Nghiên ứu sản xuất kháng huyết thanh rubella sử dụng ho kiểm định vắ xin tại việt nam

Hình ảnh tế bào vero sử dụng kháng huyết thanh Nhật Bản A, POLYVAC sản xuất B và tế bào đối chứng .... Hình ảnh tế bào PRK sử dụng kháng huyết thanh Nhật Bản A, POLYVAC sản xuất B và t ế

Trang 1

TRƯỜNG ĐẠ I H C BÁCH KHOA HÀ N I Ọ Ộ -

PHẠM THÀNH TRƯỜNG

1 PGS.TS TRƯƠNG QUỐC PHONG

Hà N i - ộ Năm 20 18

Formatted: Font: Times New Roman

Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 17057205065071000000

Trang 2

L ỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan, đây là công trình nghiên cứu khoa h c c a tôi và các c ng ọ ủ ộ

s trong phòng Kiự ểm định vắc xin dướ ự hưới s ng d n cẫ ủa PGS.TS Trương Quốc Phong và TS Ngô Thu Hường Các s li u, k t qu trong luố ệ ế ả ận văn là trung thực và chưa từng được ai công b trong b t k công trình nào khác ố ấ ỳ

H c viên ọ

Phạm Thành Trường

Xác nh ậ n của cơ quan (Trung tâm Nghiên c Sứu ản xuất Vắc xin và Sinh ph m Y tẩ ế)

Trang 3

Tôi xin bày t lòng biỏ ết ơn chân thành tới:

c Phong, Trung tâm nghiên c u và phát tri n công ngh

Trong th i gian h c t p và nghiên c u v a qua, tôi luôn nhờ ọ ậ ứ ừ ận được s ự giúp đỡ

và tạo điều ki n c a th y cô trong Vi n công ngh sinh h c và công ngh c phệ ủ ầ ệ ệ ọ ệthự ẩm

và các thầy cô trong Phòng Đào tạo Trường Đạ ọ- i h c bách khoa Hà N i Tôi xin chân ộthành cảm ơn những s ự giúp đỡ quý báu đó

Toàn b n i dung nghiên c u trong khóa luộ ộ ứ ận này được th c hi n và hoàn thành ự ệ

t i phòng Kiạ ểm định v c xin, Trung tâm Nghiên c u, s n xu t v c xin và sinh ph m y ắ ứ ả ấ ắ ẩ

t (POLYVAC) Tôi xin chân thành cế ảm ơn sự giúp đỡ quý báu c a t p th cán b ủ ậ ể ộphòng Kiểm định đã tạo điều ki n và nhiệ ệt tình giúp đỡ tôi trong th i gian th c hiờ ự ện đềtài

Nhân đây tôi xin gử ờ ảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạ

c u, s n xu t v c xin và sinh ph m y t (POLYVAC) c nhân Nguy n Xuân Hòa - ứ ả ấ ắ ẩ ế ử ễTrưởng phòng S n xu t v c xin S i bán thành phả ấ ắ ở ẩm, nơi tôi đang công tác, đã tạo m i ọđiều ki n thu n lợệ ậ i cho tôi trong su t th i gian h c t p và nghiên c u ố ờ ọ ậ ứ

quan tâm giúp đỡ và động viên tôi trong su t th i gian h c t p và hoàn thành khóa ố ờ ọ ậluận này

Hà Nội, Ngày tháng năm 2018

H c viên ọ

Phạm Thành Trường

Trang 4

CÁC CH Ữ VIẾT TẮ T

BHKCPE Baby hamster kidney: t bào th n c a chuế ậ ủ ột đồng sơ sinh.Cytopathic

effect (đám hoạ ử ếi t t bào)CPE Cytopathic effect (đám hoạ ử ếi t t bào)

CFA Freund’s Complete Adjuvants (Ttá dược hoàn ch nh) ỉ

FL T ế bào ung thư màng ối người

GMP Good Manufacturing Practice ( h c hành s n xutT ự ả ất tốt)

HI Haemagglutination Inhibition (Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng c ầu)

IFA Freund’s Incomplete Adjuvants (tTá dược không hoàn ch nh) ỉ

MEM Minimum Essential Medium (mMôi trường c n thiầ ết tối thi ểu)

MR Measles-Rubella (M u v c xin phẫ ắ ối hợ ởi p s -– rubella )

MS Master Seed (ch ng gi ng g ủ ố ốc)

OSS Out of speciﬁcation (ngoài tiêu chu ẩn)

PBS Phosphate Buﬀered Saline (dung dịch đệm mu i ph t phát) ố ố

POLYVAC Trung tâm Nghiên cứu, sản xuất Vắc xin và Sinh ph m Y t ẩ ế

RK13 T bào th n th Newzealand (dòng t ế ậ ỏ ế bào thường tr ực)

SPF Speciﬁc Pathogen Free (không ch a tác nhân gây bứ ệnh)

TRYPSIN-EDTA Trypsin-Ethylen Diamine Tetra Acetic acid

Formatted Table Formatted: Font: (Default) Times New Roman, pt, 13 Not Bold, Font color: Auto

Formatted: Font: (Default) Times New Roman, pt, 13 Font color: Auto

Formatted: Font: (Default) Arial, 12 pt

Formatted: Font color: Auto

Formatted: Default Paragraph Font, Font: (Default) Times New Roman, pt, Not Bold, 13 Font color: Auto, Pattern: Clear

Trang 5

Vero T bào n kh xanh châu phi (dòng t ế thậ ỉ ế bào thường tr ực)WFI Water for injection (nước pha tiêm)

WHO World Health Organization (T ổchức y t ếthế giới)

Trang 6

DANH M C CÁC HÌNH Ụ

Hình 1.1 Hình ảnh cấu trúc virus rubella 44

Hình 1.2 Cấu trúc virus Rubella dưới kính hiển vi điện tử 55

Hình 1.3 S sâm nh p và nhân lên c a virus ự ậ ủ 77

Hình 1.4 Phân tích vùng gen đảm nhi m chệ ức năng nhạy c m v i nhiả ớ ệt độ ủ c a virus Rubella 1111

Hình 1.5 T o virus thay th vùng p150 virus rubella và tính nh y c m v i nhiạ ế ở ạ ả ớ ệt độ 1212

Hình 2.1 Hình nh quy trình l y máu toàn b và thu huy t thanh l n ả ấ ộ ế ợ 3331

Hình 2.2 Hình nh quy trình tiêm và thu h i máu th ả ồ ỏ 3634

Hình 2.3 Đọc k t qu mycoplasma d a trên màu sế ả ự ắc môi trường 3735

Hình 2.4 Hình nh chuả ẩn đ ngượộ c kháng nguyên HA 3936

Hình 2.5 Hình nh chuả ẩn độ u giá kháng th hiệ ểHI 3937

Hình 2.6 Hình nh plaque trên giả ếng 4139

Hình 2.7 Hình ảnh đám hủy hoại bởi virus rubella trên kính hi n vi hu nh quang ể ỳ 4240 Hình 3.1 Hi u giá kháng nguyên rubella c a các quy trình nghiên c u ệ ủ ứ 4543

Hình 3.2 Hi u giá kháng huyệ ết thanh thu được ở các nhóm l n th nghi m ợ ử ệ 4745

Hình 3.3 Hi u giá kháng huyệ ết thanh thu được ở các nhóm th nghi mỏthử ệ 5451

Hình 3.4 Hình nh t bào vero, PRK, RK13 m u có virus, mả ế ở ẫ ẫu virus được trung hòa b i kháng huy t thanh và mở ế ẫu đối chứng 6157

Hình 3.5 Hình ảnh tế bào vero sử dụng kháng huyết thanh Nhật Bản (A), POLYVAC sản xuất (B) và tế bào đối chứng 6359

Hình 3.6 Hình nh t bào FL s d ng kháng huy t thanh Nh t B n (A), POLYVAC ả ế ử ụ ế ậ ả sản xuất (B) và t ế bào đối chứng 6460

Hình 3.7 Hình ảnh tế bào PRK sử dụng kháng huyết thanh Nhật Bản (A), POLYVAC

sản xuất (B) và t ế bào đối ch ng ứ 6561

Hình 3 8 Hình ảnh plaque virus rubella (đốm bắt màu đen) trong thử nghiệm hiệu giá

và ổn định nhiệt sử dụng kháng huyết thanh Nhật Bản (A) và POLYVAC sản xuất (B)

Field Code Changed Formatted: Font: Times New Roman, pt, 13 Font color: Auto

Formatted: Font: Times New Roman, 13 pt

Trang 7

6662

Hình 3.9 Hi u giá trung bình các t v c xin và m u chu n Rb-R0113 s d ng kháng ệ loạ ắ ẫ ẩ ử ụ huy t thanh Nhế ật Bản và kháng huy t thanh do POLYVAC sế ản xuấ t 6763 Hình 3.10 Độ gi m hi u giá trung bình trong th nghi m ả ệ ử ệ ổn định nhi t các lo t v c ệ ạ ắ xin và m u chu n Rb-R0113 s d ng kháng huy t thanh Nh t B n và kháng huyẫ ẩ ử ụ ế ậ ả ết thanh do POLYVAC sản xuấ t 6964 Hình 3.11 Hình ảnh nhận dạng virus rubella (đám tế bào phát màu xanh sáng) sử dụng kháng huyết thanh Nhật Bản (A) và POLYVAC sản xuất (B) 7065

Hình 1.4 Phân tích vùng gen đảm nhi m chệ ức năng nhạy c m v i nhiả ớ ệt độ ủ c a virus Rubella 1111

Hình 1.5 T o virus thay th vùng p150 virus rubella và tính nh y c m v i nhiạ ế ở ạ ả ớ ệt độ 1212

Hình 2.3 Đọc k t qu mycoplasma d a trên màu sế ả ự ắc môi trường 3535

Hình 2.4 Hình nh chuả ẩn đ ngượộ c kháng nguyên HA 3636

Hình 2.7 Hình ảnh đám hủy hoại bởi virus rubella trên kính hi n vi hu nh quang ể ỳ 4040 Hình 3.1 Hi u giá kháng nguyên rubella c a các quy trình nghiên c u ệ ủ ứ 4343

Hình 3.4 Hình nh t bào vero, PRK, RK13 m u có virus, mả ế ở ẫ ẫu virus được trung hòa b i kháng huy t thanh và mở ế ẫu đối chứng 5757

Hình 3.5 Hình ảnh tế bào vero sử dụng kháng huyết thanh Nhật Bản (A), POLYVAC Formatted: Font: Times New Roman, pt, 13 Font color: Auto Formatted: Font: Times New Roman, 13 pt Formatted: Font: Times New Roman, pt, 13 Font color: Auto Formatted: Font: Times New Roman, 13 pt Formatted

Formatted

Formatted: Font: 13 pt, Font color: Auto

Trang 8

sản xuất (B) và tế bào đối chứng 5959

Hình 3.6 Hình nh t bào FL s d ng kháng huy t thanh Nh t B n (A), POLYVAC ả ế ử ụ ế ậ ả sản xuất (B) và t ế bào đối chứng 6060

Hình 3.7 Hình ảnh tế bào PRK sử dụng kháng huyết thanh Nhật Bản (A), POLYVAC sản xuất (B) và t ế bào đối ch ng 6161 ứ Hình 3 8 Hình ảnh plaque virus rubella (đốm bắt màu đen) trong thử nghiệm hiệu giá và ổn định nhiệt sử dụng kháng huyết thanh Nhật Bản (A) và POLYVAC sản xuất (B) 6262

Hình 3.9 Hi u giá trung bình các lo t v c xin và m u chu n Rb-R0113 s d ng kháng ệ ạ ắ ẫ ẩ ử ụ huy t thanh Nhế ật Bản và kháng huy t thanh do POLYVAC sế ản xuấ 6363 t Hình 3.10 Độ gi m hi u giá trung bình trong th nghi m ả ệ ử ệ ổn định nhi t các lo t v c ệ ạ ắ xin và m u chu n Rb-R0113 s d ng kháng huy t thanh Nh t B n và kháng huy t ẫ ẩ ử ụ ế ậ ả ế thanh do POLYVAC sản xuấ 6464 t Hình 3.11 Hình ảnh nhận dạng virus rubella (đám tế bào phát màu xanh sáng) sử dụng kháng huyết thanh Nhật Bản (A) và POLYVAC sản xuất (B) 6565

Hình 2.3 Đọc k t qu mycoplasma d a trên màu s c môi trư ng 32 ế ả ự ắ ờ Hình 2.4 Hình nh chuả ẩn đ ngượộ c kháng nguyên HA 34

Hình 2.7 Hình ảnh đám hủy hoại bởi virus rubella trên kính hi n vi hu nh quang ể ỳ 37

Hình 3.1 Hi u giá kháng nguyên rubella c a các quy trình nghiên c u ệ ủ ứ 40

Trang 9

Hình 3.4 Hình ảnh tế bào vero sử dụng kháng huyết thanh Nhật Bản (A), POLYVAC

sản xuất (B) và tế bào đối chứng 55

Hình 3.5 Hình nh t bào FL s d ng kháng huy t thanh Nh t B n (A), POLYVAC ả ế ử ụ ế ậ ả

sản xuất (B) và t ế bào đối chứng 56

Hình 3.6 Hình ảnh tế bào PRK sử dụng kháng huyết thanh Nhật Bản (A), POLYVAC

sản xuất (B) và t ế bào đối chứng 57

Hình 3 7 Hình ảnh plaque virus rubella (đốm bắt màu đen) trong thử nghiệm hiệu giá

và ổn định nhiệt sử dụng kháng huyết thanh Nhật Bản (A) và POLYVAC sản xuất (B)

58

Hình 3.8 Hi u giá trung bình các lo t v c xin và m chu n Rb-R0113 s d ng kháng ệ ạ ắ ẫu ẩ ử ụ

huy t thanh Nhế ật Bản và kháng huy t thanh do POLYVAC sế ản xuấ 59 t

Hình 3.9 Độ ả gi m hi u giá trung bình trong th nghi m ệ ử ệ ổn định nhi t các lo t v c xin ệ ạ ắ

và m u chu n Rb-R0113 s d ng kháng huy t thanh Nh t B n và kháng huy t thanẫ ẩ ử ụ ế ậ ả ế h

do POLYVAC sản xuấ 60 t

Hình 3.10 Hình ảnh nhận dạng virus rubella (đám tế bào phát màu xanh sáng) sử dụng

kháng huyết thanh Nhật Bản (A) và POLYVAC sản xuất (B) 61

Trang 10

DANH M C CÁC B NG, BI Ụ Ả ỂU ĐỒ

B ảng 1.1 Các đườ ng tiêm khi s d ng và không s d ử ụ ử ụng tá dượ c 1717

B ng 1.2 Th tích tiêm tả ể ối đa của h n hỗ ợp kháng nguyên/tá dược trên m t v trí tiêm ộ ị ở

các loài động v t khác nhau ậ 1818

B ng 2.1 Quy trình tiêm lả ợn tạo kháng huy t thanh các nhóm th ế ở ửnghiệ m 2726

B ng 2.2 Quy trình tiêm th t o kháng huy t thanh các nhóm ả ỏ ạ ế ở thử nghiệ m 3432

B ng 3.1 Tả ối ưu hoá thời điểm thay môi trường quy trình s n xu t kháng nguyên ả ấ

rubella 4442

B ng 3.2 K t qu ả ế ảhiệu giá kháng huy t thanh lế ợn của các nhóm th nghi m ử ệ 4644

B ng 3.3 K t qu u giá kháng huy t thanh th c a các nhóm th nghi m ả ế ảhiệ ế ỏ ủ ử ệ 5350

B ng 3.4 K t qu m tra chả ế ảkiể ất lượng kháng huy t thanh trên th và l n ế ỏ ợ 5855

B ng 3.5 K t qu u giá trên các lo t v c xin và m u chu n Rb-R0113 s d ng ả ế ảhiệ ạ ắ ẫ ẩ ử ụ kháng huy t thanh Nhế ật Bản và kháng huy t thanh do POLYVAC sế ản xuấ t 6662 B ng 3.6 K t qu ả ế ả ổn định nhi t trên các lo t v c xin và m u chu n Rb-R0113 s d ng ệ ạ ắ ẫ ẩ ử ụ kháng huy t thanh Nhế ật Bản và kháng huy t thanh do POLYVAC sế ản xuấ t 6864 Bảng 1.1 Các đường tiêm khi s d ng và không s dử ụ ử ụng tá dược 1717

B ng 1.2 Th tích tiêm tả ể ối đa của h n hỗ ợp kháng nguyên/tá dược trên m t v trí tiêm ộ ị ở các loài động v t khác nhau 1818 ậ B ng 2.1 Quy trình tiêm lả ợn tạo kháng huy t thanh các nhóm th ế ở ửnghiệ 2626 m B ng 2.2 Quy trình tiêm th t o kháng huy t thanh các nhóm th ả ỏ ạ ế ở ửnghiệ 3232 m B ng 3.1 Tả ối ưu hoá thời điểm thay môi trường quy trình s n xu t kháng nguyên ả ấ rubella 4242

B ng 3.2 K t qu u giá kháng huy t thanh l n c a các nhóm th nghi m ả ế ảhiệ ế ợ ủ ử ệ 4444

B ng 3.5 K t qu u giá trên các lo t v c xin và m u chu n Rb-R0113 s d ng ả ế ảhiệ ạ ắ ẫ ẩ ử ụ

kháng huy t thanh Nhế ật Bản và kháng huy t thanh do POLYVAC sế ản xuấ 6262 t

Field Code Changed Formatted: Font color: Auto

Trang 11

B ng 3.6 K t qu ả ế ả ổn định nhi t trên các lo t v c xin và m u chu n Rb-R0113 s d ng ệ ạ ắ ẫ ẩ ử ụ

Bảng 1.1 Các đường tiêm khi s d ng và không s dử ụ ử ụng tá dược 15

B ng 1.2 Th tích tiêm tả ể ối đa của h n hỗ ợp kháng nguyên/tá dược trên m t v trí tiêm ộ ị ở các loài động v t khác nhau 16 ậ B ng 2.1 Quy trình tiêm lả ợn tạo kháng huy t thanh các nhóm th ế ở ửnghiệ 24 m B ng 2.2 Quy trình tiêm th t o kháng huy t thanh các nhóm th ả ỏ ạ ế ở ửnghiệ 29 m B ng 3.1 Tả ối ưu hoá thời điểm thay môi trường quy trình s n xu t kháng nguyên ả ấ rubella 39

B ng 3.2 K t qu u giá kháng huy t thanh lả ế ảhiệ ế ợn của các nhóm th nghi m ử ệ 41

B ng 3.5 K t qu u giá trên các lo t v c xin và m u chu n Rb-R0113 s d ng ả ế ảhiệ ạ ắ ẫ ẩ ử ụ kháng huy t thanh Nhế ật Bản và kháng huy t thanh do POLYVAC sế ản xuấ 58 t B ng 3.6 K t qu ả ế ả ổn định nhi t trên các lo t v c xin và m u chu n Rb-R0113 s d ng ệ ạ ắ ẫ ẩ ử ụ kháng huy t thanh Nhế ật Bản và kháng huy t thanh do POLYVAC sế ản xuấ 60 t Bảng 1.1 Các đường tiêm khi s d ng và không s dử ụ ử ụng tá dược 15

B ng 1.2 Th tích tiêm tả ể ối đa của h n hỗ ợp kháng nguyên/tá dược trên m t v trí tiêm ộ ị ở các loài động v t khác nhau 16 ậ B ng 2.1 Quy trình tiêm lả ợn tạo kháng huy t thanh các nhóm th ế ở ửnghiệ 24 m B ng 2.2 Quy trình tiêm th t o kháng huy t thanh các nhóm th ả ỏ ạ ế ở ửnghiệ 29 m Bảng 3.1 Tối ưu hoá thời điểm thay môi trường quy trình s n xu t kháng nguyên ả ấ rubella 39

B ng 3.2 K t qu u giá kháng huy t thanh lả ế ảhiệ ế ợn của các nhóm th nghi m ử ệ 41

B ng 3.5 K t qu u giá trên các lo t v c xin và m u chu n Rb-R0113 s d ng ả ế ảhiệ ạ ắ ẫ ẩ ử ụ

Trang 12

B ng 3.6 K t qu ả ế ả ổn định nhi t trên các lo t v c xin và m u chu n Rb-R0113 s d ng ệ ạ ắ ẫ ẩ ử ụ

Field Code Changed

Trang 13

M C L C Ụ Ụ

M U Ở ĐẦ 11

T NG QUAN TÀI LI U Ổ Ệ 33

1.1 Đặc điể m sinh h c, mi n d ch c a virus rubella ọ ễ ị ủ 33 1.1.1 Cấu trúc virus Rubella 33

1.1.2 Tính ch t kháng nguyên virusấ 44

1.1.3 Tính ch t lý hóa c a virus Rubellaấ ủ 55

1.1.4 Đặc điểm quá trình phát tri n của virusể 55

1.1.5 Ph n ả ứng miễn dịch trong nhi m rubella ễ 77 1.2 Quá trình nghiên c u và phát tri n v c xin rubella ứ ể ắ 88

1.2.1 Tình hình nghiên c u và s n xu t v c xin rubella trên th ứ ả ấ ắ ế ớigi 88

1.2.2 Tình hình s n xuả ất vắc xin rubella tại Việt Nam 99

1.3 Tình hình s n xu t kháng th ả ấ ể đa dòng ở độ ng v t ậ 1212

1.3.1 Ch n lọ ọc và chăm sóc động vật 1313

1.3.2 Quy trình gây mi n dễ ịch 1514

1.4 Tình hình s n xu t và s d ng kháng huy t thanh trong ki ả ấ ử ụ ế ểm đị nh v c xin ắ 2120

Chương 2 VẬ T LI ỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U 2322

2.1 V Ậ T LIỆ U, HÓA CH T VÀ THI T B Ấ Ế Ị 2322

2.1.1 Vật liệu 2322

2.1.2 Hóa ch t và thiấ ết bị 2322

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U Ứ 2423 2.2.1 Phương pháp sản xu t kháng nguyên rubellaấ 2423

2.2.2 Phương pháp sản xu t kháng huy t thanhấ ế 2524

2.2.3 Phương pháp kiểm tra ch t lư ng kháng huy t thanhấ ợ ế 3634

2.2.4 Các quy trình kiểm đị ứnh ng dụng kháng huy t thanhế 4037

Chương 3 Ế K T QU VÀ TH O LU N Ả Ả Ậ 4442 3.1 Xây d ng quy trình s n xu t kháng nguyên rubella ự ả ấ 4442

3.2 Quy trình s n xu t kháng huy t thanh ả ấ ế 4644

3.2.1 Quy trình s n xu t kháng huy t thanh trên l nả ấ ế ợ 4644

3.2.2 Quy trình s n xu t kháng huy t thanh trên thả ấ ế ỏ 5350

Formatted: Font: 13 pt

Field Code Changed Formatted: Font: Times New Roman, pt, 13 Font color: Auto

Trang 14

3.3 Kiể m tra ch t lư ng kháng huy ấ ợ ết thanh thu đượ c 5855

3.4 Ứ ng d ng kháng huy ụ ết thanh rubella thu đượ c trong ki ểm đị nh v c xin ắ rubella 6258

3.4.1 Ứng dụng kháng huy t thanh rubella s n xu t từ ợế ả ấ l n trong kiểm định v c ắ xin 6258

3.4.2 Ứng dụng kháng huy t thanế h sản xu t từ ỏấ th trong kiểm định vắc xin6561 K Ế T LUẬ N 7166 KIẾ N NGH Ị 7267 M U Ở ĐẦ 11

T NG QUAN TÀI LI U Ổ Ệ 33

1.1 Đặc điể m sinh h c, mi n d ch c a virus rubella 33 ọ ễ ị ủ 1.1.1 Cấu trúc virus Rubella 33

1.1.5 Ph n ả ứng miễn dịch trong nhiễm rubella 77

1.2 Quá trình nghiên c u và phát tri n v c xin rubella ứ ể ắ 88

1.3 Tình hình s n xu t kháng th ả ấ ể đa dòng ở độ ng v t ậ 1212

1.4 Tình hình s n xu t và s d ng kháng huy t thanh trong ki ả ấ ử ụ ế ểm đị nh v c xin ắ 2020

Chương 2 VẬ T LI ỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U 2222

2.1 V Ậ T LIỆ U, HÓA CH T VÀ THI T B Ấ Ế Ị 2222

2.1.1 Vật liệu 2222

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 2323 Ứ 2.2.1 Phương pháp sản xu t kháng nguyên rubellaấ 2323

Formatted

Trang 15

2.2.3 Phương pháp kiểm tra ch t lư ng kháng huy t thaấ ợ ế nh 3434

Chương 3 Ế K T QU VÀ TH O LU N 4242 Ả Ả Ậ 3.1 K ế t quả ả s n xu t kháng nguyên rubella ấ 4242

3.2 K ế t quả ả s n xu t kháng huy t thanh ấ ế 4444

3.2.1 K t qu s n xu t kháng huy t thanh trên l nế ả ả ấ ế ợ 4444

3.2.2 K t qu s n xu t kháng huy t thanh trên thế ả ả ấ ế ỏ 5050

3.3 Kiể m tra ch t lư ng kháng huy ấ ợ ết thanh thu đượ c 5454

3.4 Ứ ng d ng kháng huy ụ ết thanh rubella thu đượ c trong ki ểm đị nh v c xin ắ rubella 5858

3.4.1 Ứng dụng kháng huy t thanh rubella s n xu t từ ợế ả ấ l n trong kiểm định v c ắ xin 5858

3.4.2 Ứng dụng kháng huy t thanh s n xu t từ ỏế ả ấ th trong kiểm định vắc xin6161 K ẾT LUẬ 6666 N KIẾ N NGH 6767 Ị M Ở ĐẦ 1U T NG QUAN TÀI LI U Ổ Ệ 3

1.1 Đặc điểm sinh h c, mi n d ch c a virus rubella 3 ọ ễ ị ủ 1.1.1 Cấu trúc virus Rubella 3

1.1.5 Ph n ả ứng miễn dịch trong nhi m rubellaễ 7

1.2 Quá trình nghiên c u và phát triứ ển vắc xin rubella 8

1.3 Tình hình sản xuất kháng th ể đa dòng ở độ ng v t ậ 10

1.4 Tình hình sản xuất và s d ng kháng huy t thanh trong kiử ụ ế ểm định v c xin ắ 18

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

Formatted

Trang 16

2.1 V T LI U, HÓA CH T VÀ THI T B Ậ Ệ Ấ Ế Ị 20

2.1.1 Vật liệu 20

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 21 Ứ 2.2.1 Phương pháp sả u t kháng nguyên rubellan x ấ 21

Chương 3 ẾK T QU VÀ TH O LU N 39Ả Ả Ậ 3.1 K t qu sế ả ản xuất kháng nguyên rubella 39

3.2 K t qu sế ả ản xuất kháng huy t thanh ế 41

3.2.2 K t qu sế ả ản xuất kháng huy t thanh trên th 47 ế ỏ 3.3 Kiểm tra ch t lư ng kháng huyấ ợ ết thanh thu được 51

3.4 Ứng d ng kháng huy t thụ ế anh rubella thu được trong kiểm định v c xin rubella ắ 54 3.4.1 Ứng dụng kháng huy t thanh rubella s n xu t từ ợế ả ấ l n trong kiểm định v c ắ xin 54

3.4.2 Ứng dụng kháng huy t thanh s n xu t từ ỏế ả ấ th trong kiểm định vắc xin

57

K T LU N Ế Ậ 62

KIẾN NGH 63Ị M Ở ĐẦ 1U T NG QUAN TÀI LI U Ổ Ệ 3

1.1 Đặc điểm sinh h c, mi n d ch c a virus rubella 3 ọ ễ ị ủ 1.1.1 Cấu trúc virus Rubella 3

1.1.5 Ph n ả ứng miễn dịch trong nhi m rubellaễ 7

1.2 Quá trình nghiên c u và phát triứ ển vắc xin rubella 8

Formatted

Formatted: Font: Times New Roman, 13 pt Formatted

Formatted

Formatted: Font color: Auto Formatted: Font color: Auto Formatted Formatted: Font color: Auto

Trang 17

1.3 Tình hình sản xuất kháng th ể đa dòng ng v t ở độ ậ 10

1.4 Tình hình sản xuất và s d ng kháng huy t thanh trong kiử ụ ế ểm định v c xin ắ 18

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 V T LI U, HÓA CH T VÀ THI T B Ậ Ệ Ấ Ế Ị 20

2.1.1 Vật liệu 20

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 21 Ứ 2.2.1 Phương pháp sản xu t kháng nguyên rubellaấ 21

Chương 3 ẾK T QU VÀ TH O LU N 39Ả Ả Ậ 3.1 K t qu sế ả ản xuất kháng nguyên rubella 39

3.2 K t qu sế ả ản xuất kháng huy t thanh ế 41

3.2.2 K t qu sế ả ản xuất kháng huy t thanh trên th 47 ế ỏ 3.3 Kiểm tra ch t lư ng kháng huyấ ợ ết thanh thu được 51

3.4 Ứng d ng kháng huyụ ết thanh rubella thu được trong kiểm định v c xin rubella ắ 54 3.4.1 Ứng dụng kháng huy t thanh rubella s n xu t từ ợế ả ấ l n trong kiểm định v c ắ xin 54

3.4.2 Ứng dụng kháng huy t thanh s n xu t từ ỏế ả ấ th trong kiểm định vắc xin 57 K T LU N Ế Ậ 62

KIẾN NGH 63Ị Formatted

Formatted

Trang 18

1

M Ở ĐẦ U

Rubella là b nh truy n nhi m do virus Rubella gây ra, có th gệ ề ễ ể ặp ở ọ ứa m i ltuổi, ph n mang thai d m c b nh và n u m c b nh là nguy hi m nh t B nh có ụ ữ ễ ắ ệ ế ắ ệ ể ấ ệtính lây truy n cao và có th gây thành d ch lề ể ị ớn, thường xu t hiấ ện vào mùa đông xuân.V i nh ng ph n mang thai nhi m rubella nguyên phát ớ ữ ụ ữ ễ ởnhững tuần đầu thai nghén, thì virus rubella có th vào thai nhi và gây ra h i ch ng rubella b m sinh ể ộ ứ ẩ ởtrẻ ỏ nh N u ph n b ế ụ ữ ịnhiễm virus rubella u thai k c biở đầ ỳ đặ ệt trong 3 tháng đầu thì tác động xsấu đến thai nhi càng n ng n Theo Miller và c ng s , t l ặ ề ộ ự ỷ ệ ảnh hưởng đến thai nhi dưới 12 tu n là 80%, từ - 14 tu n là 54%, 3 tháng gi a và 3 tháng cu i ầ 13 ầ ữ ố

là 25%, tỷ l ệ ảnh hưởng chung lên thai nhi là 9% H i ch ng rubella b m sinh có th ộ ứ ẩ ểbao gồm m t1ộ hoặc nhi u tri u ch ng: khi m khuyề ệ ứ ế ết ở ắ m t, các d t t v ị ậ ề tim, động

m ch, khi m khuy t vạ ế ế ề ệ ố h th ng th n kinh, ban xu t huy t, b nh v ầ ấ ế ệ ề xương

T i Vi t Nam, b nh Rubella ạ ệ ệ lưu hành theo chu kỳ và gây d ch trên quy mô ịtoàn quốc vào năm 2011 Đã có 10.491 trường h p mợ ắc trong 5 năm, tương đương

t l mỷ ệ ắc trung bình hàng năm trong giai đoạn này là 2,4/100.000 dân B nh ệRubella m c cao nh t t ắ ấ ừ tháng 2 đến tháng 4 và đạt đỉnh vào tháng 3 Khu v c Nam ựTrung B , Tây Nam Bộ ộ, Đông Bắc và Tây B c là vùng có t l m c cao nh t Nhóm ắ ỷ ệ ắ ấ10-15 tu i (38,1/100.000 dân) và nhóm 15-19 tu i (32,4/100.000 dân) là nhóm có t ổ ổ ỷ

l m c cao nh t, chi m 53,6% t ng s ệ ắ ấ ế ổ ố trường h p m c Theo th ng kê, 91,8% s ợ ắ ố ốtrường h p m c bợ ắ ệnh chưa được tiêm v c xin Rubella ho c không rõ ti n s tiêm ắ ặ ề ửchủng [1]

K t qu nghiên c u cho th y s c n thi t ph i tri n khai v c xin Rubella ế ả ứ ấ ự ầ ế ả ể ắtrong chương trình tiêm chủng m r ng cho nhóm tr em, thanh niên và n tu i sinh ở ộ ẻ ữ ổ

đẻ để kh ng ch b nh Rubella và h i ch ng Rubella b m sinh Ngày 18 tháng 10 ố ế ệ ộ ứ ẩ .năm 2013, Bộ Y T Viế ệt Nam đã ký quyế ịt đnh s ố 4471/QĐ-BYT phê duy t D Án ệ ự

H k thuỗtrợ ỹ ật “Tăng cường năng lực s n xu t v c xin ph i h p S i-ả ấ ắ ố ợ ở Rubella” với nguồn v n do Chính ph Nh t B tài tr Theo các n i dung c a D án, Công ty ố ủ ậ ản ợ ộ ủ ựKDSV (Kitasato Daiichi Sankyo V c xin- ắ Nhậ ản) là đơn vịt B chuy n giao hoàn ể

Trang 19

lắp đặt và xây dựng, tương tự nhà xưởng s n xu t cả ấ ủa KDSV Nhà xưởng đã được

B Y T cộ ế ấp phép đạt tiêu chu n WHO-GMP t ẩ ừ năm 2008 cho dây chuyền s n xuả ất

v c xin S i MVVAC và vào tháng 8/2016, B Y t c p ch ng nh n GMP cho dây ắ ở ộ ế ấ ứ ậchuyền sản xuất vắc xin phối hợ ởp S i-Rubella

Để có m t v c xin an toàn và hi u qu c n thi t có quá trình kiộ ắ ệ ả ầ ế ểm định v c ắxin theo tiêu chu n c a t ẩ ủ ổchức Y t i (WHO) M t s các th nghi m quan ếthế giớ ộ ố ử ệtrọng như xác định hi u giá, nh n dệ ậ ạng, xác định tác nhân ngo i lai s d ng kháng ạ ử ụhuy t thanh rubella vế ới lượng l n trong khi ngu n cung c p kháng huy t thanh trên ớ ồ ấ ế

th ếgiới rất hạn ch và giá thành khá cao ế

Nhằm ch ng v ngu n kháng huyủ độ ề ồ ết thanh đồng th i gi m giá thành trong ờ ả

sản xuất vắc xin, chúng tôi đã tiến hành th c hiự ện đề tài nghiên c ứu:

“Nghiên cứ u s n xu t kháng huy t thanh rubella s d ng cho ki ả ấ ế ử ụ ểm đị nh v c ắ xin t i Vi ạ ệt Nam” v i m c tiêu:ớ ụ

− Sản xuất kháng huyết thanh đặc hiệu với virus rubella

− Ứng d ng kháng huyụ ết thanh đặc hi u virus rubella cho kiệ ểm định v c ắxin bán thành ph m rubella, v c xin ph i h p Sẩ ắ ố ợ ởi – Rubella thành ph m ẩ

t i Vi t Nam ạ ệ

Trang 20

bệnh bằng v c xin r t có hiắ ấ ệu quả 23 31 39 [ ], [ ], [ ]

1.1.1 Cấu trúc vir Rubella us

Virus rubella là thành viên duy nh t c a nhóm ấ ủ Rubivirus, thu c h ộ ọTogaviridae Cho đến nay, m i ch có m t kiớ ỉ ộ ểu gen được xác định Virus rubella khác bi t v m t huy t thanh h c v i các virus khác thu c h ệ ề ặ ế ọ ớ ộ ọ Togaviridae, bao gồm

c nhóm Alphavirus genus [ ] , Alphaviruses và virus rubella có nhi u c u trúc ả 23 ề ấgiống nhau v m t di truyề ặ ền cũng như cách nhân lên trong tế bào ch Alphaviruses ủlan truy n t côn trùng tiề ừ ết túc sang người, còn virus rubella lan truy n giề ữa người

o RNA có 2 khung đọc m ở (ORF) như Alphavirus Đầu 5’ gồm ORF 6345 nu

mã hóa cho NSP (NH2-P150-P90-C004) Đầu 3’ gồm ORF 3189 nu mã hóa cho SP (E1, E2 và C)

H virus ạt chứa 3 c u trúc polypeptide: 2 glycoprotein màng E1, E2 và mấ ột protein capsid (protein C) g n vắ ới ARNRNA không b glycosyl hoá Protein v bao ị ỏE1 có kh ả năng gây ngưng kế ồt h ng c u và t o kháng th trung hoà h virus E2 có ầ ạ ể ạt

Trang 21

4

hai d ng E2a và E2b S khác nhau gi a các ch ng virus rubella là do s khác biạ ự ữ ủ ự ệt

v m t kháng nguyên c a E2 [ề ặ ủ 17], [ ], [2318 ], [31], [ ].36

o Protein C: 293-300 aa, 33kD, không glycosyl hóa

o Protein E1: 282 aa, 58kD, có 3 v trí glycosyl hóa liên kị ết với nhau

o Protein E2: 481 aa, có 4 v trí glycosyl hóa, liên k t v i N, là màng vị ế ớ ận

chuyển đến gần điểm t n cùng c a protein C ậ ủ

o Các protein đều đượ ổc t ng h p trong t o chợ ếbà ất

o Kháng nguyên trung hòa: epitope ch a ho t tính trung hòa n m trên ứ ạ ằ

protein C (aa 51-105, ít nh t 2 epitope), E1 (aa 214-285) và E2 (aa 1-ấ 26)

o Vùng phản ứng miễ ịn d ch : C (aa 9-29, 255-280), E1 (aa 273-284,

358-377, 402-422), E2 (aa 54- 74)

Khi nhiễm virus Rubella, xu t hi kháng th kháng 3 protein c u trúc, trấ ện ể ấ ội

nhất là kháng th kháng E1 ể

Formatted: Font: Times New Roman, Font color: Auto

Trang 22

5

1.1.3 Tính ch ấ t lý hóa c ủ a v irus Rubella

o Virus t n tồ ại ở 40C b n v ng trên 7 ngày, ề ữ 370C b b t ho t 0,1-0,4 log10 ị ấ ạ

TCID50/mL/gi , ờ ở 560C b b t ho t 1,5-3,5 log10 TCID50/mL/gi , ị ấ ạ ờ ở

-700C virus b n v ng trong nhiề ữ ều năm

o Virus Rubella thích hợp ở pH 6,0-8,1; kém bền ở pH quá ki m ho c quá ề ặ

acid

o M t ho t tính nhanh b i tia c c tím (40giây 1350w/cm2), sóng siêu âm ấ ạ ở ự

(bền trong 9 phút) B t ho t v lipid b ng ch t t y và dung môi hòa tan ấ ạ ỏ ằ ấ ẩ

lipid

Hình 1 22 2 ấu trúc virus Rubella dướ C i kính hi ển vi điệ n tử [10 ]

1.1.4 Đặc điể m quá trình phát tri n c virus ể ủ a

1.1.4.1 Quá trình bám dính và xâm nhập

Trang 23

6

S bám dính c virus rubella lên các th c a t ự ủa ụthể ủ ế bào liên quan đế ựn s bám c a các phân t glycoprotein E2 và ho c E1 M c dù các th củ ử ặ ặ ụthể ủa tế bào đặc hiệu đố ới v i rubella ho c là các v trí g n c a th th trên 1 ho c 2 protein nói trên ặ ị ắ ủ ụ ể ặ

vẫn chưa được xác định m cách chính xác C hai th t bào và các v trí gột ả ụthể ế ị ắn

th thụ ể trên glycoprotein đã được xác định đố ới v i các alphaviruses

S xâm nh p c a RNA virus vào nự ậ ủ ội bào liên quan đến s ự thay đổ ấi c u hình

c a protein E1 ho c E2, virus rubella bám dính màng t bào làm l petide trong ủ ặ ế ộprotein E1 và cho phép s hòa màng c virus v i màng t bào v t ch dự ủa ớ ế ậ ủ ẫn đến s ựxâm nh p Vì v ậ ỏ nhân được bám vào màng c a h virus ủ ạt qua đầu t n C c a các ậ ủprotein C, do đó, người ta chưa rõ liệu có ph i vi c hòa màng và c i b l p v nhân ả ệ ở ỏ ớ ỏ

là các quá trình riêng biệt [42]

1.1.4.2 S nhân lên c a b gen virus ự ủ ộ

S nhân lên c a b gen virus rubella bự ủ ộ ắt đầu b ng vi c t ng h p các ằ ệ ổ ợpolyprotein không cấu trúc Người ta cho r ng, các polyprotein này nh n ra mằ ậ ột vùng khởi đầu b gen và t ng h p nên mộ ổ ợ ột ARNRNA s i âm ợ ARNRNAnày được cho là hình thành m t c u trúc sộ ấ ợi đôi làm trung gian cùng với ARNRNA b gen ộARNRNA s i âm c a b ợ ủ ộ gen sau đó được dùng làm khuôn m u cho vi c t ng hẫ ệ ổ ợp

c ảARNRNA c a b gen [31 ủ ộ ]

1.1.4.3 Sự lắp ráp của các hạt virus

Đối v i rubella, quá trình n y chớ ả ồi dường như không có những cách th c ứriêng r i v i glycoprotein và nucleocapsid, có th ẽ đố ớ ể vì protein C được bao bởi màng qua trình t tín hi u E2 Ba protein c u trúc c virus ự ệ ấ ủa rubella được dịch mã t ừARNRNA ngoài b ộ gen thành các polyprotein Polyprotein này sau đó được cắt thành các protein riêng l ẻnhờ enzym signalase [30 Các protein E1 và E2 qua quá ] trình glycosyl hóa tr c ti p Tự ế ại đó, vị trí glycosyl hóa vùng N x y ra ả ở trong lưới

n i sinh ch t có h t Vùng glycosyl hóa t i v trí O cộ ấ ạ ạ ị ủa protein E2 chưa được xác định nhưng protein E2 có chứa các trình t giúp protein khu trú t i b Golgi S ự để ạ ộ ự

k t h p c a protein E1 v i E2 c n cho quá trình E1 thoát khế ợ ủ ớ ầ ỏi lướ ội n i sinh ch t có ấ

Trang 24

7

hạt Protein C ph i k t h p vả ế ợ ới ARNRNA c virus t i m t thủa ạ ộ ời điểm nào đó trong

quá trình virus l p ráp S l p ráp ho c c i v c a các nucleoprotein h virus và ắ ự ắ ặ ở ỏ ủ ạt

quá trình virus nhân lên được điều hòa b ng quá trình phosphoryl và loằ ại

phosphoryl hóa của protein C, s phosphoryl hóa c ch ự ứ ế việc hình thành

nucleocapsid [43 ]

Hình 1 33 3 ự S sâm nh p và nhân lên c virus ậ ủa [17].

1.1.5 Phản ứ ng mi n d ch trong nhi m rubella ễ ị ễ

Nhi m rubella t o ra mi n dễ ạ ễ ịch đặc hi u Mi n d ch này t n tệ ễ ị ồ ại suốt đời,

kháng th trung hoà và kháng th ể ể ức chế ngưng kế ồt h ng c u xu t hi n ngay sau khi ầ ấ ệ

ARN virus Nhập bào

V glycoprotein ỏ Màng kép lipid Lõi capsid

Virus liên k t vào ế

ARN c a virus ủ Riboxom

Lướ ộ i n i ch ất trơn Lướ ộ i n i ch t h t ấ ạ

V n chuy ậ ển

đế n b máy ộ

Golgi

L p ráp ắ Chế ến và đóng bi gói trong h ệ Golgi

Này ch i ổ

Giả i phóng h t ạ virus m i ớ

Trang 25

8

có phát ban và đạt m c cao nhứ ất sau 1 đến 4 tu n Các kháng th này có vai trò b o ầ ể ả

v ệ cơ thểchống l i vi c tái nhiạ ệ ễm rubella sau này Tuy nhiên, cũng có trường h p ợ

nhiễm virus th phát v i các ch ng hoang d i ho c t vứ ớ ủ ạ ặ ừ ắc xin Các trường h p này ợ

thường không có tri u ch ng và ch bi u hi n b ng s ệ ứ ỉ ể ệ ằ ự tăng hiệu giá kháng th c ể đặ

hiệu trong huy t thanh Mi n d ch qua trung gian t ế ễ ị ế bào hình thành trong giai đoạn

h i ph c và tồ ụ ồn tại hàng năm sau nhiễm virus [39 ]

Kháng th ể IgM được phát hi n ra t ng cá th v a b ệ ở ừ ể ừ ịnhiễm rubella hoặc

vừa được tiêm phòng IgM thường xu t hiấ ện 5 ngày sau khi người m b phát ban ẹ ị

và thường t n t i t ồ ạ ừ 6 đến 8 tu n Tuy nhiên, trong m t s ầ ộ ố trường h p kháng th ợ ể

rubella IgM ch t n tỉ ồ ại trong vòng 1 năm hoặc dài hơn sau khi nhiễm lần đầu, tái

nhiễm không tri u ch ng ho c tiêm phòng [ ]ệ ứ ặ 12 Việc phát hiện được kháng th ể

rubella IgM trong m t m u huy t thanh duy nhộ ẫ ế ất lấy vào thời điểm hai tu n sau phát ầ

ban ch ng t m i nhi m virus rubella ứ ỏ ớ ễ Thai nhi nhiễm rubella thường được xác

định b i IgM trong m u máu ở ẫ thai nhi, đạt đượ ở ầc tu n th 22 ho c muứ ặ ộn hơn Sự có

m t kháng th ặ ể IgM rubella trong máu thai nhi xác định được nhi m rubella trong ễ

thờ ỳi k thai nghén, b i vì IgM c a mẹ không qua hàng rào rau thai [9 ở ủ ]

Kháng th IgG ái tính xu t hiể ấ ện và tăng lên trong 3 tháng đầu sau khi phát ban

và giảm dần cho đến 6 tuần sau đó, kháng th rubella lể ớp IgG thường t n t i suồ ạ ốt

đời [16]

1.2 Quá trình nghiên c u và phát tri n v c xin rubella ứ ể ắ

1 2 Tình hình nghiên c u và s n xu 1 ứ ả ất vắ c xin rubella trên th ế ới gi

n th y b ng b nh nhân Năm 1941, bác sĩ nhãn khoa người Úc đã nhậ ấ ất thườ ở ệ

đục th y tinh th ủ ể và đã có báo cáo về ự ồ ạ ủ s t n t i c a h i ch ng rubella b m sinh t ộ ứ ẩ ừ

s n ph trong thả ụ ời gian có lưu hành dịch rubella vào năm 1940 và đã chứng minh

được có s liên quan v m t d ch t h c gi a b nh rubella v i bự ề ặ ị ễ ọ ữ ệ ớ ệnh điếc, b nh tim ệ

và đục th y tinh th bủ ể ẩm sinh Năm 1962~1963 xuất hiện đạ ịi d ch rubella Châu ở

Âu, năm 1964~1965 đã lan truyền sang Mỹ, sau đó tiế ục lưu hành sang Okinawa p t

Formatted: Font: (Default) Times New Roman, Font color: Auto, Vietnamese, Pattern: Clear

Formatted: Vietnamese

Trang 26

9

và đã xác nhận thấy có trường hợp lưu sản và h i ch ng rubella bộ ứ ẩm sinh; người ta

đã xác nhận được mức độ quan tr ng cọ ủa căn bệnh rubella và đã tách được virus rubella vào năm 1962

Trong nh ng ữ năm từ 1965~1967 đã phát triển ra v c xin khác v i ch ng t ắ ớ ủ ếbào c y chuy n và ch ng RA27/3, HPV-77, Cendhill, tuy nhiên ch còn chấ ể ủ ỉ ủng RA27/3 là hi n vệ ẫn đang đượ ử ục s d ng tại nước ngoài T i Nh t Bạ ậ ản cũng có 3 loại chủng phát tri n t v c xin rubella khác nhau c a 5 nhà s n xu t t chể ừ ắ ủ ả ấ ừ ủng được tách vào những năm 1960 Từ năm 1977 đã khuyến khích tiêm định k v c xin cho các ỳ ắ

bé gái 14 tu i v i mổ ớ ục đích phòng tránh hội ch ng CRS Tuy nhiên, v n không th ứ ẫ ểkiểm soát đượ ịch rubella lưu hành và vẫc d n xu t hi n tr ấ ệ ẻ sơ sinh mắc h i ch ng ộ ứCRS m i khi có d ch ỗ ị

T i Âu M , t ạ ỹ ừ những năm 1970, vắc xin ph i h p tam liên s i-quai b -ố ợ ở ịrubella (MMR) được s d ng ph bi n và rử ụ ổ ế ộng rãi để phòng ng a b nh s i, quai b , ừ ệ ở ịrubella là các b nh truyệ ền nhiễm do virus em Tởtrẻ ại Mỹ đã tuyên truy n giáo dề ục

v ề rubella nhưng tại Châu Âu v n có báo cáo v c xu t hi n b nh d ch tùy thuẫ ềviệ ấ ệ ệ ị ộc vào t l tiêm phòng t i t ng qu c gia T i Nh t B n, t ỉ ệ ạ ừ ố ạ ậ ả ừ năm 1989 đã bắt đầu s ử

d ng MMR bao g m s i (AIK-C), quai b (Urabe), rubella (TO336) Tuy nhiên, ụ ồ ở ịxuất hi n nhiệ ều trường h p viêm màng não do virus mà nguyên nhân do ch ng ợ ủUrabe nên đã tạm d ng tiêm vừ ắc xin MMR vì chưa giải quyết được vấn đề ề v viêm màng não do virus m c dù các nhà s n xuặ ả ất đã đưa vào sử ụng Năm 1994, vớ d i Luật tiêm ch ng sủ ửa đổi,đã bắt đầu cho tiêm v c xin rubella ắ ở độ ổtu i thấp để ể ki m soát rubella, t l tiêm vỉ ệ ắc xin vượt quá 75% và không còn dt ịch lưu hành trên toàn quốc nhưng dịch lưu hành tạ ừi t ng khu v c v n phát sinh nhiự ẫ ều; trong đó độ tu i ổ

m c rubella chuy n dắ ể ịch sang độtuổi ngườ ớn, năm 2004 đã có 10 trười l ng h p báo ợcáo m c h i chắ ộ ứng CRS, do đó cần tăng cường vi c tiêm v c xin ệ ắ

1.2.2 Tình hình s n xu ả ấ t vắ c xin rubella t i Vi t Nam ạ ệ

Năm 2013, Bộ Y T Viế ệt Nam đã ký quyết định s ố 4471/QĐ-BYT phê duy t ệ

D Án H k thuự ỗ trợ ỹ ật “Tăng cường năng lực s n xu t vả ấ ắc xin ph i h p S i-ố ợ ở

Trang 27

10

Rubella” với ngu n v n do Chính ph Nh t B n tài trồ ố ủ ậ ả ợ Năm 2016 POLYVAC đã

được B Y t c p ch ng nh n GMP cho dây chuy n s n xu t v c xin ph i h p s i ộ ế ấ ứ ậ ề ả ấ ắ ố ợ ở –

rubella và vắc xin đã được cấp phép lưu hành vào tháng 3 năm 2017

Đến nay, Vi t Nam là m t trong 25 qu c gia trên th giệ ộ ố ế ới và là nước th 4 t i ứ ạ

châu Á s n xu t thành công v c xin s i-rubella, sau Nh t Bả ấ ắ ở ậ ản, Ấn Độ và Trung

Quốc

Theo quy trình chuy n giao công ngh v c xin rubella bán thành phể ệ ắ ẩm được

sản xuất trên th n th SPF s d ng ch ng v c xin giậ ỏ ử ụ ủ ắ ảm độ ực l c Takahashi do viện

KDSV - Nhật Bả ản s n xu ất Chủng virus Takahashi s d ng cho sử ụ ản xuất vắc xin tại

Việt Nam có đặc điểm chính sau:

Phân lập ch ng Takahashi v c xin rubella giủ ắ ảm độc l c: vào nhự ững năm

1960, đã tiến hành phân l p ra ch ng v c xin rubella Takahashi t ch ng Matsue là ậ ủ ắ ừ ủ

chủng hoang d i sau khi c y chuyạ ấ ển 4 đờ ớ ếi v i t bào th n kh ậ ỉ xanh châu phi, 36 đời

với tế bào tinh hoàn thỏ, 1 đờ ới v i tế bào th n th Ch ng v c xin rubella Takahashi ậ ỏ ủ ắ

được nuôi c y 35ấ ở 0C, có tính ch t nh y c m v i nhiấ ạ ả ớ ệt độ (khi nuôi cấy ở 390C, thì

chỉ tăng trưởng không quá 1/1000 l n so v i khi nuôi c y ở 35ầ ớ ấ 0C)

Phân tích tính chất của ch ng Takahashi Rubella: ủ

o Tách RNA t ừchủng Takahashi, sau đó gắn vào T7 Promotor để ạ t o ra cDNA

gây nhiễm Sau đó chuyển n p (transfection) vào t bào RK13 và thu hạ ế ồi được

virus lây nhi m S d ng các lo i enzyme gi i hễ ử ụ ạ ớ ạn đặc bi t cệ ắt thành 8 đoạn

cDNA khác nhau Sau đó tạo ra các virus lai (chimeric virus), dùng phương

pháp Reverse genetics và thu h virus lây nhi m (Hình 1.45 ồi ễ )

o Nuôi virus đã thu hồi ở 350C và 390C so sánh kh để ả năng tăng trưởng Virus

đượ ạc t o ra t ch ng v c xin Takahashi (KRT) b ng k thu t Reverse genetics, ừ ủ ắ ằ ỹ ậ

khi nuôi ở390C chỉ tăng trưởng không quá 1/1000 l n so v i khi nuôi ầ ớ ở350C

Chủng hoang dại tăng trưởng như nhau khi nuôi ở 350C và 390C virus lai Ở

Formatted: Justiﬁed, Space Before: Auto, Line

spacing: 1.5 lines

Formatted: Justiﬁed, Indent: Left: 0 cm, Hanging: 0.75 cm, Space Before: Auto, Line spacing: 1.5 lines, Bulleted + Level: 1 + Aligned at: 1.9 + Indent at: cm 2.54 cm

Formatted: Not Highlight Formatted: Font: Times New Roman

Trang 28

11

(chimeric virus) gi a ch ng hoang d i (ch a p150) và ch ng v c xin, rKRT-ữ ủ ạ ứ ủ ắ

rec2 tăng trưởng gi ng ch ng hoang d i khi nuôi 39ố ủ ạ ở 0C, còn v i chimeric virus ớ

khác thì không tăng trưởng khi nuôi ở390C T k t qu này ta th y rõ khu vừ ế ả ấ ực

p150 có liên quan đến tính ch t nh y c m v i nhiấ ạ ả ớ ệt độ ủ c a ch ng v c xin ủ ắ

rubella

Hình 1 44 1-5 Phân tích vùng gen đảm nhiệm chức năng nhạy c m v i nhi ả ớ ệt độ của

virus Rubella

o Tiế ụ ử ụp t c s d ng enzyme gi i h n c t 3 v trí (khu v c) có trong vùng p150 ớ ạ ắ ị ự

để ạ t o ra virus tái t h p (chimera virusổ ợ ) thì thu được k t qu phân tích tính ch t ế ả ấ

nhạ ảy c m v i nhiớ ệt độ (ts) (Hình 1.56) Gen đảm nhi m tính ch t ts n m gi a ệ ấ ằ ữ

NheI và Bsm I, đồng th i nh n th y có s khác bi t v amino axit gi a ch ng ờ ậ ấ ự ệ ề ữ ủ

hoang d i và ch ng v c xin 2 v trí 1007 và v trí 1042 Ti p t c nghiên cạ ủ ắ ở ị ị ế ụ ứu,

k t qu cho th y amino axit v trí 1042 c a p150 có liên qế ả ấ ở ị ủ uan đến ts

Formatted: Font: Times New Roman, Dutch (Netherlands), Check spelling and grammar

Formatted: Font: Times New Roman, pt, Dutch 13 (Netherlands)

Formatted: Justiﬁed, Indent: Left: 0 cm, Hanging: 0.75 cm, Space Before: Auto, Line spacing: 1.5 lines, Bulleted + Level: 1 + Aligned at: 1.9 + Indent at: cm 2.54 cm

Formatted: Not Highlight Formatted: Font: Times New Roman

Trang 29

12

Hình 1 55 1-6 Tạo virus thay th vùng p150 virus rubella và tính nh y c m v ế ở ạ ả ới

nhiệ ộ t đ

Marker sinh h c cọ ủa vắc xin rubella:

Khả năng tăng trưởng c a virus khi nuôi củ ấy ở 390C không quá 1/1000 khi

nuôi cấy ở 350C: do His v trí 1042 c a p150 quyở ị ủ ế ịnh đặt đ c tính này

Trên đây là tổng h p nhợ ững điểm quan tr ng khi giọ ảm độ ực l c ch ng vủ ắc

xin rubella Takahashi Điểm quan tr ng khi giọ ảm độ ực l c v c xin rubella là tính ắ

nhạ ảy c m v i nhiớ ệt độ và đã xác định được các amino axit của gene đảm nhi m tính ệ

chất đó Có thể ử ụng các marker gene này để ậ ạ s d nh n d ng virus v c xin V i công ắ ớ

suấ ối đa hàng năm sảt t n xuất được kho ng 30 tri u li u v c xin bán thành ph m ả ệ ề ắ ẩ

rubella, như vậy không ch cung c p k p th i nhu c u vỉ ấ ị ờ ầ ắc xin rubella trong nước mà

còn hướng t i xu t kh u ớ ấ ẩ

1.3 Tình hình s n xu t kháng ả ấ thể đa dòng ở độ ng v t ậ

Các kháng th s ể ẽ đượ ạc t o ra b i h ng mi n d ch c a mở ệthố ễ ị ủ ột động v t thông ậ

qua đáp ứng mi n dễ ịch đặc hi u v i tác nhân gây mi n d ch H th ng mi n d ch ệ ớ ễ ị ệ ố ễ ị

của động v t bao g m mậ ồ ột lượng l n các t bào lympho mà m i t bào lympho ớ ế ỗ ế

Formatted: Justiﬁed, Space Before: Auto, Line

spacing: 1.5 lines

Formatted: Normal, Justiﬁed, Indent: First line: 1.27

cm, Space Before: Auto, Line spacing: 1.5 lines

Trang 30

13

được xác định bởi tính đặc hi u kháng nguyên th th duy nh t Các kháng th ệ – ụ ể ấ ểđược ti t ra t các t bào b ch c u - các t ế ừ ế ạ ầ ế bào được biệt hóa t các t bào lympho B ừ ếsau khi được kích thích b i các kháng nguyên l M i phân t kháng th có kh ở ạ ỗ ử ể ảnăng nhận bi t mế ột epitop đặc hi u (quyệ ết định kháng nguyên) g m kho ng 5-6 ồ ảamino acid ho c monosaccharide d ng th ng ho c d ng cu n g p và có kh ặ ạ ẳ ặ ạ ộ ấ ả năng liên k t v i epitop này [Anderson et al., 1999; Abbas et al., 2000; Abbas et al., ế ớ2001] Kháng th ể đa dòng khó tái sản xu t vì s ấ ự đa dạng c a các kháng th ủ ể được tạo

ra trong đáp ứng đa dòng Mức độ và chất lượng c a các kháng th ủ ể đượ ạc t o ra là khác nhau mở ỗi động v t và m i thậ ở ỗ ời điểm c a mủ ột động v t Vì th các kháng ậ ếthể đa dòng có những tính chất và đặc điểm nhất định thay đổi trong quá trình s n ảxuất

Có nhi u nhân t ề ố ảnh hưởng đến s n xu t kháng th ả ấ ể đa dòng: bản ch t cấ ủa tác nhân gây mi n dễ ịch được s dử ụng, đường tiêm và l ch tiêm, d ng và chị ạ ất lượng

tá dược, b n ch t c a ch t sinh mi n d ch/thành phả ấ ủ ấ ễ ị ần tá dược, phương pháp lấy máu, chủng, loài động v t s d ng, tình tr ng s c kh e và tính di truy n cậ ử ụ ạ ứ ỏ ề ủa động

vật; quá trình đào tạo, chuyên môn và kh ả năng của nhân viên chăm sóc động vật, chế độ ăn, ở ủa độ c ng v t Mậ ặt khác cũng cần chú ý các y u t nhi m trùng và/ho c ế ố ễ ặstress có th c ch ể ứ ế đáp ứng mi n d ch, và vì v y làm giễ ị ậ ảm lượng kháng th ể đa dòng được t o ra hoặạ c thậm chí đáp ứng không đáng kể[Canadian Council on Animal Care, 2002]

Kháng th ể đa dòng có đáp ứng tốt hơn đố ớ ự thay đổ ủi v i s i c a kháng nguyên

so v i kháng th ớ ể đơn dòng nên chúng được sử ụ d ng nhi u trong các nghiên cề ứu như trong kiểm định vaccine, xét nghi m ELISA, Western blot, hóa mô mi n d ch, ệ ễ ịngưng kết mi n d ch, hi n vi mi n d ch hu nh quang, hi n vi mi n dễ ị ể ễ ị ỳ ể ễ ịch điệ ử…n t

1.3.1 Ch n l ọ ọc và chăm sóc độ ng v ật

c l a ch ng v t thích h p cho s n xu t kháng th

đề đầu tiên được quan tâm Các nhà nghiên cứu đã đưa ra các tiêu chí sau để ự l a chọ ộn đ ng v t: ậ

Trang 31

thể đa dòng vì dễ ử ụ s d ng và l y máu Kháng th t o ra t ỏấ ể ạ ừth có th ể thu được m t ộ

lượng đủ ớ l n có hi u giá cao, ái lệ ực cao đáp ứng được h u h t các th nghi m ầ ế ử ệ

[Halliday et al., 2000]

Khi c n mầ ột lượng l n kháng th thì s dớ ể ử ụng các động v t lậ ớn hơn đặc biệt

đố ớ ải v i s n xuất thương mại L n, c u, dê, l, lợ ừ ừa và ng a là nhự ững động v t có th ậ ể

đáp ứng được yêu c u này Tuy nhiên nhầ ững đòi hỏ ề cơ sở ạ ầi v h t ng và chi phí khi

nuôi chúng đã hạn ch vi c s d ng chúng cho vi c s n xu t huyế ệ ử ụ ệ ả ấ ết thanh thương

m i ạ

v i th ớ ỏ nhưng có thể đượ ử ục s d ng n u ch c n mế ỉ ầ ột lượng nh kháng th [Canadian ỏ ể

Council on Animal Care, 2002]

S d ng gà có nhi u l i th ử ụ ề ợ ế như các kháng thể đa dòng có thể tách ra t lòng ừ

đỏ ứ tr ng mà không c n l y máu M t khác, gà t o ra mầ ấ ặ ạ ột lượng l n kháng th ớ ể hơn

so v i các loài g m nh m phòng thí nghi m [Erhard et al., 2000] Tuy nhiên gà ớ ặ ấ ệ

không thích h p cho tợ ất cả các mục đích

Để ạ ể đa dòng thì nên sử ụng các độ ật ở tuổi trưởng

Mặt khác các con cái thường đượ ực l a chọn vì chúng thường tạo ra đáp ứng miễn

d ch mị ạnh hơn và lành hơn Các kháng th t n t i t ể ồ ạ ừ trước ở độ ng vật đặc hi u vệ ới

tác nhân gây mi n d ch có th ễ ị ể ảnh hưởng t i c ớ ảchất lượng và s ố lượng c a kháng ủ

