịch pha động ACN: H2O =50:50 Dung dịch thu đƣợc đem pha lỗng 10 lần trƣớc đem phân tích Lọc dịch trƣớc bơm vào máy HPLC màng lọc dung môi 0,45μm Mẫu cỏ khô Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 45 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Cỏ tƣơi trà cỏ Hình 2.2: Hình ảnh mẫu cỏ khơ, cỏ tƣơi trà cỏ Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 46 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Xác định khoảng tuyến tính định lƣợng mẫu Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng stevioside dựa đánh giá thơng số, tính tƣơng thích hệ thống, tính đặc hiệu, thời gian lƣu, khoảng tuyến tính, giới hạn phát giới hạn định lƣợng đƣợc đối chiếu với pic dung dịch chuẩn gốc Qua tham khảo tài liệu [10,12] tiến hành khảo sát yếu tố thực nghiệm xây dựng đƣợc điều kiện phân tích HPLC nhƣ sau: Điều kiện chạy sắc ký: - Mẫu đƣợc chạy cột ZOBAX Carbohydrate (4,6 x150mm; 5μm) - Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút - Nhiệt độ lị cột:300C, bƣớc sóng: 205 nm - Detector UV - Tỉ lệ pha động Acetonitril (ACN): H2O = 50:50 - Thể tích tiêm mẫu 10µl Dãy chuẩn stevioside đƣợc khảo sát có nồng độ nhƣ sau: 60; 100; 160; 200 (µg/ml) Tiến hành chạy máy sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) từ kết thu đƣợc chúng tơi xây dựng phƣơng trình hồi quy đƣờng chuẩn stevioside theo diện tích peak có dạng nhƣ sau: R2 = 0,9998 y = 15,088x - 2,6089 Bảng 3.1: Diện tích peak stevioside tƣơng ứng với nồng độ chuẩn Nồng độ chuẩn µg/ml Diện tích A B R2 15,088 -2,6089 0,9998 peak 60 893,35205 100 1512,59717 160 2428,19824 200 3001,28223 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 47 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 3500 y = 15,088x - 2,6089 R2 = 0,9998 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 50 100 150 200 250 Hình 3.1: Đƣờng chuẩn biểu thị mối quan hệ giửa diện tích peak nồng độ chuẩn stevioside Hình 3.2: sắc đồ chuẩn stevioside 60 µg/ml Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 48 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 3.3: sắc đồ chuẩn stevioside 100 µg/ml Hình 3.4: sắc đồ chuẩn stevioside 160 µg/ml Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 49 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 3.5: sắc đồ chuẩn stevioside 200 µg/ml Sau tiến hành phân tích mẫu cỏ tƣơi, trà cỏ ngọt, mẫu cỏ khô máy sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC), thu đƣợc kết bảng hình sau: Qua bảng số liệu ta thấy phƣơng pháp có khoảng giới hạn phát khoảng định lƣợng nhỏ chứng tỏ thiết bị có độ nhạy cao, phát đƣợc hàm lƣợng stevioside dƣới dạng vết có mẫu phân tích - Từ giá trị diện tích peak đo đƣợc ta tính đƣợc hàm lƣợng C (ppm) - Sau ta tính hàm lƣợng stevioside mẫu theo cơng thức: C = (C0/ m) Vdm.f Trong đó: C : nồng độ stevioside có mẫu tính (mg) Co: nồng độ stevioside dịch chiết tính từ đƣờng chuẩn, tính theo ppm Vdm: thể tích bình định mức mẫu(ml) f : hệ số pha lỗng (nếu có) m : khối lƣợng mẫu (mg) Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 50 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Bảng 3.2 Kết