Nghiên cứu định lượng rebaudioside a trong cây cỏ ngọt và một số sản phẩm từ cây cỏ ngọt bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao hplc

664 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Nhiệm vụ nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu cỏ 1.1.1 Giới thiệu 1.1.2 Đặc điểm thực vật cỏ 1.1.3 Các giai đoạn sinh trƣởng phát triển 1.1.4 Phân bố tình hình trồng trọt 1.1.5 Thành phần hóa học cỏ 10 1.2 Tổng quan rebaudioside A 11 1.2.1 Tính chất vật lý 11 1.2.2 Tính chất hóa học 12 1.2.3 Tính chất cảm quan 13 1.3 Một số sản phẩm đƣờng ăn kiêng thị trƣờng 13 1.4 Những sản phẩm từ cỏ Việt Nam 16 1.5 Tổng quan phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 18 1.5.1 Khái niệm 18 1.5.2 Phân loại 18 1.5.3 Pha tĩnh sắc ký pha đảo 19 1.5.4 Pha động sắc ký pha đảo 20 1.5.5 Sơ đồ hệ thống HPLC 21 CHƢƠNG PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Phƣơng pháp lấy mẫu 24 2.2 Phƣơng pháp phân tích 24 CHƢƠNG THỰC NGHIỆM 25 3.1 Thiết bị, dụng cụ, hoá chất 25 3.2 Kỹ thuật thực nghiệm 25 3.2.1 Chuẩn bị hố chất phân tích 25 3.2.2 Xây dựng đƣờng chuẩn 26 3.2.3 Kỹ thuật chuẩn bị mẫu 26 3.3 Tiến hành phân tích máy 28 3.4 Khảo sát đánh giá phƣơng pháp 28 3.4.1.Đánh giá hiệu suất thu hồi phƣơng pháp 28 3.4.2 Khảo sát độ lặp phƣơng pháp 28 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1 Xây dựng đƣờng chuẩn biểu diễn phụ thuộc tỷ lệ diện tích peak stevioside rebaudioside A vào nồng độ 29 4.2 Phƣơng pháp xử lý kết 35 4.3 Đánh giá phƣơng pháp 41 4.3.1 Đánh giá hiệu suất thu hồi phƣơng pháp 41 4.3.2 Đánh giá độ lặp phƣơng pháp 42 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 43 5.1 Kết luận 43 5.2 Đề xuất 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 LỜI CẢM ƠN Trong trình thực đồ án phịng thí nghiệm Hố thực phẩm, khoa Hoá học, trƣờng Đại học Vinh, Trung tâm Kiểm định An tồn thực phẩm mơi trƣờng trƣờng Đại học Vinh, ngồi nỗ lục thân, tơi nhận đƣợc nhiều giúp đỡ, bảo nhiệt tình thầy giáo, kỹ thuật viên,… Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: - Các thầy giáo khoa Hố – ngƣời tạo cho tảng lý thuyết, phƣơng pháp tiếp cận vấn đề để tơi hồn thành chƣơng trình - Cán bộ, kỹ thuật viên Trung tâm thí nghiệm trƣờng Đại học Vinh - Đặc biệt, xin chân thành cảm ơn ThS Lê Thế Tâm – Khoa Hoá học – trƣờng Đại học Vinh tận tình hứng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi suốt trình nghiên cứu hoàn thành đồ án - ThS Chu Thị Thanh Lâm tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình làm thí nghiệm, phân tích kết Trong suốt q trình thực tập viết báo cáo thân chƣa có nhiều kinh nghiệm kiến thức thực tiễn nên cịn có sai sót Kính mong nhận đƣợc đóng góp ý kiến thầy cô bạn để báo cáo đƣợc hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! Nghệ An, tháng 12 năm 2013 Sinh viên Lê Thị Thành DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tình hình sản xuất sử dụng cỏ số nƣớc Thế giới Bảng 1.2 Thành phần % chất cỏ 10 Bảng 1.3 Thành phần hố học chất tạo cỏ 10 Bảng 1.4 Tính chất số pha động sắc ký lỏng 20 Bảng 4.1 Kết thí nghiệm xây dựng đƣờng chuẩn rebaudioside A 29 Bảng 4.2 Kết thí nghiệm xây dựnng đƣờng chuẩn stevioside 29 Bảng 4.3 Kết phân tích rebaudioside A mẫu 36 Bảng 4.4 Kết phân tích stevioside mẫu 36 Bảng 4.5 Kết thí nghiệm xác định hiệu suất thu hồi phƣơng pháp 41 Bảng 4.6 Kết phân tích xác định độ lặp phƣơng pháp 42 Bảng 5.1 Kết phân tích hàm lƣợng stevioside rebaudioside A 43 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC CÁC HÌNH Hình i Tinh thể stevioside Hình 1.1 Cây cỏ (đã trổ hoa) Hình 1.2 Cây cỏ (chƣa trổ hoa) Hình 1.3 Cánh đồng cỏ Hình 1.4 Nhóm steviol 11 Hình 1.5 Cơng thức hóa học stevioside, gồm nhóm steviol liên kết với phân tử β – D – glucose sophorose 11 Hình 1.6 Sự liên kết steviol carbohydrate để tạo thành steviolmonoside, steviolbioside, stevioside rebaudioside A 12 Hình 1.7 104 Stevia 13 Hình 1.8 105 Stevia 14 Hình 1.9 Stevia Extract trắng bột 14 Hình 1.10 Stevia Plus Fiber Packets 15 Hình 1.11 Stevia dạng viên nén 15 Hình 1.12 Chè Artiso – Cỏ 16 Hình 1.13 Chè sâm quy – Cỏ 16 Hình 1.14 Chè 17 Hình 1.15 Chè thảo mộc 17 Hình 1.16 Lƣơng khơ Happy Life 17 Hình 1.17 Sơ đồ hệ thống HPLC 21 Hình 3.1 Sơ đồ chuẩn bị mẫu 27 Hình 4.1 Đƣờng chuẩn biểu mối quan hệ diện tích pic nồng độ rebaudioside A 30 Hình 4.2 Sắc đồ chuẩn rebaudioside A nồng độ 10ppm 30 Hình 4.3 Sắc đồ chuẩn rebaudioside A nồng độ 50ppm 31 Hình 4.4 Sắc đồ chuẩn rebaudioside A nồng độ 100ppm 31 Hình 4.5 Sắc đồ chuẩn rebaudioside A nồng độ 250ppm 32 Hình 4.6 Sắc đồ chuẩn rebaudioside A nồng độ 500ppm 32 Hình 4.7 Đƣờng chuẩn biểu mối quan hệ diện tích pic nồng độ stevioside 33 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 4.8 Sắc đồ chuẩn stevioside nồng độ 60ppm 33 Hình 4.9 Sắc đồ chuẩn stevioside nồng độ 100ppm 34 Hình 4.10 Sắc đồ chuẩn stevioside nồng độ 160ppm 34 Hình 4.11 Sắc đồ chuẩn stevioside nồng độ 200ppm 35 Hình 4.12 Sắc đồ mẫu cỏ khô 37 Hình 4.13 Sắc đồ mẫu cỏ tƣơi 37 Hình 4.14 Sắc đồ mẫu cành cỏ 38 Hình 4.15 Sắc đồ mẫu hoa cỏ 38 Hình 4.16 Sắc đồ mẫu cỏ 39 Hình 4.17 Sắc đồ mẫu cỏ tƣơi thêm chuẩn 39 Hình 4.18 Sắc đồ mẫu bánh lƣơng khô 40 Hình 4.19 Sắc đồ mẫu nƣớc lipovitan 40 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ACN: Acetonitrile DAD: Detector Diod Array HPLC : Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC/UV: Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao / tử ngoại MeOH: Methanol RSD : Độ lệch chuẩn tƣơng đối SKPB: Sắc ký phân bố SKPT: Sắc ký pha thƣờng SKPĐ: Sắc ký pha đảo THF: Tetrahydrofuran UBND: Uỷ ban nhân dân UV-VIS: Ultraviolet spectrophotometer – quang phổ tử ngoại khả kiến Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH CỘNG HÒA XÃ HỘ CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên : Lê Thị Thành Mã số sinh viên : 0952043561 Khóa : 50 Ngành : Công nghệ thực phẩm Tên đề tài: Nghiên cứu định lượng rebaudioside A cỏ số sản phẩm từ cỏ phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Nội dung nghiên cứu, thiết kế tốt nghiệp - Nghiên cứu tính chất vật lý, hóa học chất cỏ - Nghiên cứu định lƣợng rebaudioside A phƣơng pháp HPLC - Nghiên cứu hàm lƣợng rebaudioside A cỏ số mẫu thực phẩm chứa đƣờng cỏ - Đƣa số đề xuất hƣớng sản xuất đƣờng cỏ tƣơng lai Họ tên cán hƣớng dẫn : ThS Lê Thế Tâm Ngày giao nhiệm vụ đồ án : ngày tháng Ngày hoàn thành đồ án : ngày tháng năm 2013 năm 2013 Vinh, ngày tháng năm 2013 Chủ nhiệm môn Cán hƣớng dẫn (Ký, ghi rõ họ tên) (Ký, ghi rõ họ tên) Ngƣời duyệt (Ký, ghi rõ họ tên) 10 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH CỘNG HÒA XÃ HỘ CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên : Lê Thị Thành Mã số sinh viên : 0952043561 Khóa : 50 Ngành : Cơng nghệ thực phẩm Cán hƣớng dẫn : ThS Lê Thế Tâm Cán duyệt : Nội dung nghiên cứu, thiết kế Nhận xét cán hƣớng dẫn Ngày tháng năm 2013 Cán hƣớng dẫn (Ký, ghi rõ họ tên) MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Bốn ngàn năm trƣớc đây, ngƣời Ai Cập thích ăn đồ mật ong, trái chà Trong lăng mộ vua Toutankhamon thấy có chất glycerrhizin phát xuất từ cam thảo.Vào thời đại này, ngƣời sử dụng nhiều loại thức ăn, nhiều chất kích thích với liều dùng cao thƣờng xuyên nên phát sinh lệ thuộc, phá hủy sức khỏe Đơi lúc chất cịn tác dụng phần lên hệ thần kinh hay quan khác thể: cà phê, thuốc lá, rƣợu, muối….và đƣờng Ngày nay, giới ngƣời tiêu thụ khoảng 100 đƣờng hàng năm tính chất rẻ tiền, bùi miệng, đƣờng lại cần thiết cho việc phát dục thể Tuy nhiên, đƣờng có mặt trái nó, cung cấp nhiều lƣợng nên làm cho thể béo phì khơng phải dùng q độ Trong miệng, vi khuẩn chế tạo axit tác dụng lên Vì vậy, để tránh lên cân, hƣ răng, nhƣ bệnh nhân mắc chứng đái đƣờng, ngƣời ta buộc lòng phải kiêng cử dùng đƣờng lại, kiêng kẹo, kiêng kem, bỏ chè, bỏ nƣớc hay tốt dùng chất thay Chất phải cung cấp lƣợng có độ cao để sử dụng lƣợng Đồng thời, chất phải thỏa mãn điều kiện không đƣợc 11 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an phân hủy miệng có nƣớc miếng tác dụng không biến đổi môi trƣờng axit nhƣ đƣờng Hiện nay, thị trƣờng có nhiều sản phẩm hóa học tạo vị dùng để thay đƣờng (saccharin, sodium cyclamate, sucralose, acesulfame potassium, phổ biến chất aspartame) Những chất khơng có tính dinh dƣỡng, đặc biệt có vị cao gấp trăm lần so với đƣờng nhƣng lại cho calorie có khoảng 2,2 calo cho gói nhỏ muỗng cafe đƣờng sinh tới 16 calo Các chất hóa học xuất hầu hết loại thức ăn thức uống ngày Mặc dù chúng rẻ tiện dụng nhƣng ngƣời ta e ngại chúng ảnh hƣởng lâu dài đến sức khỏe Qua số nguyên cứu tác hại chúng saccharin bị cấm sử dụng số quốc gia thí nghiệm cho thấy tạo ung thƣ bàng quang lồi chuột Đối với ngƣời mắc bệnh phenylketonuria khơng nên dùng aspartame Đây bệnh di truyền thấy, lệch lạc gene thể không sản xuất đƣợc enzyeme khử bỏ chất phenylalanine Khi ăn vào, aspartame phân thành aspartid acid phenylalanine, chất tích tụ não gây tổn hại cho hệ thần kinh