Formatted: Font: (Default) Times New Roman, Font color: Auto

Trang 32

15

thể đặ c biệt khi c n s n xu t các kháng th ầ ả ấ ể đa dòng đặc hiệu đơn typ vì thế trước khi gây miễn dịch thường lấy máu động vậ ểt đ m tra kiể

1.3.2 Quy trình gây mi n d ch ễ ị

M t quy trình miộ ễn dịch c n quan tâm t i m t s vầ ớ ộ ố ấn đề sau:

- Phương pháp chuẩ ịn b kháng nguyên

- S dử ụng tá dược: có s d ng hay không, nử ụ ếu sử ụ d ng thì là loại tá dược nào

- Đường tiêm và s lư ng v trí tiêm ố ợ ị

- Thể tích mẫu đưa vào động v t ậ

- L ch tiêm ị

Do v y mậ ỗi cơ sở nên thi t l p m t quy trình chu n cho s n xu t kháng th ế ậ ộ ẩ ả ấ ể

đa dòng với mỗi loài động v t ậ

1.3.2.1 Chuẩn bị kháng nguyên

phải không độc, vô trùng và không gây s t, gi m thi u tố ả ể ối đa sự ễ ạ ủ ấnhi m t p c a b t

k m t g c hóa h c, nỳ ộ ố ọ ội độ ốc t hoặ ạc t p nhiễm gây độc và pH ph i ả được điều chỉnh trong kho ng pH sinh lý ả

kháng th t t r t khác nhau ph thu c vào loài và chể ố ấ ụ ộ ủng động vật được gây miễn

dịch, tá dược được s dử ụng, đường tiêm, t n su t tiêm và tính sinh mi n d ch cầ ấ ễ ị ủa

b n thân kháng nguyên ả

C u hình không gian cấ ủa kháng nguyên cũng là yếu t quan tr ng vì các ố ọkháng th ể đượ ạc t o ra do kích ng b i protein t nhiên s ứ ở ự ẽphản ứng t t v i các ố ớprotein t nhiên, và các kháng th ự ể đượ ạc t o ra do kích ng b các protein bi n tính ứ ởi ế

s ẽphản ứng t t nh t v i các protein b n tính Do v y, vi c chu n b mố ấ ớ ịbiế ậ ệ ẩ ị ột tá dược

ở ạ d ng huy n phù dề ầu trong nước với các kháng nguyên được h p ph s duy trì ấ ụ ẽ

Trang 33

16

một lượng kháng nguyên có c u hình t nhiên lấ ự ớn hơn khi kháng nguyên được chu n b trong m t huyẩ ị ộ ền phù nước trong dầu Kháng nguyên được h p ph vào ấ ụnhôm có th ể đem lại một đáp ứng kháng th tể ố ốt đ i với cấu hình t nhiên [Canadian ựCouncil on Animal Care, 2002]

1.3.2.2 Lựa chọn tá dược

Các nhà nghiên c u c n l a chứ ầ ự ọn tá dược thích h p nh t cho kháng nguyên ợ ấquan tâm cùng v i quy trình trớ ộn kháng nguyên/tá dược Vì ph n l n các phầ ớ ản ứng phụ không mong mu n trong quá trình s n xu t kháng th ố ả ấ ể là do các tá dược nên trước h t c n phế ầ ải xác định liệu tá dược có c n ph i s d ng hay không? Các tá ầ ả ử ụdược đượ ử ục s d ng v i mớ ục đích tăng cường đáp ứng mi n d ch chính vì v y khi s ễ ị ậ ử

d ng nó m c kháng th t o ra phụ ứ ể ạ ải tăng và được duy trì

m t kho kháng nguyên t i v trí tiêm dộ ạ ị ẫn đến s i phóng ch m duy trì quá trình ựgiả ậkích thích vớ ệ ối h th ng mi n dễ ịch Tá dược cũng có thể ợ tr giúp quá trình v n ậchuy n kháng nguyên t i lá lách và/ho c các h ch b ch huyể ớ ặ ạ ạ ết nơi mà xảy ra nhiều

s ự tương tác tế bào-t ế bào trong đáp ứng mi n d ch Chúng có th ễ ị ểhoạt hóa tr c tiự ếp hoặc gián ti p các t bào khác nhau ch ng hế ế ẳ ạn như các đại th c bào ho c các t bào ự ặ ếlympho T tr ợ giúp liên quan đến đáp ứng mi n dễ ịch Các tá dược cũng có thể ả nh

hưởng t i kho ng th i gian t n t i, phân l p và nớ ả ờ ồ ạ ớ ồng độ ủ c a các kháng th ợ ạểđư c t o

ra và có th ể ảnh hưởng t i miớ ễn dịch trung gian t bào ế

c s d ng ph n bao g

Incomplete Adjuvants (FCA và FIA), Quil A, RibiTM, và TiterMaxTM và các tá dược có thành ph n khoáng nhôm hydroxide, nhôm phosphate và calcium ầ –phosphate Tuy nhiên t t c ấ ả các đặc tính mong mu n c a mố ủ ột tá dược không th ể

h i t ộ ụ đầy đủ trong b t k m t lo i nào trong t ng s kho ng 100 loấ ỳ ộ ạ ổ ố ả ại tá dược đã biết [Raig et al., 1999]

1.3.2.3 Đường tiêm

Trang 34

17

(intramuscular - IM), trong da (intradermal - ID), trong màng b ng (intraperitoneal - ụ

IP) hoặc trong tĩnh mạch (intravenous - IV) [Diehl et al., 2001]

dầu để làm gi m tả ối đa sự hình thành các áp xe

c l a ch i v i các kháng nguyên Tiêm tĩnh mạch (IV) là đường tiêm đượ ự ọn đố ớ

h t nh , vì kháng nguyên s ạ ỏ ẽ được phân b dố ọc cơ thể do đó khả năng bắt gi bữ ởi

các t ế bào lympho cao Đường IV không nên được sử ụng đố ới tá dược dạ d i v ng gel

nhớt ho c có dặ ầu hoặc đối với các kháng nguyên h t lớn vì có nguy cơ gây tắc mạch ạ

phổi

Tiêm trong cơ (IM) không nên sử ụng để tiêm các tá dượ ạ ớt

hoặc có dầu vào các động v t nh ch ng h n chu t ậ ỏ ẳ ạ ộ

Tiêm trong màng b ng các h n hụ ỗ ợp tá dược là không c n thiầ ết đố ớ ải v i s n

xuất kháng th ể đa dòng vì nó gây ra các phản ứng viêm, viêm màng b ng và thay ụ

đổi sinh ho t ạ

với các trường h p không th t s c n thi t V i th ợ ậ ự ầ ế ớ ỏ và các động v t lậ ớn hơn khi

tiêm qua đường ID thì th tích tiêm nên nh (25 µl) [Halliday et al., 2000] ể ỏ

Các v ị trí tiêm đượ ực l a ch n ph i không làm ọ ả ảnh hưởng đến vi c l y máu ệ ấ

sau này Các đường gây mi n d ch khác bao g m khí dung, tiêu hóa và nh ễ ị ồ ỏ mũi

Các đường này có l i th ợ ế kích thích đáp ứng IgA và cũng ít gây đau đớn cho động

v t [Coste et al., 2000; Falero-Diaz et al., 2000; Nally et al., 2001] ậ

B ả ng 1 1111 Các đườ ng tiêm khi s d ng và không s d ử ụ ử ụng tá dượ c [Canadian

Council on Animal Care, 2002] Field Code Changed Formatted: Font: Times New Roman, Font color: Auto

Trang 35

18

Đố ớ ấ ỳ ột kháng nguyên nào cũng cầi v i b t k m n ph i có s k t h p gi a li u ả ự ế ợ ữ ề

lượng tối ưu, đường tiêm và qui trình gây mi n d ch thì m i tễ ị ớ ạo nên được một đáp

ứng mi n d ch hi u qu nh t Li u kháng nguyên quá th p hoễ ị ệ ả ấ ề ấ ặc quá cao đều không

thể ạo nên được đáp ứ t ng mi n d ch Nễ ị ếu đưa kháng nguyên vào cơ thể ch m t l n ỉ ộ ầ

thì thường ch ỉ kích thích sinh ra được đáp ứng mi n d ch vễ ị ới cường độ ấ th p Tuy

nhiên, khi tiêm l p l i nhi u l n trong vòng th i gian vài tu n thì lặ ạ ề ầ ờ ầ ại gây được đáp

ứng mi n d ch vễ ị ới cường độ cao vì chúng kích thích các t ế bào lympho T và B đặc

hi u vệ ới kháng nguyên tăng sinh mạnh hơn

B ng 1 ả 2222 Thể tích tiêm t ối đa củ a h n h ỗ ợp kháng nguyên/tá dượ c trên

m t v trí tiêm ộ ị ở các loài độ ng v t khác nhau [Canadian Council on Animal ậ

Care, 2002]

Trang 36

19

Thể tích tiêm càng nh càng t t và nên gi trong gi i h n cho phép (b ng ỏ ố ữ ớ ạ ả

1.2 và 1.3) Khuy n cáo ế đưa ra là hạn ch s v trí tiêm Tuy nhiên trong m t s ế ố ị ộ ố

trường h p c n gi m thi u th tích tiêm do v y c n tiêm nhi u v ợ ầ ả ể ể ậ ầ ở ề ị trí Để gi m ả

thi u các phể ản ứng b t l i, th ấ ợ ể tích tiêm được khuy n cáo trên m t v ế ộ ị trí tiêm đối

v i h n hớ ỗ ợp kháng nguyên/tá dược nh ỏ hơn thể tích c n tiêm nói chung [Canadian ầ

Council on Animal Care, 2002]

Các l n tiêm nh c lầ ắ ại ở ầ ị g n v trí mà không có d u hi u phấ ệ ản ứ ở ầng l n tiêm

đầu tiên s có l i th thi t l p các t bào ghi nh Các v ẽ ợ ế ế ậ ế ớ ị trí tiêm nên đủ tách biệt để

tránh s k t h p cự ế ợ ủa các thương tổn do viêm, các tổn thương này có thể phá hủy

nguồn cung c p máu kèm theo hình thành các vấ ết áp xe đôi khi là các vết thương

Tuy nhiên n u có d u hi u phế ấ ệ ản ứng t i ch thì các l n tiêm nh c l i nên tiêm các ạ ỗ ầ ắ ạ ở

v trí cách các v trí tiêm c a lị ị ủ ần trước và không tiêm t i các v trí u h t hoạ ị ạ ặc sưng

gây ra bởi lần tiêm trước

Trong vấn đề này thì việc đào tạo và chuyên môn c a nhân viên th c hiủ ự ện

quy trình là nhân t quan tr ng S dố ọ ử ụng gây mê để ấ l y máu là không c n thiầ ết đối

v i th ớ ỏ và các động v t lậ ớn hơn Tuy nhiên gây mê ở các đầ ậu t n cùng là c n thiầ ết

n u l y máu qua tim v i mế ấ ớ ột lượng l n Kim l y máu nên v a vớ ấ ừ ới kích thước m ch ạ

máu Th tích máu tể ối đa lấy ra không nên vượt quá 10% t ng th ch máu cổ ểtí ủa

động v t (~ 1% trậ ọng lượng cơ thể ế) n u 2 tu n l y m t l n, và không quá 15% t ng ầ ấ ộ ầ ổ

Trang 37

20

thể tích máu n u 4 tu n l y m t m t l n [Canadian Council on Animal Care, 2002] ế ầ ấ ộ ộ ầ

Máu sau khi lấy để đông tự nhiên, ly tâm để thu huy t thanh Các kháng th có th ế ể ể

được tinh s ch ho c không tùy vào mạ ặ ục đích sử ụ d ng

Protein A và G có ái l c cao v i vùng Fc cự ớ ủa IgG và thường đượ ử ụng đểc s d

tinh s ch IgG Protein G có liên k t ái lạ ế ực cao hơn và phổ đặ c hi u hi u loài r ng ệ ệ ộ

hơn so với protein A Tinh s ch ái l c là s l a ch n t t nhạ ự ự ự ọ ố ất để thu các kháng th ể

đặc hiệu Kháng nguyên được g n vào giá sắ ắc ký (agarose, sepharose…), khi cho

huy t thanh ch y qua thì các kháng th trong huy t thanh s liên k t v i kháng ế ả ể ế ẽ ế ớ

nguyên và được gi l i trên c t trong khi các kháng th khônữ ạ ộ ể g đặc hi u s ệ ẽ đi qua

sau đó các kháng thể đặ c hiệu được thu h i lồ ại [Amersham Bioscience] Ngượ ạc l i,

người ta cũng có thể ắ g n các protein ph n ứng chéo đã biếả t vào giá s c ký, khi cho ắ

huy t thanh ch y qua thì các kháng th không mong mu n s g n vào c t còn các ế ả ể ố ẽ ắ ộ

kháng th c hi u s ể đặ ệ ẽ đi ra và được thu l i [Canadian Council on Animal Care, ạ

2002]

1.3.2.6 Giám sát động vật

ng v t có th ng viêm v i vi c tiêm kháng nguyên ho

h n hỗ ợp kháng nguyên/tá dược vì th ếphải giám sát hàng ngày đố ới v i các phản ứng

t i các v trí tiêm nói riêng và toàn b s c kh e nói chung Thạ ị ộ ứ ỏ ức ăn, nước u ng, ố

hoạt động nói chung nên được ki m soát Quá trình theo dõi phể ải được ghi chép đầy

đủ bao g m các nhân t đư ng tiêm, v trí tiêm, th tích, ngày tiêm, tr ng lư ng ồ ố ờ ị ể ọ ợ

động vật… Các động vật cũng phải được giám sát c n th n sau lẩ ậ ấy máu đặc bi t khi ệ

quy trình s d ng gây mê ử ụ

1.3.2.7 Hủy động vật

ng v t thí nghi m s c tiêu h y sau khi l y máu toàn b Có th

động vật theo phương thức nhân đạo không gây đau đớn cho động v t ho c tiêm ậ ặ

không khí vào tĩnh mạch ho c nh t trong thùng kín chặ ố ứa đầy CO2

Trang 38

21

1.4 Tình hình s n xu t và s d ng kháng huy t thanh trong ki ả ấ ử ụ ế ểm đị nh v c xin ắ

Rubella là căn bệnh ph ổbiến trên toàn th i Bi n pháp phòng b nh hiếgiớ ệ ệ ệu

qu nhả ất là s d ng v c xinử ụ ắ Để đả m b o có m t v c xin an toàn và hi u qu cả ộ ắ ệ ả ần

thi t ph i có m t quy trình kiế ả ộ ểm định v c xinắ , trong đó có các thử nghi m c n s ệ ầ ử

d ng kháng huyụ ết thanh đặc hi u cho virus rubella ệ như thử nghiệm xác định tác

nhân ngo i lai, th nghiạ ử ệm xác định hi u giá v c xin, th nghi m nh n dệ ắ ử ệ ậ ạng ử, th

nghiệm ổn định nhi t củ ắệ a v c xin

Kháng huy t thanh s d ng s dế ử ụ ử ụng để trung hòa theo t l 1:1 ỷ ệ cho xác định

tác nhân ngo i lai c a vaccine bán thành phạ ủ ẩm rubella trên 3 i t bào (Veroloạ ế ,

PRK, FL) được pha loãng u giá ởhiệ 80 đơn vị ớ ổ, v i t ng tích m u là thể ẫ 126 ml cho

3 loại tế bào

Kháng huy t thanh s d ng cho nh n d ng virrus rubella pha loãng ế ử ụ ậ ạ ởhiệu

giá 80 HI, s d ng cho chuử ụ ẩn độ u giá và hiệ thử nghiệm ổn đị nhiệ ớ ỉ ệnh t v i t l

0,5% M c dù th tích s d ng cho m i lô th ặ ể ử ụ ỗ ửnghiệm ít nhưng ớ ệ ả v i vi c s n xu 4-ất

10 tri u li v c xin thành phệ ều ắ ẩm ỗi năm thì lượm ng kháng huy t thanh s d ng là ế ử ụ

đáng kể

thử nghi m kiệ ểm định cho mỗi năm thì việc s n xu t kháng huy t thanh t chả ấ ế đạ ất

lượng , có hi u giá cao là vô cùng c n thi t Các kháng th có hi u giá th p không ệ ầ ế ể ệ ấ

thể ử ụ s d ng cho các th nghiử ệm xác định tác nhân ngo i lai ạ

Trong những năm gần đây việc s n xu t kháng huy t thanh t ả ấ ế ừcác động vật

thí nghiệm đã trở thành công vi c không th thi u c a nhi u công trình nghiên cệ ể ế ủ ề ứu

Có r t nhiấ ều quy trình để ả s n xu t kháng huy t thanh thành công v i hi u giá cao và ấ ế ớ ệ

tính đặc hi u cao S thành công c a quy trình ph thu c vào r t nhi u y u t ệ ự ủ ụ ộ ấ ề ế ố như

chủng virus (kháng nguyên), loại động v t và chậ ất lượng của động v t thí nghi m, ậ ệ

thời điểm gây mi n d ch và thu huyễ ị ết thanh, tá dược Hiện nay các cơ sở ả s n xu t ấ

v c xin rubella trên th ắ ếgiớ ải s n xu t kháng th s d ng trong kiấ ể ử ụ ểm định ắv c xin

b ng cách t o mi n d ch trên th và l n Quy trình s n xu t m i kháng nguyên có ằ ạ ễ ị ỏ ợ ả ấ ỗ

Trang 39

22

khác nhau, cách tạo đáp ứng mi n d ễ ịch cũng khác nhau về thờ i gian và liều lượng nhưng đều chung một quy trình cơ bản bao gồm các bước: s n xu t kháng nguyên ả ấtrên nuôi c y t bào, xác nh nấ ế đị ồng độ kháng nguyên và tá dược tiêm trên động v tậ, theo dõi hi u giá kháng huyệ ết thanh trong quá trình tiêm động v t, thu huy t thanh ậ ế

và tinh s ch huyạ ết thanh thu được

Trang 40

23

Chương 2 Ậ V T LI ỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U

2.1 V Ậ T LIỆ U, HÓA CH T VÀ THI T B Ấ Ế Ị

2.1.1 V t u ậ liệ

- T bào BHK21, Ch ng rubella (ATCC) ế ủ

- L n gi ợ ống Yolkshire được ch n kh e m nh, có ngu n g c rõ ràng, không có ọ ỏ ạ ồ ố

kháng th ể rubella, được nuôi ~ 6 tu n tu i ầ ổ

- Thỏ ạ s ch có trọng lượng t 1,5-ừ 2,5 kg được ch n kho m nh, có ngu n gọ ẻ ạ ồ ốc

rõ ràng, không có kháng th rubella trong máu ể

- V c xin bán thành ph m rubella ắ ẩ trướ ọc l c

- Mẫu vắc xin thành ph m phẩ ối hợp sởi-rubella (MR) do POLYVAC sản xuất

- T bào RK13, t bào vero, t bào FL ế ế ế

2.1.2 Hóa ch t và thi ấ ết bị

- Các lo i hóa ch ạ ất:

o Hóa ch t s d ng cho s n xu t kháng nguyên: ấ ử ụ ả ấ MEM 5% CS, MEM 2%

CS, MEM 0% CS, CMF Hanks, Chất bảo qu n ả

o Hóa ch t s dấ ử ụng cho tiêm động vật: Tá dược hoàn ch nh CFA (M ) Tá ỉ ỹ

dược không hoàn ch nh IFA (M ), c n 70ỉ ỹ ồ 0vô trùng, Javen…

o Hóa ch t s d ng ki m tra chấ ử ụ ể ất lượng kháng huy t thanh: dung d ch ế ị

PPLO, môi trường LMI và LMII Thioglycolate (TGC), Soybean Casein ,

(SCD), Kit R- HI Seiken (Model: 320025, Denka Seiken - Nhật Bản)

o Hóa ch t s d ng cho kiấ ử ụ ểm định v c xin rubella: MEM 5%BS, MEM ắ

2%BS, H ng c u gà ho c chu t lang 0.2%, Hanks/PR(-),PBS (-),PBS (- ồ ầ ặ ộ ),

M199 5% FBS, glycerin, tween 80, aceton…

- D ng c ụ ụ:

o D ng c cho s n xu t kháng nguyên rubella: Pipet 10,50 ml (Pyrex - ụ ụ ả ấ

M ), Pipet Aid (Corning - M ), Micropipet 20 ~ 100µl, 200 ~ 1000µl ỹ ỹ

(Gilson Pháp); u típ 20 ~ 100 µl, 100 ~ 1000µl (Gilson Pháp); – Đầ –

Ống tuyp 2,15, 50 ml (Corning, M ); ỹ

Tiêu đề	Nghiên Cứu Sản Xuất Kháng Huyết Thanh Rubella Sử Dụng Cho Kiểm Định Vắc Xin Tại Việt Nam
Tác giả	Phạm Thành Trường
Người hướng dẫn	PGS.TS Trương Quốc Phong, TS. Ngô Thu Hường
Trường học	Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội
Chuyên ngành	Công Nghệ Sinh Học
Thể loại	Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học
Năm xuất bản	2018
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	93
Dung lượng	7,58 MB