phân tích hàm lƣợng stevioside cỏ khô, cỏ tƣơi trà cỏ Mẫu Các mẫu Cỏ khô Cỏ khô thêm chuẩn Cỏ tƣơi Trà cỏ C0 Khối lƣợng (µg/ml) mẫu (g) 85,27244 Diện tich pic C (mg/g) 1,0012 1292,31909 17,03 138,78350 1,0013 2104,85278 27,07655 1,0016 408,64886 23,59513 1,0011 355,78555 Hình 3.6: Sắc đồ cỏ khô thêm chuẩn Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 51 27,72 5,40 4,71 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 3.7: Sắc đồ cỏ khơ Hình 3.8: Sắc đồ trà cỏ Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 52 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 3.9: Sắc đồ cỏ tƣơi 3.2 Đánh giá phƣơng pháp định lƣợng 3.2.1 Đánh giá hiệu suất thu hồi phƣơng pháp Để đánh giá hiệu suất thu hồi phƣơng pháp tiến hành phân tích mẫu cỏ khơ theo quy trình với phƣơng pháp thêm chuẩn Mẫu 1: mẫu cỏ khô không thêm chuẩn Mẫu 2: mẫu cỏ khô thêm chuẩn Hiệu suất thu hồi đƣợc xác định theo công thức sau: Cmẫu - Cblank  m  100% H= Cspike Trong đó: Cmẫu: Hàm lƣợng stevioside có mẫu có thêm chuẩn (ppm) Cblank::Hàm lƣợng stevioside có mẫu khơng thêm chuẩn (ppm) Cspike: Hàm lƣợng chuẩn stevioside cho vào mẫu (ppm) m: Lƣợng cân mẫu thử (g) Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 53 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Độ thu hồi phƣơng pháp đƣợc xác định cách tiến hành phân tích lần lặp lại mẫu đƣợc tiến hành tách chiết theo quy trình xử lý phân tích mẫu với nồng độ thêm chuẩn 100 µg/ml Kết thu đƣợc ghi bảng: Bảng 3.3 Kết xác định hiệu suất thu hồi phƣơng pháp Mẫu Số lần M (mg) Cmẫu Cspike 1 1,0012 17,03 1,0020 27.65 10 106,4 1,0015 27,45 10 104,3 1,0011 27,78 10 107,6 H% Qua kết phân tích cho thấy, hiệu suất thu hồi cao, tỷ lệ % tìm lại chất phân tích Htb (%) = 106,1% đáp ứng yêu cầu phân tích 3.2.2 Đánh giá độ lặp phƣơng pháp Độ lặp lại đƣợc dùng để đánh giá định lƣợng độ phân tán kết Đại lƣợng đặc trƣng cho độ gần giá trị trung bình hai hay nhiều phép đo nhận đƣợc điều kiện giống Đánh giá độ lặp dựa độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD) Theo lý thuyết thống kê, đại lƣợng đặc trƣng cho độ lặp lại độ lệch chuẩn SD hệ số biến thiên CV% (RSD) Thực phân tích 1g mẫu cỏ khơ, lặp lại lần điều kiện Kết phân tích lần lặp lại độ lặp lại phƣơng pháp đƣợc ghi bảng: Bảng 3.4: Kết xác định độ lặp phƣơng pháp Hàm lƣợng stevioside TT Khối lƣợng (g) 1,0012 85.27244 1,0018 85.36052 1,0009 85.13503 (µg/ml) - Giá trị trung bình hàm lƣợng stevioside mẫu cỏ khô là: Xtb= n  x = 85.25599 (g) n i 1 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 54 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an n Độ lệch chuẩn: S= (x i 1 i  xtb ) n 1 = 0.062 Độ lệch chuẩn tƣơng đối: CV(%) = S  100 = 0.158% xtb Trong đó: Xi nồng độ stevioside lần chạy thứ i Xtb nồng độ trung bình n lần chạy n số lần chạy lặp lại Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 55 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Căn vào nhiệm vụ đề tài đồ án hồn thành đƣợc nhiệm vụ sau: Về lí thuyết: - Lý thuyết chung cỏ - Giới thiệu phƣơng pháp sắc kí lỏng hiệu cao HPLC - Lợi ích cỏ sản phẩm từ cỏ Về thực nghiệm: - Đã nghiên cứu quy trình xác định hàm lƣợng stevioside mẫu chứa cỏ - Từ kết thu đƣợc tiến hành phân tích mẫu máy sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) cho thấy trong cỏ tƣơi khu công nghiệp Bắc Vinh cỏ khô, trà cỏ địa bàn thành phố Vinh- Nghệ An có phát stevioside với hàm lƣợng nhƣ sau: - Cỏ khô: 17,03 (mg/g) - Cỏ tƣơi: 5,40 (mg/g) - Trà cỏ ngọt: 4,71 (mg/g) - Liều dùng an toàn chất chiết xuất từ stevia 4mg kilogram trọng lƣợng thể Kiến nghị Với kết thu đƣợc đồ án góp phần đánh giá đƣợc hàm lƣợng stevioside cỏ mẫu thực phẩm chứa cỏ khác Do thời gian không cho phép nên tiến hành phân tích hàm lƣợng stevioside theo số phƣơng pháp khác để từ so sánh độ xác phƣơng pháp chƣa xác định đƣợc hàm lƣợng stevioside số thực phẩm khác Chúng hi vọng quy trình phân tích áp dụng để phân tích hàm lƣợng stevioside thực phẩm khác Vì điều kiện có hạn nên ngƣời thực đề tài khơng tránh thiếu sót Rất mong đƣợc góp ý bảo thầy giáo bạn sinh viên Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 56 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.Nguyễn Tiến Bân (Chủ biên) (2003) Danh mục loài thực vật Việt Nam Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Phan Đức Bình, Võ Huấn(2002) Cây Cỏ Steviosid Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội 3.Nguyễn Thƣợng Dong cộng (2006) Nghiên cứu thuốc từ thảo dƣợc Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội 4.Đỗ Tất Lợi (1999) Những thuốc vị thuốc Việt Nam Nhà xuất Y học 5.Đào Hữu Vinh, Nguyễn Xuân Dũng, Trần Thị Mỹ Kinh, Phạm Hùng Việt (1985) Các phƣơng pháp sắc ký Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 6.Akashi,H.,Yokoyama,Y.(1975)Security of dried-leaf extracts of Stevia Toxicological tests Food Industry 18, 34-43 7.Brandle, J.E., Starratt, A.N, Gijzen, M.(1998) Stevia rebaudiana: its agricultural, biological and chemical properties, Can J of Plant Sci 78, 527-536 8.Bridel, M., Lavielle, R, Le principe a’ saveur sucre’e du Kaa’-he’-e’ (1931) (Stevia rebaudiana) Bertoni Bull SOC.Chim Biol, 13,636-655 9.Brusick, D.J, A critical review of the genetic toxicity of steviol and steviol glycosides Food Chem Toxicol., 46(7)(Suppl.l), S83-S91 2008 10.Carakostas, M.C., Curry, L.L., Boileau, A.C., Brusick, D.J.(2008) Overview: the history, technical function and safety of rebaudioside A, a naturally occurring steviol glycoside, for use in food and beverages Food Chem Toxicol., 46(7)(Suppl 1), S1-S10 11.Chang, S.S., Cook, J.M (1983) Stability studies of stevioside and rebaudioside A in carbonated beverages J Agric Food Chem 31,409-414 12.Clos,J.F, DuBois, G.E., Prakash, I.(2008) Photostability of rebaudioside A and stevioside in beverages J Agric Food Chem.,56,8507-8513 13.Compadre, C.M., Hussain, R.A., Nanayakkara, N.P., Peuuto, J.M., Kinghorn, A.D., 1988 Mass spectral analysis of some derivatives and in vifro metabolites of steviol, the aglycone of the natural sweeteners, stevioside, rebaudioside A, and rubusoside Biomed Environ Mass Spectrom., 15,211-222 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 57 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn