Ứng dụng công nghệ nano vào y học bằng cách dùng các dạng vật liệu ở kích thước nano để tương tác với yếu tố sinh học ở mức tế bào hay xuống thấp hơn nữa ở cấp phân tử, ví dụ dẫn th
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Dòng tế bào ưng thư và các điều kiện nuôi
Dòng tế bào ung thư phổi A549 được mua từ bộ sưu tấp giống của Hoa
Kỳ (American Type Culture Collection- ATCC Manassas, Hoa Kỳ) Tế bào ung thư phổi A549 được nuôi trong môi trường DMEM có bổ sung L-
Luận văn Khoa học Nghiên cứu
30 glutamine 2 mM, HEPES 10 mM, natri pyruvate 1.0 mM và huyết thanh phôi bò 10% (FBS; Gibco, Hoa Kỳ) trong tủ ấm ở 37 o C chứa CO2 5%
Nguyên liệu thực vật
Vỏ quả măng cụt được thu mua từ tỉnh Bình Dương đã được xác định tên khoa học là Garcinia mangostana với sự hỗ trợ của Viện sinh thái và Tài nguyên vi sinh vật.
L Nguyên liệu được sấy khô trong tủ ấm ở 60 o C, nghiền thành bột mịn và sau đó được ngâm chiết trong ethanol 96% theo tỉ lệ 1 nguyên liệu: 3 thể tích dung môi Dịch chiết rút sau đó được cô chân không và sử dụng như nguyên liệu khởi đầu cho các bước tinh sạch tiếp theo.
Hóa chất, thiết bị
-Bản silica gel tráng sẵn (Silicagel 60 F254) được mua từ hãng Mecrk (Đức)
-Hạt Silica gel cho chạy cột sắc ký (Grade 7734, 63-200 μm, 70-
230 mesh) được mua từ hãng Mecrk (Đức)
-Alpha, Beta và Hydroxy - β cyclodextrin được mua từ hãng Sigma (Hoa Kỳ) Eudragit RS 100 và RL 100 mua từ hãng Evonik (Singapore)
-Các dung môi dùng trong sắc ký có độ sạch phân tích và có nguồn gốc từ Trung Quốc
-Môi trường nuôi cấy tế bào (Invitrogen, Hoa Kỳ)
-Tất cả các hoá chất đều đạt độ tinh khiết cho phân tích
- Ống thủy tinh sắc ký
Luận văn Khoa học Nghiên cứu
- Máy soi bản gel sắc ký lớp mỏng
- Máy quay cất khô chân không
- Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao
- Kính hiển vi đồng tụ quét laser
Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Tinh sạch AMG từ vỏ quả măng cụt
2.4.1.1 Tách các hợp chất polyphenol bằng sắc ký lớp mỏng (TLC)
Phân tích sắc ký được thực hiện trên các bản sắc ký đã được chuẩn bị sẵn có độ dày 1mm (Silicagel 60 F254, Merck) Các hệ dung môi phân tích được sử dụng bao gồm ba loại: Toluene: ethyl acetate: acetone: formic acid (TEAF) theo tỷ lệ 5: 3: 2: 1; n-Hexane: acetone theo tỷ lệ 3:1 và 2:1; và n-Hexane: ethyl acetate theo tỷ lệ 3:1 Sau khi chạy sắc ký xong, bản sắc ký được làm khô ở nhiệt độ phòng và màu sắc các vạch được quan sát dưới ánh sáng thường hoặc xông hơi.
2.4.1.2 Sắc ký cột silica gel
Sắc ký là phương pháp tách, phân li, phân tích các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa pha động và pha tĩnh Đối với sắc ký cột, quá trình này diễn ra khi mẫu chất được phân tách di chuyển qua cột sắc ký, nơi pha tĩnh giữ lại một số chất và pha động đẩy các chất khác đi qua, giúp phân tích và xác định thành phần của mẫu chất.
Pha tĩnh là một thành phần quan trọng trong quá trình tách và phân tích mẫu, thường được làm từ alumin hoặc silica gel đã qua xử lý Pha tĩnh này được nạp nén vào trong một cột có kích thước xác định, được tính toán dựa trên lượng mẫu sẽ nạp lên cột, nhằm đảm bảo hiệu suất tách và phân tích mẫu đạt được tối ưu.
- Pha động : là chất lỏng, được gọi là dung môi rửa giải
Trong thí nghiệm này, phân đoạn chứa chất quan tâm được phân tách trên các cột sắc ký nhồi hạt silica có kích thước 70 - 230 mesh (Merck) sử dụng hệ
Luận văn Khoa học Nghiên cứu
32 dung môi đã lựa chọn với các bước gradient khác nhau Các phân đoạn tinh sạch sau đó được kiểm tra độ sạch bằng sắc ký lớp mỏng và đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 HNMR, 13 C NMR (Bruker Avance - 500, Hoa Kỳ)
2.4.1.3 Phân tích cấu trúc hóa học bằng cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Đối với phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân, chất nghiên cứu sau khi được đưa vào vùng từ trường Bo sẽ bị tách thành những proton có các mức năng lượng khác nhau từ thấp đến cao Sự khác nhau này được phản ánh thông qua tần số cộng hưởng Tần số này được ghi lại dưới dạng các phổ proton, carbon, HMBC, HPQC, COSY, NOESY nhờ máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker, Avance 500 (Hoa kỳ) Dựa vào độ dịch chuyển của các proton khi giải các phổ trên sẽ xác định được số nguyên tử C, H cũng như những nhóm chức có thể tham gia vào bộ khung carbon Kết hợp với những số liệu thu được từ máy đo khối phổ sẽ cho phép xác định cấu trúc hoá học của chất cần nghiên cứu
2.4.2 Tạo hạt nano polyme micelle bọc AMG (nanomangostin) và đánh giá các đặc trưng của hạt
2.4.2.1 Phương pháp tổng hợp vật liệu hạt nanomangostin
Phương pháp khuyếch tán dung dịch sẽ được sử dụng để tổng hợp hạt nanomangostin Các vật liệu polymer mang như α, β, hdroxy- β cyclodextrin, Eudragit RS/RL 100, sẽ được thử nghiệm để tạo hạt nanomangostin Đây là những chất mang có cấu trúc đơn giản, tan tốt trong nước vàan toàn sinh học, chưa được sử dụng trong các nghiên cứu tạo hạt nanomangostin trước đây [13]
2.4.2.2 Xác định thế zeta của hạt
The surface charge and particle size distribution of nanomangostin particles were determined using a Dynamic Light Scattering system (DLS, Zetasizer Ver.6.20, Malvern Instruments – UK), providing valuable insights into their physical properties.
Luận văn Khoa học Nghiên cứu
2.4.2.3 Xác định kích thước hạt
Hình thái và kích thước hạt nanomangostin được xác định bằng cách sử dụng kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường FE-SEM (Field Emission Scanning Electron Microscope) và kính hiển vi đồng tụ quét laser, giúp cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc và kích thước của hạt nanomangostin.
2.4.2.4 Xác định hàm lượng AMG
Hàm lượng AMG trong sản phẩm cuối cùng được xác định bằng phương pháp đo quang phổ tại bước sóng 243 nm và trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Để đảm bảo độ chính xác, AMG (Sigma-Aldrich) được sử dụng làm chất chuẩn, sau đó được hòa tan trong methanol ở nồng độ phù hợp.
Để tạo dung dịch chuẩn gốc, 1 mg/ml được sử dụng Từ đó, dung dịch chuẩn gốc này được pha loãng trong methanol để tạo ra dãy chuẩn làm việc Quá trình chuẩn bị mẫu hạt NMG cũng được thực hiện tương tự Sau khi trộn đều, các dung dịch được lọc qua màng lọc có kích thước 0.45μm Hàm lượng AMG được đo bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC với các điều kiện sắc ký cụ thể, bao gồm cột Kromosilk-C18 RP (4.6 x 250 mm, 5μm) và tốc độ dòng chảy pha động là methanol (cột A) và nước (cột B).
