Đang tải... (xem toàn văn)
Báo cáo thực hành KĨ THUẬT DI TRUYỀN BÀI 1 TẠO TẾ BÀO KHẢ NẠP VÀ TÁCH CHIẾT DNA PLASMID TỪ TẾ BÀO VI KHUẨN I Nguyên tắc Các tế bào sẽ tiếp nhận các đoạn DNA một cách ngẫu nhiên Không phải tất cả các l.
Báo cáo thực hành KĨ THUẬT DI TRUYỀN BÀI TẠO TẾ BÀO KHẢ NẠP VÀ TÁCH CHIẾT DNA PLASMID TỪ TẾ BÀO VI KHUẨN I Nguyên tắc - Các tế bào tiếp nhận đoạn DNA cách ngẫu nhiên Khơng phải tất lồi vi khuẩn có khả tiếp nhận DNA Ngay lồi có khả tiếp nhận DNA pha sinh trưởng định môi trường nuôi cấy cụ thể Các loài Streptococcus pneumoniae Bacillus subtilis tương đối dễ khả biến hơn, E coli phải hai loại enzyme exonuclease phải nuôi cấy môi trường có nồng độ cao calcium chlodride để làm cho màng tế bào thấm DNA Như vậy, trình xử lý đặc biệt thực nhằm gia tăng hiệu chuyển gene vi khuẩn làm chúng nhạy cảm tác động cá chất hóa học hay dịng điện kỹ thuật chuyển gene Những tế bào vi khuẩn gọi tế bào khả nạp (competent cells) - Quá trình chuyển gen đưa plasmid vào tế bào vi khuẩn bước quan trọng quy trình tạo dịng giúp chọn lọc nhân plasmid Với dòng vi khuẩn sàng lọc, tuyển chọn, việc nuôi cấy tách chiết plasmid cho phép thu nhận lượng lớn plasmid để dùng cho bước quy trình tạo dịng Thơng thường, sinh khối vi khuẩn ly giải kiềm giúp giải phóng plasmid khỏi tế bào Một bước xử lý acid hóa nhanh dung dịch kali acetate đậm đặc cho phép kết tủa protein DNA nhiễm sắc thể DNA plasmid trạng thái siêu cuộn xoắn, dung dịch giữ lại cột silica spin DNA plasmid rửa dung dịch ethanol sau rửa giải nước đệm TE Hình Quy trình tách chiết DNA plasmid từ sinh khối vi khuẩn dùng cột silica spin II Vật liệu: - Vi khuẩn E coli DH5-alpha - Vi khuẩn BL21 - Môi trường LB lỏng - Dung dịch CaCl2 100mM vô trùng - Glycerol 100% vô trùng - Bộ kit tách DNA plasmid - Gel agarose 1.5% / III Quy trình thí nghiệm Chuẩn bị tế bào khả nạp E coli DH5-alpha BL21 Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm chứa môi trường LB khơng có kháng sinh Ni cấy lắc với tốc độ 150 rmp 370C thời gian 16-20h Hút 1ml dịch vi khuẩn sang eppendorf Ly tâm tốc độ 8000rpm phút Lặp lại bước để thu nhận toàn sinh khối từ dịch vi khuẩn Loại bỏ dịch để thu sinh khối vi khuẩn Bổ sung 1ml dung dịch CaCl2 lạnh Vortex để huyền phù sinh khối, ủ eppendorf đá 30 phút Ly tâm dịch vi khuẩn 8000 rpm phút Loại bỏ dịch để thu sinh khối vi khuẩn Bổ sung 500µl hỗn hợp dung dịch CaCl2 glycerol lạnh, vortex để huyền phù sinh khối Hút chuyển 100µl dung dịch vi khuẩn vào eppendporf lạnh vô trùng Bảo quản ống vi khuẩn nhiệt độ -80oC Quy trình thu nhận sinh khối vi khuẩn tách chiết DNA plasmid từ sinh khối vi khuẩn kit 10 mL dung dịch vi khuẩn chứa plasmid mục tiêu (pha lag) Hút mL dịch nuôi cấy Ly tâm 11000 rpm phút Loại bỏ dịch Thu cặn tế bào Cho 250 mL PL1 buffer + 10 µl RNase A vào tube chứa 1.5 mL cặn tế bào Vortex Thêm 250 µl PL2 buffer Đảo tube 6-8 lần Ủ nhiệt độ phòng khoảng phút Thêm 350 µl PL3 buffer Đảo tube 6-8 lần Ly tâm 11000 rpm phút Chuyển tối đa 600 µl sang cột silica Ly tâm 11000 rpm phút Loại bỏ chất lỏng bên Giữ lại cột Ly tâm 11000 rpm phút Loại bỏ chất lỏng bên Giữ lại cột Đặt cột vào tube cũ Thêm 500 µl WB1 buffer Ly tâm 11000 rpm phút Loại bỏ chất lỏng bên Giữ lại cột Đặt cột vào tube cũ Thêm 500 µl WB2 buffer Ly tâm 11000 rpm phút Loại bỏ chất lỏng bên Giữ lại cột Ly tâm 11000 rpm 30 giây Chuyển cột sang tube Thêm 50 µl EB buffer Ủ nhiệt độ phòng khoảng phút Ly tâm 11000 rpm phút Thu dịch chứa DNA Đo OD Bảo quản DNA plasmid -20ºC IV Kết thí nghiệm: Hình Kết phân tích plasmid phương pháp đo mật độ quang V Thảo luận kết quả: - Sau tiến hành tách chiết DNA plasmid, để xác định nồng độ DNA dung dịch, nhóm thực phân tích plasmid phương pháp đo mật độ quang máy quang phổ nanodrop Kết thu DNA plasmid với nồng độ thấp 46 55 µg/mL - Nồng độ DNA plasmid thấp lượng DNA buffer thí nghiệm chưa thật xác (do đầu típ khơng khớp với micropipette)… BÀI CẮT DNA BẰNG ENZYME CẮT GIỚI HẠN (RESTRICTION ENZYME) I Nguyên tắc Enzyme cắt giới hạn (restriction enzyme-RE) enzyme cắt DNA vị trí nhận biết đặc hiệu để tạo đầu (blunt end) đầu dính (sticky end) Trong phương pháp tạo dòng truyền thống, RE sử dụng để cắt DNA tạo đầu tương hợp giúp kết hợp chúng với tạo DNA tái tổ hợp Nguồn DNA sử dụng tạo dòng đa dạng, DNA tách chiết từ tế bào vi khuẩn từ quần thể vi sinh vật, dòng DNA cần chuyển từ vector sang vector khác (subcloning) RE sử dụng để tạo đầu tương hợp cho sản phẩm PCR Trong tất trường hợp, hay nhiều RE sử dụng để cắt DNA giúp chèn có định hướng khơng định hướng vào plasmid tương thích DNA gene (genome), từ nguồn nào, thường cắt với RE vị trí nhận biết đặc trưng gồm 6-8 base liên tiếp, dạng vị trí nhận biết với tần suất genome so với vị trí nhận biết base, dẫn đến tạo phân đoạn DNA có kích thước lớn Kích thước đoạn chèn mong muốn thư viện dòng nhân định loại enzyme điều kiện phản ứng cắt Thông thường, chuỗi độ pha loãng enzyme lựa chọn thường sử dụng để phân cắt nguồn vật liệu khởi đầu, sau kích thước đoạn chèn đoạn chèn mong muốn phân tách điện di gel agarose Phương pháp chuẩn bị tạo phần đoạn DNA có kích thước mong muốn với đầu tương thích với vector lựa chọn Thơng thường, quy trình subcloning yêu cầu sử dụng 1-2 RE cắt bên ngồi đoạn chèn mà khơng cắt đoạn chèn Các RE, có vị trí nhận biết vùng đa điểm tạo dòng (multi cloning sites-MCS), thường chọn sử dụng chúng khơng cắt vị trí khác DNA vector thường tạo hai phân đoạn dễ tách biệt Gene mục tiêu tạo dòng vào vector với mục tiêu nâng cao hiệu biểu thành protein giúp sàng lọc gene Trong trường hợp này, gene mục tiêu cần phải gắn chèn vào hướng năm khung đọc với promoter phiên mã Phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ enzyme polymerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) thường sử dụng để khuếch đại gene hay phân đoạn DNA gene mục tiêu, từ nguồn DNA nào, để tạo dịng Để tạo đầu tương thích, thường trình tự nhận biết RE thêm vào đầu 5' hai mồi PCR Hơn nữa, để tạo hiệu gắn kết cắt RE, số gốc base thêm vào phía trước phía sau điểm nhận biết đầu 5' Khi chọn vị trí cắt giới hạn để thêm vào trình tự mồi, điều quan trọng xác định vị trí cắt phải tương hợp với vector, chiều đoạn chèn vị tri cắt không xảy gene phân đoạn DNA II Vật liệu phương pháp Vật liệu - Plasmid pET11a: 10µl - EcoRI: 10µl - BamHI: 10µl - Buffer 10X: 10µl - Gel agarose 1.5%: - DNA marker 1kb: 5µl Phương pháp - Thực phản ứng cắt plasmid DNA với enzyme BamHI - Thực phản ứng cắt plasmid DNA với enzyme EcoRI BamHI III Quy trình thí nghiệm Thực phản ứng cắt plasmid DNA với enzyme BamHI 15µl DNA 2µl Buffer 1µl Enzyme BamHI Chuẩnbị bị eppendorf eppendorf Chuẩn Trộn Trộn nhẹ micropipette micropipette Ủ 370C 60 phút 10 Thực phản ứng cắt plasmid DNA với enzyme EcoRI BamHI 16µl DNA 2µl Buffer 1µl Enzyme BamHI 1µl Enzyme EcoRI v va Chuẩn bị eppendorf Trộn nhẹ micropipette Ủ 370C 60 phút Điện di kiểm tra kết cắt DNA enzyme cắt giới hạn Nạp thang chuần Chuẩn bị gel agarose 1.5% Nạp mẫu phản ứng cắt 14,5µl mẫu khơng cắt 3µl loading dye 20µl mẫu cắt enzyme 4µl loading dye 20µl mẫu cắt enzyme 4µl loading dye Điện di 100 voltage 60 phút Quan sát so sánh 11 IV Kết thí nghiệm: Sau điện di gel agarose 1.5% 100 voltage 60 phút , ta thu kết hình bên Hình Kết phân tích plasmid phương pháp điện di gel agarose (L: Ladder 1kb; 1-2: DNA plasmid không cắt; 3-4: DNA plasmid cắt BamHI; 5-6: DNA plasmid cắt enzyme EcoRI + BamHI EcoRI + PstI; 7-8: DNA plasmid không cắt nhóm sáng) V Thảo luận kết - Sau có kết điện di, nhận thấy vạch điện di xuất không rõ ràng, không phân đoạn tách biệt Ở DNA marker dùng làm mẫu nên xuất rõ ràng sản phẩm cắt plasmid mẫu thí nghiệm, điều khó xác định phân cắt hai phản ứng cắt enzyme cắt giới hạn Vì khơng so sánh khả cắt plasmid RE so với plasmid chưa cắt - Sau điện di, vạch điện di xuất không rõ ràng tỉ lệ đổ gel agarose không phù hợp ảnh hưởng đến di chuyển đoạn DNA môi trường diện di, hay dung dịch điện di khơng đạt chuẩn ảnh hưởng đến kết VI Trả lời câu hỏi Vì phản ứng cắt plasmid DNA với enzyme giới hạn lại sử dụng enzyme BamHI mà khơng sử dụng enzyme EcoRI? Trả lời: Bởi vị trí nhận biết để phân cắt enzyme BamHI có vị trí 319bp nằm gần nhiều so với vị trí nhận biết enzyme EcoRI (5675bp) hiệu cắt enzyme BamHI plasmid dễ dàng 12 BÀI CHUYỂN GENE VÀO TẾ BÀO VI KHUẨN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SHOCK NHIỆT VÀ TÁCH CHIẾT LẠI DNA PLASMID I Nguyên tắc: Chuyển gen trình đưa DNA ngoại lai vào tế bào sinh vật Quá trình chuyển plasmid vào tế bào vi khuẩn (quá trình biến nạp) khơng quan trọng nghiên cứu mà nhân lưu trữ plasmid Bởi điều này, tất plasmid, chí plasmid thiết kế cho ứng dụng thực vật động vật, mang vùng khởi đầu chép (ori) vùng gene kháng kháng sinh dùng marker để chọn lọc dòng vi khuẩn Có nhiều biến đổi di truyền thực để tạo chủng vi khuẩn chuyển gene vào dễ dàng giúp trì plasmid mà khơng làm thay đổi plasmid Hình Plasmid pET11a II Vật liệu: Plasmid pET11a: 2µl Vi khuẩn khả nạp E coli DH5-alpha BL21: 100µl Mơi trường LB agar: 50ml Đĩa petri chứa môi trường LB ager bổ sung kháng sinh (ampicilin) 13 III Quy trình thí nghiệm Quy trình chuyển gene vào tế bào vi khuẩn khả nạp phương pháp shock nhiệt Giải đông ống vi khuẩn khả nạp vào hộp đá 5-10 phút Hút bổ sung 5µl plasmid vào vi khuẩn khả nạp giải đông Trộn nhẹ hỗn hợp micropipette Đặt ống eppendorf chứa hỗn hợp biến nạp chậu nước đá phút Chuyển eppendorf vào bể ổn nhiệt 42oC 42 giây Đặt eppendorf lại vào chậu nước đá phút Bổ sung 1ml môi trường LB Ủ máy lắc 37oC 45 phút Cấy trải toàn dung dịch vi khuẩn vào đĩa petri chứa mơi trường LB agar có bổ sung kháng sinh 14 Nuôi ủ đĩa petri 37oC qua đêm Chọn 10 khuẩn lạc mọc rời đĩa petri Thu chủng vi khuẩn kháng kháng sinh IV Kết thí nghiệm Hình Kết sàng lọc thể biến nạp dựa khả kháng kháng sinh 1-Vi khuẩn BL21 chuyển gen; 2- Vi khuẩn DH5-alpha không chuyển gen (đối chứng) 15 Hình Kết phân tích plasmid phương pháp đo mật độ quang (lần 2) - Thực cắt DNA enzyme cắt giới hạn với nồng độ DNA plasmid cao (68 µg/ml) L Uncut Cut1 Cut2 Hình Kết phân tích plasmid phương pháp điện di gel agarose (lần 2) (L: Ladder 1kb; Uncut: DNA plasmid không cắt với nồng độ 68 µg/ml; Cut1: DNA plasmid cắt BamHI; Cut2: DNA plasmid cắt enzyme EcoRI + BamHI) - Thảo luận kết quả: + Sau thực cắt DNA enzyme cắt giới hạn với nồng độ DNA plasmid cao hơn (68 µg/ml), nhiên kết đạt không mong muốn, gel không xuất band band thang chuẩn + Nguyên nhân nồng độ DNA plasmid thấp nên cắt DNA không thu kết 16 V Thảo luận kết Kết sàng lọc thể biến nạp dựa khả kháng kháng sinh Xét khả sinh trưởng vi sinh vật, chủng DH5-alpha sinh trưởng phát triển mạnh nhiều so với chủng BL21, với lượng 100 µl ampicilin 50mM, ta thấy: - Đĩa cấy vi khuẩn BL21 chuyển gen kháng kháng sinh không xuất khuẩn lạc (không phát triển) - Mặc khác, chủng DH5-alpha phát triển mạnh mẽ đĩa môi trường LB bổ sung kháng sinh ampicilin Do vậy, đánh giá kết sàng lọc thể biến nạp Kết phân tích DNA plasmid + Sau thực cắt DNA enzyme cắt giới hạn với nồng độ DNA plasmid cao hơn (68 µg/ml), nhiên kết đạt không mong muốn, gel khơng xuất band ngồi band thang chuẩn + Nguyên nhân nồng độ DNA plasmid thấp nên cắt DNA không thu kết 17 BÀI PHƯƠNG PHÁP PCR KHUẨN LẠC XÁC ĐỊNH DÒNG TẾ BÀO VI KHUẨN MANG GENE MỤC TIÊU I Nguyên tắc: Phương pháp PCR khuẩn lạc (colony PCR) phương pháp thuận lợi hiệu việc sàng lọc số lượng lớn dòng vi khuẩn để xác định diện hay vắng mặt plasmid mang gene mục tiêu q trình tạo dịng Các dong vi khuẩn chuyển gene ly giải nước dung dịch đệm bước xử lý nhiệt trước bổ sung vào hỗn hợp phản ứng PCR bổ sung trực tiếp vào phản ứng ly giải giai đoạn khởi đầu chu kỳ nhiệt Bước xử lý nhiệt giai đoạn khởi đầu cho phêp giải phóng plasmid DNA từ tế bào vi khuẩn làm nguyên liệu (mạch khuôn) cho phản ứng PCR Trong phản ứng PCR, với cặp mồi đặc hiệu cho gene mục tiêu cho phép xác định diện gene mục tiêu cấu trúc plasmid Ngoài ra, với mồi chuyên biệt thiết kế cho vùng gene khung vector, bên cạnh gene mục tiêu, cho phép xác định chiều kích thước gene mục tiêu Trong tất trường hợp, sản phẩm phản ứng PCR xác định điện di gel agarose Hình Quy trình PCR khuẩn lạc 18 II Vật liệu phương pháp: Vật liệu: - Các chủng vi khuẩn sàng lọc - Mồi xuôi 20M: 12l - Mồi ngược 20M: 12l - MyTaq mix 2X: 150l Phương pháp: - Phản ứng PCR - Phân tích kết điện di gel agarose III QUY TRÌNH THÍ NGHIỆM: Chuẩn bị phản ứng colony PCR: (*) Hút thành phẩn phản ứng theo bảng sau: Các thànhChuẩn phầnbị eppendorf Thể tích H2O 10.5 l MyTaq mix 2X l Hút thành phần phản ứng PCR vào 12.5 eppendorf (*) Mồi xuôi 20M l Mồi ngược 20M l Hoà tan khuẩn lạc vào dung dịch phản ứng đầu típ vơ trùng Vortex spindown nhanh ống phản ứng Quy trình nhiệt phản ứng colony PCR: cài đặt theo bảng sau: Các nhiệt bước 950C 950C 620C 720C 720C 40C Thời gian Số lần lặp lại 10 phút 30 giây 30 giây 30 giây 10 phút lần 30 lần lần 19 Điện di kiểm tra kết phản ứng colony PCR: Chuẩn bị gel agarose 1,5% IV Trộn 25l sản phẩm PCR vào 6,25l gel loading buffer (GLB) Nạp mẫu vào gel Điện di sản phẩm cắt 100 voltage 30 phút Quan sát xác định band sản phẩm PCR So sánh với marker để xác định kích thước Kết thí nghiệm Sau tiến hành thí nghiệm ta có kết sau: Hình Kết phân tích sản phẩm PCR phương pháp điện di gel agarose (L: Ladder 100bp – 1013bp, 1-10: Sản phẩm PCR khuẩn lạc vi khuẩn chứa gen mục tiêu, 1112: Đối chứng âm - dương) 20 V Thảo luận *Sau điện di sử dụng thuốc nhuộm gel safeview: - Trong thời gian chờ gel đông safeview bị màu - Qua nhiều lần sử dụng safeview khơng hiển thị band sản phẩm PCR Nên thuốc nhuộm safeview bị hỏng hết hạn sử dụng Và thao tác chưa nên ảnh hưởng đến kết *Nhóm thực hành định chọn thuốc nhuộm Ethidium bromide (EtBr) để thay cho safeview: - Cách thực hiện: Điện di gel agarose 1.5% Dùng sản phẩm điện di ngâm vào EtBr 15 phút Quan sát xác định band sản phẩm PCR hộp đèn soi UV So sánh với marker để xác định kích thước - Sau thay đổi thuốc nhuộm thấy band sản phẩm PCR Có thể thao tác thực cịn nhiều sai sót, hố chất khơng đảm bảo chất lượng, mồi dài (không đặc hiệu) nên kết xác định band sản phẩm PCR xác định kết qủa xác Bổ sung kết thực lần Do PCR khuẩn lạc không đạt kết mong muốn, tiếp tục tiến hành thực lại thí nghiệm lần với số thay đổi: + Giữ nguyên thể tích thành phần: MyTaq mix nước, thay đổi thể tích mồi xi mồi ngược: Các thành phần H2O MyTaq mix 2X Mồi xuôi 20M Mồi ngược 20M Thể tích 10.5 l 12.5 l 0.25 l 0.25 l + Giữ nguyên quy trình nhiệt, thay đổi nhiệt độ bắt cặp: Các bước Thời gian Số lần lặp lại 21 nhiệt 950C 950C 520C 720C 720C 40C 10 phút 30 giây 30 giây 30 giây 10 phút lần 30 lần lần Kết điện di PCR khuẩn lạc lần Hình 10 Kết phân tích sản phẩm PCR phương pháp điện di gel agarose (L: Ladder có kích thước từ 100 bp – 1013bp; 1-10: Sản phẩm PCR khuẩn lạc vi khuẩn chứa gen mục tiêu; 11-12 : Đối chứng dương : Sinh khối sau ly tâm dịch vi khuẩn cấy môi trường LB lỏng chứa Amp) Thảo luận kết - Sau thay đổi số điều kiện phản ứng PCR colony, nhìn vào gel sau điện di ta thấy giếng số số 10 xuất band, điều chứng tỏ gen mục tiêu chèn thành công vào plasmid khuẩn lạc Ước tính kích thước plasmid chứa đoạn gen giếng số 10 khoảng 1000bp - Ở giếng lại (ngoại trừ ladder) không xuất band nào, kết luận plasmid không chèn thành công gen mục tiêu khuẩn lạc 22 ... PHÁP PCR KHUẨN LẠC XÁC ĐỊNH DÒNG TẾ BÀO VI KHUẨN MANG GENE MỤC TIÊU I Nguyên tắc: Phương pháp PCR khuẩn lạc (colony PCR) phương pháp thuận lợi hiệu vi? ??c sàng lọc số lượng lớn dòng vi khuẩn để xác. .. CHUYỂN GENE VÀO TẾ BÀO VI KHUẨN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SHOCK NHIỆT VÀ TÁCH CHIẾT LẠI DNA PLASMID I Nguyên tắc: Chuyển gen trình đưa DNA ngoại lai vào tế bào sinh vật Quá trình chuyển plasmid vào tế bào vi. .. màng tế bào thấm DNA Như vậy, trình xử lý đặc biệt thực nhằm gia tăng hiệu chuyển gene vi khuẩn làm chúng nhạy cảm tác động cá chất hóa học hay dòng điện kỹ thuật chuyển gene Những tế bào vi khuẩn