BÀI 1 CHUYỂN GENE VÀO TẾ BÀO VI KHUẨN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SHOCK NHIỆT BÀI 2 PHƯƠNG PHÁP PCR KHUẨN LẠC XÁC ĐỊNH DÒNG TẾ BÀO VI KHUẨN MANG GENE MỤC TIÊU BÀI 3:PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT DNA PLASMID TỪ TẾ BÀO VI KHUẨN BÀI 4 CẮT DNA BẰNG ENZYME CẮT GIỚI HẠN (RESTRICTION ENZYME)
MỤC LỤC BÀI CHUYỂN GENE VÀO TẾ BÀO VI KHUẨN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SHOCK NHIỆT I Nguyên tắc: Chuyển gen trình đưa DNA ngoại lai vào tế bào sinh vật Quá trình chuyển plasmid vào tế bào vi khuẩn (q trình biến nạp) khơng quan trọng nghiên cứu mà nhân lưu trữ plasmid Bởi điều này, tất plasmid, chí plasmid thiết kế cho ứng dụng thực vật động vật, mang vùng khởi đầu chép (ori) vùng gene kháng kháng sinh dùng marker để chọn lọc dịng vi khuẩn Có nhiều biến đổi di truyền thực để tạo chủng vi khuẩn chuyển gene vào dễ dàng giúp trì plasmid mà khơng làm thay đổi plasmid Các tế bào tiếp nhận đoạn DNA cách ngẫu nhiên Khơng phải tất lồi vi khuẩn có khả tiếp nhận DNA Ngay lồi có khả tiếp nhận DNA pha sinh trưởng định mơi trường ni cấy cụ thể Các lồi Streptococcus pneumoniae Bacillus subtilis tương đối dễ khả biến hơn, E coli phải hai loại enzyme exonuclease phải nuôi cấy môi trường có nồng độ cao calcium chlodride để làm cho màng tế bào thấm DNA Như vậy, trình xử lý đặc biệt thực nhằm gia tăng hiệu chuyển gene vi khuẩn làm chúng nhạy cảm tác động cá chất hóa học hay dịng điện kỹ thuật chuyển gene Những tế bào vi khuẩn gọi tế bào khả nạp (competent cells) Qua q trình biến nạp, dịng vi khuẩn bị biến đổi di truyền tiếp nhận DNA ngoại lai Để chọn lọc dòng vi khuẩn chuyển gene, môi trường nuôi cấy chứa chất kháng sinh tương ứng với gene kháng kháng sinh vector dung trình chuyển gene thường sử dụng Các khuẩn lạc hình thành mơi trường có kháng sinh có xác suất cao chứa vector Ngoài ra, chọn lọc xanh trắng (blue-white screening) dựa vào vùng gene lacZ mã hóa enzyme beta-galactosidase số vector sử dụng giúp chọn lọc dòng vi khuẩn mang vector chứa insert Hình 1: Plasmid pET11a II Vật liệu: Plasmid pET11a: 2µl Vi khuẩn khả nạp E coli DH5-alpha: 100µl Mơi trường LB agar: 50ml Kháng sinh ampicillin 50mM:100µl Dung dịch CaCl2 100mM vô trùng: 5ml Glycerol 100% vô trùng: 5ml III Quy trình thí nghiệm: Chuẩn bị tế bào khả nạp E coli DH5-alpha BL21: Hút 1ml dịch vi khuẩn sang eppendorf Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm chứa mơi trường LB khơng có kháng sinh Nuôi cấy lắc với tốc độ 150 rmp 370C thời gian 16-20h Ly tâm tốc độ 8000rpm phút Loại bỏ dịch để thu sinh khối vi khuẩn Lặp lại bước để thu nhận toàn sinh khối từ dịch vi khuẩn Vortex để huyền phù sinh khối, ủ eppendorf đá 30 phút Bổ sung 1ml dung dịch CaCl2 lạnh vào eppendorf chứa sinh khối vi khuẩn Ly tâm dịch vi khuẩn 8000 rpm phút Bổ sung 500µl hỗn hợp dung dịch CaCl2 glycerol lạnh, vortex để huyền phù sinh khối Hút chuyển 100µl dung dịch vi khuẩn vào eppendporf lạnh vô trùng Bảo quản ống vi khuẩn nhiệt độ -80oC Loại bỏ dịch để thu sinh khối vi khuẩn Quy trình chuyển gene vào tế bào vi khuẩn khả