= 95:5; Tốc độ dòng chảy: 1ml/min, detector (DAD): 319 nm; nhiệt độ cột:
2.5 Hoạt tính gây độc lên dòng tế bào ung thư phổi A549
Hoạt tính ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư đã được đánh giá bằng phương pháp MTT Cụ thể, tế bào ung thư A 549 với mật độ 10^5 tế bào/ml đã được xử lý trong 24 giờ với chất nghiên cứu ở các nồng độ khác nhau (0; 2,5; 5,0; 10; 20,0 μg/ml) được hòa tan trong DMSO hoặc nước Sau đó, dung dịch MTT 0,1 μg/ml được thêm vào mỗi giếng và tế bào được ủ ở 37°C trong 4 giờ để đánh giá hoạt tính ức chế 50% phát triển của tế bào ung thư.
Luận văn Khoa học Nghiên cứu
Hoạt tính gây độc lên dòng tế bào ung thư phổi A549
triển (IC50) sau đó được xác định bằng phương pháp đo quang phổ tại bước sóng
Đánh giá sự thâm nhập của hạt NMG vào tế bào
Dựa trên khả năng phát huỳnh quang của AMG, được kích thích ở bước sóng 445 nm và phát quang ở bước sóng 480 nm, tính chất này đã được khai thác để đánh giá khả năng thâm nhập của hạt NMG vào tế bào ung thư.
Tế bào A549 được xử lý với AMG ở dạng tự do và hạt NMG ở nồng độ thích hợp, sau đó được ủ trong 6 giờ Tiếp theo, các mẫu thí nghiệm sẽ được rửa sạch bằng dung dịch PBS và cố định trong paraformaldehyde 4% trong 30 phút Cuối cùng, tế bào sẽ được quan sát trực tiếp dưới kính hiển vi đồng tụ quét laser Olympus IX71 ở độ phóng đại 96X để đánh giá kết quả.
Xử lý thống kê
triển (IC50) sau đó được xác định bằng phương pháp đo quang phổ tại bước sóng
2.6 Đánh giá sự thâm nhập của hạt NMG vào tế bào
Chúng tôi đã khai thác khả năng phát huỳnh quang của AMG, được kích thích ở bước sóng 445 nm và phát quang ở bước sóng 480 nm, để đánh giá khả năng thâm nhập của hạt NMG vào tế bào ung thư Khả năng phát huỳnh quang này cho phép chúng tôi theo dõi quá trình thâm nhập của hạt NMG vào tế bào ung thư một cách chính xác.
Tế bào A549 được xử lý với AMG ở dạng tự do và hạt NMG ở nồng độ thích hợp Sau 6 giờ xử lý, mẫu thí nghiệm sẽ được rửa sạch với dung dịch PBS và cố định với paraformaldehyde 4% trong 30 phút Tiếp đó, tế bào sẽ được quan sát trực tiếp dưới kính hiển vi đồng tụ quét laser ở độ phóng đại 96X để đánh giá hiệu ứng của AMG và hạt NMG lên tế bào.
2.7 Đánh giá ảnh hưởng của NMG đến kích thước nhân tế bào
Các tế bào ung thư phổi A549 sau khi được xử lý với NMG và AMG tự do ở nồng độ IC50 sẽ được ủ với Hoechst 33342 ở nồng độ 1,6 μM Sau thời gian ủ 30 phút, các tế bào sẽ được rửa sạch bằng dung dịch PBS và quan sát dưới kính hiển vi đồng tụ quét laser để đánh giá sự thay đổi trong cấu trúc tế bào.
Các số liệu được xử lý bằng phương pháp thống kê sử dụng tiêu chuẩn t- test hoặc ANOVA trong trường hợp so sánh nhiều mẫu với giá trị p < 0,05.