trung ƣơng chết Trƣớc nguy hại chất hóa học, tâm lý chung ngƣời tiêu dùng muốn tìm lại sản phẩm thực phẩm từ thiên nhiên Trong nhóm chất tạo vị từ thiên nhiên đƣờng có cỏ ngày đƣợc nhiều ngƣời ý đến Đƣờng cỏ ngày đƣợc sử dụng phổ biến rộng rãi toàn giới Nghiên cứu cho thấy có hợp chất tạo vị cỏ stevioside (5 – 10%), rebaudioside A (2 – 4%), rebaudioside C (1 – 2%) dulcoside A (0,5 – 1%) Trong năm gần đây, cỏ đƣợc đƣa vào trồng sử dụng số khu vực Việt Nam Các thành phần cỏ nguyên liệu đƣợc sử dụng chủ yếu công nghiệp thực phẩm y dƣợc học Trên thị trƣờng Việt Nam có nhiều sản phẩm đƣờng cỏ đƣợc sử dụng nhƣ thực phẩm ăn kiêng, thực phẩm chức năng,… Trong thành phần hoá học tạo vị cây cỏ stevioside rebaudioside A hợp chất tạo độ Để xác định xác hàm lƣợng loại đƣờng cỏ số sản phẩm thực phẩm, chọn đề tài ‘‘Nghiên 12 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 4.5 Sắc đồ chuẩn rebaudioside A nồng độ 250ppm Hình 4.6 Sắc đồ chuẩn rebaudioside A nồng độ 500ppm 40 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 4.7 Đƣờng chuẩn biểu mối quan hệ diện tích pic nồng độ stevioside Phƣơng trình quy hồi: y = 15,18x – 2,492 Hệ số tƣơng quan: r2 = 0.999 Hình 4.8 Sắc đồ chuẩn stevioside nồng độ 60ppm 41 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 4.9 Sắc đồ chuẩn stevioside nồng độ 100ppm Hình 4.10 Sắc đồ chuẩn stevioside nồng độ 160ppm 42 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 4.11 Sắc đồ chuẩn stevioside nồng độ 200ppm 4.2 Phƣơng pháp xử lý kết Dựa vào phƣơng trình đƣờng chuẩn Từ giá trị diện tích peak đo đƣợc ta tính hàm lƣợng stevioside, rebaudioside A (µg/ml) Hàm lƣợng stevioside,rebaudioside A (mg/kg) có mẫu tính theo cơng thức: C Co  V  F m Trong đó: C : nồng độ stevioside/ rebaudioside A có mẫu, tính mg/kg Co: nồng độ stevioside/ rebaudioside A dịch chiết tính từ đƣờng chuẩn, µg/ml m: khối lƣợng mẫu lấy để phân tích, g F: hệ số pha lỗng (nếu có) Q trình phân tích mẫu cỏ áp vào đƣờng chuẩn ta tính đƣợc Co, xử lý số liệu theo công thức kết đƣợc tóm tắt bảng sau: 43 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Bảng 4.3 Kết phân tích rebaudioside A mẫu STT Mẫu Khối TB diện tích C0 C lƣợng (g) peak (µg/ml) (mg/g) Cỏ tƣơi 0.5002 1569.7071 337.7196 6.7544 Hoa cỏ tƣơi 0.5001 470.4135 98.5867 1.9717 Lá cỏ tƣơi 0.5002 1142.0710 244.6946 14.6817 Cành cỏ tƣơi 0.5003 116.4436 32.0282 0.6406 Cỏ tƣơi thêm chuẩn 0.5000 2200.2608 474.8860 9.4977 Cỏ khô 0.5001 1080.2591 231.2484 13.8749 Lƣơng khô 0.5000 339.9999 70.2175 1.4044 Lipovitan ml 417.1584 87.0020 3.4801 Bảng 4.4 Kết phân tích stevioside mẫu STT Mẫu Khối TB diện tích C0 C lƣợng (g) peak (µg/ml) (mg/g) Cỏ tƣơi 0.5002 1423.1109 Hoa cỏ tƣơi 0.5001 846.5342 55.9306 1.1186 Lá cỏ tƣơi 0.5002 1197.3533 79.0412 4.7425 Cành cỏ tƣơi 0.5003 153.9879 10.3083 0.2061 Cỏ khô 0.5001 5890.3349 388.1968 23.2918 Lƣơng khô 0.5000 95.2834 6.4411 0.1288 Lipovitan ml 1259.0193 83.1035 3.3241 44 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 95.4656 1.9093 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 4.12 Sắc đồ mẫu cỏ khơ Hình 4.13 Sắc đồ mẫu cỏ tƣơi 45 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 4.14 Sắc đồ mẫu cành cỏ Hình 4.15 Sắc đồ mẫu hoa cỏ 46 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 4.16 Sắc đồ mẫu cỏ Hình 4.17 Sắc đồ mẫu cỏ tƣơi thêm chuẩn 47 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 4.18 Sắc đồ mẫu bánh lƣơng khơ Hình 4.19 Sắc đồ mẫu nƣớc lipovitan 48 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 4.3 Đánh giá phƣơng pháp định lƣợng 4.3.1 Đánh giá hiệu suất thu hồi phƣơng pháp Để đánh giá hiệu suất thu hồi phƣơng pháp tiến hành phân tích mẫu cỏ tƣơi theo quy trình với phƣơng pháp thêm chuẩn - Mẫu 1: mẫu cỏ tƣơi không thêm chuẩn - Mẫu 2: mẫu cỏ tƣơi thêm chuẩn Hiệu suất thu hồi đƣợc xác định theo công thức sau: Cmẫu - Cblank H= × m × 100% Cspike Trong đó: Cmẫu: Hàm lƣợng rebaudioside A có mẫu có thêm chuẩn (μg/kg) Cblank: Hàm lƣợng rebaudioside A có mẫu không thêm chuẩn (μg /kg) Cspike: Hàm lƣợng chuẩn rebaudioside A cho vào mẫu (µg) m: Lƣợng cân mẫu thử (g) Mẫu 1: Mẫu cỏ tƣơi đƣợc tách chiết theo quy trình chuẩn bị mẫu Mẫu : Tiến hành nhƣ mẫu nhƣng có thêm 1ml chuẩn rebaudioside A 10 μg /ml Để đánh giá xác hiệu suất thu hồi, ta tiến hành phân tích lặp lại lần mẫu đƣợc tách chiết theo quy trình Qua kết thí nghiệm ta thu đƣợc kết nhƣ bảng sau : Bảng 4.5 Kết thí nghiệm xác định hiệu suất thu hồi phƣơng pháp Mẫu Lần Khối lƣợng Diện tích peak (g) Cmẫu Cspike Hiệu suất (µg/kg) (ppm) % 0.5002 1569.7071 6.7544 0.5001 2191.0688 9.4577 10 135.17 0.5000 2209.4539 9.5377 10 139.17 0.5001 2200.2600 9.4977 10 137.17 Giá trị trung bình H% là: n x =  x = 137,166 % n i 1 49 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Độ lệch chuẩn: n s  (x n 1  x) i 7,9976 = = n 1 3,9976 = 1,9997 Độ lệch chuẩn tƣơng đối: RSD(%) = 1,9992  100 S 100 = = 1,4579 137,166 x Qua kết phân tích cho thấy, phƣơng pháp có độ cao, hiệu suất thu hồi cao, tỷ lệ % trung bình tìm thấy chất phân tích 137,17%, đáp ứng yêu cầu phân tích 4.3.2 Đánh giá độ lặp phƣơng pháp Đánh giá độ lặp dựa độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD%) Thực phân tích 0,5g mẫu cỏ tƣơi, lặp lại lần điều kiện Kết diện tích thu đƣợc áp vào đƣờng chuẩn ta thu đƣợc nồng độ chất phân tích có mẫu nhƣ sau: Bảng 4.6 Kết phân tích xác định độ lặp phƣơng pháp STT Khối lƣợng (g) Diện tích peak Hàm lƣợng rebaudioside A (µg/ml) 0.5001 1568.8267 337.5281 0.5002 1568.8267 337.5281 0.5000 1571.4680 338.1027 Giá trị hàm lƣợng rebaudioside A mẫu cỏ tƣơi : n x =  x = 337,7196 (µg/ml) n i 1 Độ lệch chuẩn: n s  (x n 1 i  x) n 1 0,2201 = = 0,1101 = 0,332 Độ lệch chuẩn tƣơng đối: RSD(%) = 0,332  100 S 100 = = 0,098 337,7196 x Kết cho thấy phƣơng pháp có độ lặp cao, đáp ứng yêu cầu định lƣợng CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 50 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 5.1 Kết luận Căn vào nhiệm vụ đề tài đồ án hoàn thành đƣợc nhiệm vụ sau: * Về lý thuyết: - Lý thuyết chung cỏ - Tìm hiểu đƣợc tổng quan phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC - Lý thuyết rebaudioside A stevioside * Về thực nghiệm: - Đã nghiên cứu quy trình xác định hàm lƣợng rebaudioside A stevioside mẫu cỏ sản phẩm thực phẩm chứa đƣờng cỏ - Đã xác định hàm lƣợng rebaudioside A stevioside mẫu cỏ sản phẩm thực phẩm chứa đƣờng cỏ phƣơng pháp HPLC: Bảng 5.1 Kết phân tích hàm lƣợng stevioside rebaudioside A Hàm lƣợng rebaudioside A (g/kg) Hàm lƣợng stevioside (g/kg) Cỏ tƣơi 6.7544 1.9093 Cỏ khô 13.8749 23.2918 Lƣơng khô 1.4044 0.1288 Lipovitan 3.4801 3.3241 Mẫu - Đã xác định đƣợc độ thu hồi trung bình rebaudioside A mẫu cỏ tƣơi 137,17% - Đã xác định độ lặp lại rebaudioside A mẫu cỏ tƣơi với độ lệch chuẩn tƣơng đối: RSD(%) = 0,098% 5.2 Kiến nghị 51 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Với kết thu đƣợc đồ án góp phần đánh giá hàm lƣợng rebaudioside A stevioside cỏ mẫu chứa cỏ khác Chúng tơi hi vọng quy trình phân tích áp dụng để phân tích định lƣợng rebaudioside A va stevioside mẫu thực phẩm khác chất cỏ thay đƣờng glucose tƣơng lai 52 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Nguyễn Bá Hoài Anh, 2003 Đại cương sắc ký lỏng NXB Đại học quốc gia TP HCM [2] Nguyễn Tiến Bân (Chủ biên), 2003 Danh mục loài thực vật Việt Nam Nhà xuất Nơng nghiệp, Hà Nội [3] Phan Đức Bình, Võ Huấn, 2002 Cây Cỏ Steviosid [4] Nguyễn Thƣợng Dong cộng sự, 2006 Nghiên cứu thuốc từ thảo dược Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội [5] Quách Đĩnh, Nguyễn Văn Thoa, Nguyễn Văn Tiếp, 1996 Công nghệ sau thu hoạch chế biến rau NXB KHKT [6] Trần Bích Lam, Tơn Nữ Minh Nguyệt, Đinh Trần Nhật Thu Thí nghiệm hố sinh thực phẩm NXB ĐHQG TP.HCM [7] Võ Thị Thừa, đồ án tốt nghiệp, 2010 Quy trình sản xuất đường ăn kiêng từ cỏ Khoa CNTP, ĐH kỹ thuật công nghệ TPHCM [8] Đào Hữu Vinh, Nguyễn Xuân Dũng, Trần Thị Mỹ Kinh, Phạm Hùng Việt, 1985 Các phương pháp sắc ký Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội [9] N W Megeji, J K Kumar, Virendra Sing, V K Kaul and P S Ahuja, 2005 Intruducing Stevia rebaudiana, a natural zero-calorie sweetener CURENT SCIENCE, 88(5), 801 – 804 [10] N.Kolb, J L Herrera, D J Ferreyra and R F Uliana, 2001 Analysis of Sweet Diterpene Glycosides from Stevia rebaudiana: Improved HPLC Method J.Agricultural and Food Chem, 49, 4538 – 4541 [11] Isocratic Stevia Sweetener Analysis using Selective ZORBAX Columns”, Agilent Application Note, Publication Number 5990 – 3933EN, 2012 [12] Geuns J M C.(2003) Molecules of Interest: Stevioside Phytochemistry 64, 913 – 921 [13] Annie Shirwaikar, Vinit Parmar, Jay Bhagat and Saleemulla Khan, Departmen of Pharmacognosy, manipal College of pharmaceutical Sciences, Manipal, India Identification and estimation of stevioside in the commercial samples of stevia leaf and powder by HPTLC and HPLC 53 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn