Do đó, bên cạnh các biện pháp thủy lợi, việc nghiên cứu tạo giống ngô có khả năng thích ứng cao với điều kiện hạn hán là một trong những mục tiêu chính trong các chương trình lai tạo giố
Luận văn Khoa học Nghiên cứu ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thùy Linh NGHIÊN CỨU TẠO CÂY NGÔ CHUYỂN GEN DREB2.7 LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI Luận văn Khoa học Nghiên cứu TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - - Nguyễn Thùy Linh NGHIÊN CỨU TẠO CÂY NGÔ CHUYỂN GEN DREB2.7 LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420101.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC Hà Nội, 2018 TS Huỳnh Thị Thu Huệ TS Lê Hồng Điệp LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tôi, hướng dẫn khoa học TS Huỳnh Thị Thu Huệ TS Lê Hồng Điệp Các nội dung nghiên cứu, kết đề tài trung thực chưa công bố hình thức Luận văn Khoa học Nghiên cứu Luận văn sử dụng thông tin, số liệu từ báo nguồn tài liệu tác giả khác có trích dẫn thích nguồn gốc đầy đủ Nếu có gian lận tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm nội dung luận văn Học viên Nguyễn Thùy Linh LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô giáo khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội trang bị kiến thức cho suốt q trình học tập Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Huỳnh Thị Thu Huệ – Luận văn Khoa học Nghiên cứu Viện Nghiên cứu hệ gen TS Lê Hồng Điệp –Đại học Khoa học Tự nhiên tận tình bảo giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu đề tài hoàn chỉnh Luận văn Thạc sĩ Xin cảm ơn đề tài cấp nhà nước: ―Phân lập thiết kế gen chịu hạn phục vụ công tác tạo giống ngô biến đổi gen‖ Viện Nghiên cứu hệ gen chủ trì, Bộ Nơng nghiệp Phát triển nông thôn chủ quản hỗ trợ phương diện để thực nghiên cứu Tơi xin cảm ơn cán Phịng Đa dạng sinh học hệ gen - Viện Nghiên cứu hệ gen tạo điều kiện, giúp đỡ cho tơi hồn thành đề tài nghiên cứu Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đồng nghiệp sát cánh hỗ trợ động viên vật chất tinh thần suốt trình học tập nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn! i Hà Nội, ngày tháng Học viên Nguyễn Thùy Linh năm MỤC LỤC MỤC LỤC ii DANH MỤC HÌNH iv DANH MỤC BẢNG vi BẢNG KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vii Luận văn Khoa học Nghiên cứu MỞ ĐẦU Chƣơng - TỔNG QUAN 1.1 Cây ngô hạn hán 1.1.1 Tình hình ngơ nước ta 1.1.2 Hạn hán ảnh hưởng đến suất ngô 1.1.3 Nâng cao suất ngô điều kiện hạn hán 1.2 Nghiên cứu tạo ngô biến đổi gen chịu hạn 1.2.1 Tình hình nghiên cứu tạo giống ngô biến đổi gen giới 1.2.2 Tình hình nghiên cứu tạo giông ngô biến đổi gen chịu hạn giới 1.2.3 Tình hình nghiên cứu ngô biến đổi gen Việt Nam 1.3 Tính trạng chịu hạn thực vật nhân tố phiên mã DREB 10 1.3.1 Cơ sở phân tử tính chống chịu hạn thực vật 10 1.3.2 Họ nhân tố phiên mã DREB 12 1.3.3 Nhân tố phiên mã ZmDREB2.7 13 Chƣơng - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 15 2.1 Vật liệu 15 2.1.1 Mẫu thực vật 15 2.1.2 Chủng vi khuẩn, vector mồi 15 2.1.3 Hóa chất mơi trường 17 2.1.4 Thiết bị nghiên cứu 18 2.2 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Tách chiết DNA 19 2.2.2 Tách chiết RNA tổng hợp cDNA 20 2.2.3 Phương pháp PCR 21 2.2.4 Tinh DNA 21 ii 2.2.5 Tạo tế bào khả biến E coli biến nạp sốc nhiệt 21 2.2.6 Tạo tế bào khả biến A tumefaciens biến nạp xung điện 22 2.2.7 Nhân dòng gen ZmDREB2.7tv 22 2.2.8 Tạo vector biểu thực vật pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7tv: :polyA 23 2.2.9 Chuyển gen vào ngô thông qua vi khuẩn A tumefaciens 24 Luận văn Khoa học Nghiên cứu 2.2.10 Real-time PCR định lượng để ước lượng số gen chuyển gen 26 2.2.11 Real-time PCR định lượng để đánh giá biểu gen chuyển gen 27 2.2.12 Phân tích chuyển gen 28 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Kết phân lập gen ZmDREB2.7tv từ ngô Tẻ vàng 29 3.1.1 Tách chiết DNA tổng số từ ngô Tẻ vàng 29 3.1.2 Phân lập tạo dòng gen ZmDREB2.7tv 30 3.1.3 Phân tích trình tự gen ZmDREB2.7tv 32 3.2 Kết thiết kế vector biểu thực vật mang gen ZmDREB2.7tv 35 3.2.1 Thiết kế vector trung gian pRTL2/rd29A::ZmDREB2.7tv 35 3.2.2 Thiết kế vector biểu pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7tv 39 3.2.3 Tạo chủng A tumefaciens EHA105 mang vector biểu 42 3.3 Kết tạo ngô biến đổi gen mang gen ZmDREB2.7tv 42 3.3.1 Chuyển gen ZmDREB2.7tv vào ngô hệ T0 42 3.3.2 Đánh giá chuyển gen hệ T0 47 3.3.3 Tạo đánh giá chuyển gen hệ T1 50 3.3.4 hệ T1 Ước lượng số gen ZmDREB2.7tv chuyển gen 51 3.3.5 Đánh giá biểu tương đối gen ZmDREB2.7tv chuyển gen hệ T2 53 KẾT LUẬN 56 KIẾN NGHỊ 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 iii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Tổng sản lượng ngơ tiêu thụ theo năm tài giai đoạn 2015-2018 nước ta Hình 1.2 Số lượng thử nghiệm biến đổi gen đồng ruộng qua năm [32] Luận văn Khoa học Nghiên cứu Hình 1.3 Số lượng thử nghiệm đồng ruộng biến đổi gen chịu hạn [32] Hình 1.4 Các nhóm protein tham gia vào q trình đáp ứng gặp hạn [28] 11 Hình 2.1 Phương pháp tạo vector biểu mang gen ZmDREB2.7tv 24 Hình 3.1 Điện di đồ kiểm tra DNA tổng số từ ba mẫu ngơ Tẻ vàng 29 Hình 3.2 Điện di đồ plasmid tách từ khuẩn lạc tái tổ hợp pJET1.2/ZmDREB2.7tv 31 Hình 3.3 Điện di đồ sản phẩm xử lý plasmid pJET1.2/ZmDREB2.7tv enzyme giới hạn BglII 32 Hình 3.4 Kết so sánh trình tự ZmDREB2tv phân lập từ giống ngơ Tẻ vàng trình tự tham chiếu ngơ B73 cơng cụ BioEdit 34 Hình 3.5 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại vùng mã hóa gen ZmDREB2.7tv 36 Hình 3.6 Điện di đồ plasmid tách từ khuẩn lạc tái tổ hợp pRTL2/rd29A: :ZmDREB2.7tv 37 Hình 3.7 Kết kiểm tra plasmid pRTL2/rd29A::ZmDREB2.7tv 38 Hình 3.8 Điện di đồ plasmid tách từ khuẩn lạc tái tổ hợp pCAMBIA1300/ rd29A::ZmDREB2.7tv 40 Hình 3.9 Kết tạo plasmid pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7tv 41 Hình 3.10 Điện di đồ sản phẩm PCR kiểm tra vi khuẩn A tumefaciens EHA105 mang vector chuyển gen thực vật pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7::polyA 42 Hình 3.11 Q trình chuyển gen vào ngơ trung gian qua vi khuẩn Agrobacterium 43 Hình 3.12 Điện di đồ DNA tổng số tách từ chuyển gen ZmDREB2.7tv hệ T0 47 Hình 3.13 Điện di đồ sản phẩm PCR kiểm tra có mặt đoạn rd29A::ZmDREB2.7tv chuyển gen hệ T0 48 iv Hình 3.14 Điện di đồ sản phẩm PCR kiểm tra có mặt gen HygR chuyển gen hệ T0 49 Hình 3.16 Điện di đồ sản phẩm kiểm tra có mặt gen quan tâm chuyển gen ZmDREB2.7tv hệ T2 54 Luận văn Khoa học Nghiên cứu Hình 3.17 Kết đánh giá mức độ biểu tương đối gen ZmDREB2.7 chuyển gen gặp hạn 54 v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Danh sách cặp mồi sử dụng nghiên cứu 16 Bảng 2.2 Thành phần môi trường sử dụng nghiên cứu 17 Bảng 3.1 Kết chuyển gen ZmDREB2.7tv vào ngô 46 Luận văn Khoa học Nghiên cứu Bảng 3.2: Kết phân ly gen ZmDREB2tv chuyển gen hệ T1 50 Bảng 3.3 Đường chuẩn khuếch đại hai gen ZmDREB2.7tv Glb-1 52 Bảng 3.4 Giá trị Ct số lượng gen ZmDREB2.7tv chuyển gen hệ T1 53 vi BẢNG KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Gen actin-1 AP2/ERF2 AP2/ethylene-responsive element-binding AS Acetone syringone CBF C-repeat Binding Factors DNA Deoxyribonucleic acid DREB Dehydration-responsive element-binding Glb-1 Gen globulin-1 HygR Gen hygromycin ISAAA Luận văn Khoa học Nghiên cứu Actin-1 International Service for the Acquisition of Agribiotech Applications KL Khuẩn Lạc MS Murashige and Skoog Medium PCR Polymerization Chain Reaction rd29A Gen/promoter gen rd29A RNA Ribonucleic acid USDA The United States Department of Agriculture ZmDREB2.7tv Gen ZmDREB2.7 phân lập từ ngô Tẻ vàng vii Như vậy, sau đợt chuyển gen, từ 3037 phôi ban đầu tạo 76 chuyển gen T0 sống sót trồng nhà lưới (Bảng 3.1) Các thu để tiến hành tách chiết DNA tổng số đánh giá có mặt gen ZmDREB2.7tv 3.3.2 Đánh giá chuyển gen hệ T0 Luận văn Khoa học Nghiên cứu Các tái sinh hệ T0 đánh giá mức độ phân tử thí nghiệm PCR Ban đầu, thu tách chiết DNA tổng số Kết trình bày hình 3.12 cho thấy DNA tách chiết từ tái sinh hệ T0 có số đứt gãy đảm bảo chất lượng cho thí nghiệm Hình 3.12 Điện di đồ DNA tổng số tách từ chuyển gen ZmDREB2.7tv hệ T0 - 12: DNA tổng số chuyển gen tương ứng Để đánh giá có mặt gen ZmDREB2.7tv, phản ứng PCR thực sử dụng cặp mồi nhân đoạn từ cuối promoter rd29A (rd29A_F) đến cuối gen (ZmDREB2.7_SacI_R) Do ngơ có gen nội sinh ZmDREB2.7, việc sử dụng cặp mồi tránh tượng dương tính giả, nhờ mang cấu trúc rd29A::ZmDREB2.7tv cho băng sản phẩm PCR điện di Kết PCR với DNA tổng số WT cho thấy không cho băng sản phầm PCR với kích thước lý thuyết (Hình 3.13) Điều chứng tỏ việc sử dụng cặp mồi hiệu việc sàng lọc chuyển gen Trong đó, vài 47 chuyển gen T0 thu sản phẩm PCR với kích thước mong muốn (Hình 3.13, Luận văn Khoa học Nghiên cứu đường chạy số - 5, - 11) Hình 3.13 Điện di đồ sản phẩm PCR kiểm tra có mặt đoạn rd29A::ZmDREB2.7tv chuyển gen hệ T0 M: GeneRulerTM 1kb DNA Ladder (Thermo Scientific) + : Sản phẩm PCR với khuôn plasmid pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7::polyA; - : Sản phẩm PCR với khuôn DNA tổng số không chuyển gen;1-14: Sản phẩm PCR với khuôn DNA tổng số chuyển gen ZmDREB2.7tv tương ứng Đồng thời, bên cạnh việc xác định có mặt gen quan tâm, có mặt gen thị HygR chuyển gen kiểm tra thí nghiệm PCR Đơi khi, kể có mặt gen quan tâm, phản ứng PCR khơng khuếch đại gây tượng âm tính giả Việc kiểm tra đồng thời có mặt HygR giúp đảm bảo chắn thu có tiềm Hình 3.14 cho thấy chuyển gen dương tính với đoạn rd29A::ZmDREB2.7tv dương tính với gen HygR 48 Hình 3.14 Điện di đồ sản phẩm PCR kiểm tra có mặt gen HygR chuyển Luận văn Khoa học Nghiên cứu gen hệ T0 M: GeneRulerTM 1kb DNA Ladder (Thermo Scientific) +: Sản phẩm PCR với khuôn plasmid pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7::polyA; - : Sản phẩm PCR với khuôn DNA tổng số không chuyển gen;1-11: Sản phẩm PCR với khuôn DNA tổng số chuyển gen tương ứng Từ kết sàng lọc thí nghiệm PCR tổng số 76 T0 tái sinh, 30 chuyển gen hệ T0 dương tính đồng thời với có mặt đoạn rd29A::ZmDREB2.7tv gen HygR Có thể thấy, tỷ lệ tái sinh mang gen ZmDREB2.7tv không cao (30/91 = 32,97%) Điều kết nhiều mơ sẹo khơng nhận gen chuyển có khả thoát khỏi áp lực chọn lọc hygromycin sau đó, có hội tái sinh thành hồn chỉnh Khi mơi trường chọn lọc, mơ sẹo thực chất thể khảm bao gồm tế bào có chèn TDNA tế bào bình thường ban đầu Mặc dù đặt áp lực chọn lọc, tế bào không chứa T-DNA bảo vệ kích thước mơ sẹo lớn [15] Điều giúp tế bào không chuyển gen có khả sống sót phát triển Hơn nữa, phân tách mô sẹo chuyển sang môi trường tái sinh 2, tế bào bình thường phát triển thành bình thường khơng cịn kháng sinh hygromycin môi trường Đồng thời, mật độ cao mơ sẹo đĩa petri nguyên nhân giúp tế bào không chứa cấu trúc mang gen ZmDREB2.7tv sống sót Hiệu suất chuyển gen tính tổng số tái sinh mang gen chuyển tổng số phôi lây nhiễm với giá trị trung bình ba lần chuyển gen 0,99% Con số tương đối thấp so với công bố giới, nhiên cao so với vài cơng bố nước ta Ngun nhân nghiên cứu 49 trước tiến hành chuyển gen ngô nguyên liệu khác Năm 2014, Huỳnh Thị Thu Huệ cộng thực chuyển gen vào nguyên liệu mô sẹo ba dòng V152N, C436 C7N với hiệu suất chuyển gen 0,9%, 0,28% 0,5% [5] Như vậy, đặc điểm dòng nguyên liệu chuyển gen Luận văn Khoa học Nghiên cứu có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất chuyển gen Tạo đánh giá chuyển gen hệ T1 3.3.3 Nhìn chung, T0 thường có kiểu hình thấp bé cịi cọc so với khơng chuyển gen Trong số 17 chuyển gen T0 dương tính với đoạn rd29A::ZmDREB2.7tv gen HygR, phát sinh cờ bắp bình thường tự thụ phấn Các cịn lại có kích thước bắp cờ bé, thời gian tung phấn tung râu không đồng thời Bảng 3.2: Kết phân ly gen ZmDREB2tv chuyển gen hệ T1 Số T1 Tỷ lệ nảy mầm (%) Cây T1 dƣơng tính với gen đích Cây T1 âm tính với gen đích Tỷ lệ phân ly Giá trị chi bình phƣơng (χ2) 17 10 58,82 - - D5 19 10 52,63 3:1 1,2 D6 15 10 66,67 - - D7 28 21 75,00 17 - - D14 31 13 41,93 11 3:1 0,64 D15 35 20 57,14 14 - - Tên dòng T0 hữu thụ Số hạt T1 D4 Số lượng hạt T1 T0 hạn chế kích thước bắp T0 nhỏ, số lượng hạt phấn Tổng cộng, T0 thu 145 hạt T1 Các hạt T1 thường nhỏ, có nhiều hạt lép nên tỷ lệ nảy mầm thành hạt T1 không cao với giá trị nằm từ 41 - 75% (Bảng 3.2) Các dịng T1 kí hiệu, theo dõi chăm 50 sóc theo T0 tương ứng Lá T1 thu thập, tách chiết DNA sàng lọc phản ứng PCR Dựa số lượng T1 dương tính với có mặt gen đích qua kết PCR, thử nghiệm chi bình phương sử dụng để xác định tỷ lệ phân ly phù hợp Luận văn Khoa học Nghiên cứu cho dòng T1 Có thể nhận thấy, dịng T1 khảo sát, bốn tập hợp có tỷ lệ phân ly bất thường (Bảng 3.2) Điều T1 khảo sát có số lượng thấp khơng mang tính đại diện cho quần thể Ngun nhân hạt T1 có khả nảy mầm khơng cao khơng đồng Trong đó, hai dòng D5 D14 phân ly phù hợp với tỷ lệ 3:1 Điều cho thấy gen chuyển sát nhập vào hệ gen ngô T0 vị trí (một locus), gen di truyền cho hệ theo định luật phân ly Mendel (Bảng 3.2) 3.3.4 Ước lượng số gen ZmDREB2.7tv chuyển gen hệ T1 Từ kết sàng lọc PCR phân tích quy luật phân ly gen ZmDREB2.7tv hệ T1, hai dòng D5 D14 cho có mang gen chuyển locus định hệ gen Để khảo sát kiểm chứng kĩ hơn, số gen ZmDREB2.7tv ước lượng phương pháp real-time PCR định lượng T1 dương tính dịng D5 Đường chuẩn gen xây dựng dựa theo phương pháp mô tả mục 2.2.10 với thông số liệt kê bảng 3.3 Các số hai đường chuẩn cho kết chấp nhận Từ thông số đường chuẩn (Bảng 3.3) giá trị chu kì ngưỡng trung bình mẫu thí nghiệm (Bảng 3.4), tỷ lệ Z0/G0 tính tốn dựa công thức {1} (Mục 2.2.10 phần phương pháp) 51 Bảng 3.3 Đường chuẩn khuếch đại hai gen ZmDREB2.7tv Glb-1 Thông số ZmDREB2.7tv Glb-1 -3,47 -3,95 Hiệu suất phản ứng 1,94 1,79 0,27 0,9 Hệ số tương đương (R2) 0,99 0,94 Số chu kì bão hịa (Y-intercept (I) 20,3 24,81 Error Luận văn Khoa học Nghiên cứu Hệ số góc (S) Glb-1 gen quản gia (house-keeping gene) cây, mã hóa cho protein globulin-1 kiểm tra sở liệu maizegdb.org có ngơ Do đó, gen Glb-1 sử dụng để làm gen nội chuẩn cho thí nghiệm Cặp mồi nhân đặc hiệu đoạn gen Glb-1 thiết kế kiểm tra công cụ primer-BLAST để đảm bảo không khuếch đại đoạn không đặc hiệu ngơ dẫn đến kết ước lượng sai Cặp mồi nhân đoạn gen ZmDREB2.7tv gồm mồi ngược nhận biết vị trí gen mồi xi nhận biết vị trí promoter rd29A Điều giúp phản ứng real-time PCR không khuếch đại gen ZmDREB2.7 nội sinh ngô K7 ảnh hưởng đến kết thí nghiệm Do dịng K7 sử dụng thí nghiệm chuyển gen dịng thuần, gen Glb-1 coi nằm locus trạng thái đồng hợp, tức mang hai gen hệ gen chuyển gen Như vậy, từ tỷ lệ Z0/G0 ước lượng số gen ZmDREB2.7tv chuyển gen hệ T1 52 Bảng 3.4 Giá trị Ct số lượng gen ZmDREB2.7tv chuyển gen hệ T1 Cây T1 Giá trị CtZ trung bình Z0/G0 Số gen ZmDREB2.7tv 0,39 36,09 0,50 36,34 0,44 36,4 1,11 35,61 0,53 39,71 0,47 Glb-1 D5.1 31,60 36,07 D5.4 31,25 D5.5 31,68 D5.8 30,33 D5.9 30,75 D5.10 34,53 Luận văn Khoa học Nghiên cứu ZmDREB2.7tv Trong số T1 dương tính với có mặt gen ZmDREB2.7tv, mang gen ZmDREB2.7tv, điều hiểu gen ZmDREB2.7tv sát nhập vị trí hệ gen trạng thái dị hợp (Bảng 3.4) Cây T1 lại - D5.8 cho tỷ lệ Z0/G0 xấp xỉ nên cho có hai gen ZmDREB2.7tv Với kết phân tích phân ly mục 3.3.4 kết real-time PCR định lượng T1 nói trên, cho T1 D5.8 mang gen ZmDREB2.7tv locus hệ gen trạng thái đồng hợp tử 3.3.5 Đánh giá biểu tương đối gen ZmDREB2.7tv chuyển gen hệ T2 Mức độ biểu tương đối gen ZmDREB2.7 đánh giá chuyển gen hệ T2 mức độ phiên mã hai điều kiện thí nghiệm: bình thường hạn Các hạt T2 có nguồn gốc từ T1 D5.8 gieo kiểm tra có mặt gen ZmDREB2.7tv thí nghiệm PCR trước tiến hành đánh giá biểu gen quan tâm (Hình 3.16) 53 Luận văn Khoa học Nghiên cứu Hình 3.16 Điện di đồ sản phẩm kiểm tra có mặt gen quan tâm chuyển gen ZmDREB2.7tv hệ T2 1: Sản phẩm PCR với khuôn plasmid pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7::polyA; 2: Sản phẩm PCR với khuôn DNA tổng số không chuyển gen;3-4: Sản phẩm PCR với khuôn DNA tổng số chuyển gen hệ T2 T1 D5.8 Như mô tả phần phương pháp, không chuyển gen chuyển gen ZmDREB2.7tv dương tính với có mặt gen quan tâm gây hạn nhân tạo dung dịch PEG6000 20% Lá thu để đánh giá mức độ biểu gen ZmDREB2.7 ngô giai đoạn trước xử lý (0h) sau xử lý hạn (6h) Hình 3.17 Kết đánh giá mức độ biểu tương đối gen ZmDREB2.7 chuyển gen gặp hạn 54 Do cặp mồi thiết kế nằm vùng trình tự mã hóa gen ZmDREB2.7tv, sản phẩm gen ZmDREB2.7 nội sinh khuếch đại Vì vậy, kết phản ứng real-time PCR định lượng thể mức độ biểu tương đối gen ZmDREB2.7 nói chung (Hình 3.17) Trước xử lý hạn (điều kiện bình thường), biểu gen ZmDREB2.7 tương đương không chuyển Luận văn Khoa học Nghiên cứu gen không chuyển gen gen ZmDREB2.7tv điều khiển promoter cảm ứng rd29A Tuy nhiên, sau xử lý hạn, mức độ biểu gen ZmDREB2.7 tăng lên đáng kể tất thí nghiệm Trong đó, hai chuyển gen có mức độ biểu gen ZmDREB2.7 cao so với không chuyển gen Điều giải thích bên cạnh gen ZmDREB2.7 nội sinh, chuyển gen có thêm gen ZmDREB2.7tv số lượng sản phẩm phiên mã tăng lên Như vậy, chuyển gen hệ T2 có biểu cấu trúc chuyển gen ZmDREB2.7tv mức độ phiên mã đáp ứng với điều kiện thiếu nước 55 KẾT LUẬN Đã phân lập xác định trình tự nucleotide đoạn mang gen DREB2.7 từ giống ngô địa phương chịu hạn Tẻ vàng Gen ZmDREB2.7tv có độ tương đồng 98% so với gen ZmDREB2.7 ngô tham chiếu B73 Protein suy diễn DNA bảo toàn Luận văn Khoa học Nghiên cứu ZmDREB2.7tv có vài thay đổi trình tự amino acid nhiên vùng bám Đã thiết kế vector trung gian vector chuyển gen thực vật mang đoạn trình tự mã hóa gen ZmDREB2.7tv, đó, đoạn gen ZmDREB2.7tv điều hịa promoter cảm ứng với hạn rd29A Đồng thời, tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA105 mang vector chuyển gen thực vật pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7tv::polyA Đã tạo ngô chuyển gen ZmDREB2.7tv với hiệu suất chuyển gen đạt 0,99% Cây chuyển gen kiểm chứng thí nghiệm sinh học phân tử để đánh giá có mặt, ước lượng số lượng đánh giá biểu cấu trúc rd29A::ZmDREB2.7tv mức độ phiên mã Cây chuyển gen hệ T2 thuộc dòng D5.8 mang gen ZmDREB2.7tv cho thấy tăng cường biểu gen thí nghiệm xử lý hạn nhân tạo 56 KIẾN NGHỊ Thực thí nghiệm để kiểm tra ảnh hưởng gen ZmDREB2.7tv lên gen khác liên quan đến đường chống chịu hạn gen Luận văn Khoa học Nghiên cứu Thực thí nghiệm đánh giá sinh lý, sinh hóa chuyển Thực thí nghiệm đánh giá tính trạng chịu hạn chuyển gen nhà lưới giai đoạn khác 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn (2017), Báo cáo kết thực kế hoạch tháng 12 năm 2017 Ngành Nông nghiệp Phát triển nông thôn Luận văn Khoa học Nghiên cứu https://www.mard.gov.vn/ThongKe/Lists/BaoCaoThongKe/Attachments/132 /Baocao_T12_2017.pdf Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Hữu Kiên (2013), ‖Thiết kế vector biểu gen chịu hạn NTCB-ZmNF-YB2 ngơ‖ Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nông thôn, 7, tr 31-37 Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Anh Vũ, Nguyễn Hữu Kiên, Dương Tuấn Bảo (2013), ‖Nghiên cứu biến nạp gen liên quan đến khả kháng hạn thuốc trừ cỏ vào giống đậu tương ĐT22‖ Tạp chí Khoa học cơng nghệ, 11, tr.3-9 Nguyễn Văn Đồng, Phạm Thị Lý Thu, Lê Thị Mai Hương, Phạm Thị Hương, Lê Thị Lan, Nguyễn Chiến Hữu, Nguyễn Hữu Kiên, Trần Duy Hưng, Lê Huy Hàm (2015), ‖Nghiên cứu chuyển gen chịu hạn NF-YB2 vào số dịng ngơ Việt Nam‖ Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nông thôn, 7, e.3530 Huỳnh Thị Thu Huệ, Nguyễn Văn Trường, Bùi Mạnh Minh, Đồn Thị Bích THảo, Nguyễn Xuân Thắng, Nông Văn Hải, Bùi Mạnh Cường (2014), ‖Thiết kế vector biểu mang gen modiCspB chuyển gen vào ngơ‖ Tạp chí cơng nghệ sinh học, 12(1), tr 125 – 132 Tài liệu Tiếng Anh Ashraf, M., & Akram, N A (2009), ―Improving salinity tolerance of plants through conventional breeding and genetic engineering: an analytical comparison‖ Biotechnology advances, 27(6), pp 744-752 Brookes, G., Barfoot, P (2017), ―Farm income and production impacts of using GM crop technology 1996–2015‖ GM crops & food, 8(3), pp 156-193 Chapman, S C., Edmeades, G O (1999), ―Selection improves drought tolerance in tropical maize populations: II Direct and correlated responses among secondary traits‖ Crop Science, 39(5), pp 1315-1324 58 Chaves, M M., Maroco, J P., & Pereira, J S (2003), ―Understanding plant responses to drought—from genes to the whole plant‖ Functional plant biology, 30(3), pp 239-264 10 Chen, J Q., Meng, X P., Zhang, Y., Xia, M., & Wang, X P (2008), ―Over- Luận văn Khoa học Nghiên cứu expression of OsDREB genes lead to enhanced drought tolerance in rice‖ Biotechnology letters, 30(12), pp 2191-2198 11 Chen, J., Xia, X., & Yin, W (2009) ―Expression profiling and functional characterization of a DREB2-type gene from Populus euphratica” Biochemical and Biophysical Research Communications, 378(3), pp.483487 12 Claassen, M M., & Shaw, R H (1970), ―Water deficit effects on corn I Grain components‖ Agronomy journal, 62(5), pp 652-655 13 Edmeades, G.O., Bolaños, J J., Elings, A., Ribaut, J-M., Bänziger, M., Westgate., M E (2000), The role and regulation of the anthesis-silking interval in maize pp 43-73 In: M.E Westgate and K.J Boote (eds.) Physiology and modeling kernel set in maize CSSA Special Publication No 29 CSSA, Madison, WI 14 Frame, B., Warnberg, K., Main, M., Wang., K (2015), Maize (Zea mays L.) In Wang K, eds Agrobacterium Protocols Methods in Molecular Biology, vol 1223 Springer, New York, NY 15 Fromm, M E., Morrish, F., Armstrong, C., Williams, R., Thomas, J., Klein, T M (1990), ―Inheritance and expression of chimeric genes in the progeny of transgenic maize plants‖ Nature Biotechnology, 8(9), pp.833-839 16 Haake, V., Cook, D., Riechmann, J., Pineda, O., Thomashow, M F., & Zhang, J Z (2002), ―Transcription factor CBF4 is a regulator of drought adaptation in Arabidopsis‖ Plant physiology, 130(2), pp 639-648 17 Hu, H., Xiong, L (2014), ―Genetic engineering and breeding of droughtresistant crops‖ Annual review of plant biology, 65, pp 715-741 18 ISAAA 2016 Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2016 ISAAA Brief No 52 ISAAA: Ithaca, NY 19 ISAAA 2017 Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops in 2017: Biotech Crop Adoption Surges as Economic Benefits Accumulate in 22 Years ISAAA Brief No 53 ISAAA: Ithaca, NY 59 20 Kasuga, M., Miura, S., Shinozaki, K., & Yamaguchi-Shinozaki, K (2004), ―A combination of the Arabidopsis DREB1A gene and stress-inducible rd29A promoter improved drought-and low-temperature stress tolerance in tobacco by gene transfer‖ Plant and Cell Physiology, 45(3), pp.346-350 Luận văn Khoa học Nghiên cứu 21 Liu, Q., Kasuga, M., Sakuma, Y., Abe, H., Miura, S., Yamaguchi-Shinozaki, K., & Shinozaki, K (1998), ―Two transcription factors, DREB1 and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought-and low-temperature-responsive gene expression, respectively, in Arabidopsis‖ The Plant Cell, 10(8), pp 13911406 22 Liu, S., Wang, X., Wang, H., Xin, H., Yang, X., Yan, J., & Qin, F (2013), ―Genome-wide analysis of ZmDREB genes and their association with natural variation in drought tolerance at seedling stage of Zea mays L‖ PLoS genetics, 9(9), e1003790 23 Novillo, F., Alonso, J M., Ecker, J R., & Salinas, J (2004), ―CBF2/DREB1C is a negative regulator of CBF1/DREB1B and CBF3/DREB1A expression and plays a central role in stress tolerance in Arabidopsis” Proceedings of the National Academy of Sciences, 101(11), pp 3985-3990 24 Ohme-Takagi, M., Shinshi, H (1995), ―Ethylene-inducible DNA binding proteins that interact with an ethylene-responsive element‖ Plant Cell, 7, pp 173–182 25 Rogers, S O., & Bendich, A J (1989), ―Extraction of DNA from plant tissues‖ In Plant molecular biology manual, pp 73-83 Springer, Dordrecht 26 Sakuma, Y., Maruyama, K., Osakabe, Y., Qin, F., Seki, M., Shinozaki, K., & Yamaguchi-Shinozaki, K (2006), ―Functional analysis of an Arabidopsis transcription factor, DREB2A, involved in drought-responsive gene expression‖ The Plant Cell, 18(5), pp 1292-1309 27 Sambrook, J., Fritsch, E F., & Maniatis, T (1989), Molecular cloning: a laboratory manual (No Ed 2) Cold spring harbor laboratory press 28 Wang, H., & Qin, F (2017), ―Genome-wide association study reveals natural variations contributing to drought resistance in crops‖ Frontiers in plant science, 8, pp 1110 29 Weng, H., Pan, A., Yang, L., Zhang, C., Liu, Z., & Zhang, D (2004), ―Estimating number of transgene copies in transgenic rapeseed by real-time 60 PCR assay withHMG I/Y as an endogenous reference gene‖ Plant Molecular Biology Reporter, 22(3), pp.289-300 30 Yoshida, T., Mogami, J., & Yamaguchi-Shinozaki, K (2014), ―ABA-dependent and ABA-independent signaling in response to osmotic stress in plants‖ Trang web Luận văn Khoa học Nghiên cứu Current opinion in plant biology, 21, pp 133-139 31 FAO, http://www.fao.org/faostat/en/#data/QC, cập nhật ngày 28/05/2018 32 USDA, https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/biotechnology/permitsnotifications-petitions/sapermits/ctstatus, cập nhật ngày 19/11/2018 33 USDA (2018) ―World Agricultural Production, Circular Series WAP 11-18‖ Released 08/11/2018 https://usda.library.cornell.edu/concern/publications/5q47rn72z?locale=en 61