nạp phương pháp shock nhiệt Giải đông ống vi khuẩn khả nạp vào hộp đá 5-10 phút Hút bổ sung 5µl plasmid vào vi khuẩn khả nạp giải đông Trộn nhẹ hỗn hợp micropipette Đặt ống eppendorf chứa hỗn hợp biến nạp chậu nước đá phút Chuyển eppendorf vào bể ổn nhiệt 42oC 42 giây Đặt eppendorf lại vào chậu nước đá phút Bổ sung 1ml môi trường LB Ủ máy lắc 37oC 45 phút Cấy trải toàn dung dịch vi khuẩn vào đĩa petri chứa mơi trường LB agar có bổ sung kháng sinh Ni ủ đĩa petri 37oC qua đêm Chọn 10 khuẩn lạc mọc rời đĩa petri Thu chủng vi khuẩn kháng kháng sinh IV Kết thí nghiệm Hình Vi khuẩn BL21 chuyển gen kháng kháng sinh (trái) – Vi khuẩn DH5alpha (phải) môi trường LB có chứa ampicilin (đối chứng) V Thảo luận Đĩa cấy vi khuẩn BL21 chuyển gen kháng kháng sinh không xuất khuẩn lạc (không phát triển) do: - Chủng vi khuẩn bảo quản lâu nên khơng cịn sống Vi khuẩn chuyển gen khơng thành cơng (sai sót thao tác) Đĩa đối chứng: cấy vi khuẩn DH5-alpha không chuyển gen xuất khuẩn lạc do: - Ampicilin bị hỏng Ampicilin đĩa không nên vi khuẩn sinh sống vùng khơng có ampicilin VI Trả lời câu hỏi: Giải thích chế sàng lọc xanh trắng? Trả lời: Sàng lọc xanh trắng phụ thuộc vào việc biến nạp chủng vi khuẩn biểu gene lacZ đột biến nên mã hóa peptide alpha beta-galactosidase, bù đắp vector mang gene Các tế bào biến nạp cấy môi trường tăng trưởng bao gồm số chất cảm ứng phiên mã cho biểu lacZ, IPTG chất tạo màu lacZ X-gal (5-bromo-4 chloro-3-indolyl-D-galctopyranoside) Trong sàng lọc xanh trắng, lacZ thủy phân X-gal, tạo chất màu xanh lam khuẩn lạc có màu xanh Khi đoạn DNA chèn vào làm phá vỡ gene lacZ vector, khơng có lacZ đầy đủ hình thành khuẩn lạc biến nạp có màu trắng BÀI PHƯƠNG PHÁP PCR KHUẨN LẠC XÁC ĐỊNH DÒNG TẾ BÀO VI KHUẨN MANG GENE MỤC TIÊU I Nguyên tắc: Phương pháp PCR khuẩn lạc (colony PCR) phương pháp thuận lợi hiệu việc sàng lọc số lượng lớn dòng vi khuẩn để xác định diện hay vắng mặt plasmid mang gene mục tiêu q trình tạo dịng Các dong vi khuẩn chuyển gene ly giải nước dung dịch đệm bước xử lý nhiệt trước bổ sung vào hỗn hợp phản ứng PCR bổ sung trực tiếp vào phản ứng ly giải giai đoạn khởi đầu chu kỳ nhiệt Bước xử lý nhiệt giai đoạn khởi đầu cho phêp giải phóng plasmid DNA từ tế bào vi khuẩn làm nguyên liệu (mạch khuôn) cho phản ứng PCR Trong phản ứng PCR, với cặp mồi đặc hiệu cho gene mục tiêu cho phép xác định diện gene mục tiêu cấu trúc plasmid Ngoài ra, với mồi chuyên biệt thiết kế cho vùng gene khung vector, bên cạnh gene mục tiêu, cho phép xác định chiều kích thước gene mục tiêu Trong tất trường hợp, sản phẩm phản ứng PCR xác định điện di gel agarose Hình Quy trình PCR khuẩn lạc II Vật liệu phương pháp: Vật liệu: - Các chủng vi khuẩn sàng lọc xanh trắng kháng kháng sinh đặc trưng - Mồi xi 20µM: 12µl Mồi ngược 20µM: 12µl - My Taq mix 2X: 150µl Phương pháp: - Phản ứng PCR - Phân tích kết điện di gel agarose III QUY TRÌNH THÍ NGHIỆM: Chuẩn bị phản ứng colony PCR: - (*) Hút thành phẩn phản ứng theo bảng sau: Chuẩn Các thành phầnbị eppendorf Thể tích H2O 10.5 µl My Taq mix 2X 12.5 µl Hút thành phần phản ứng PCR vào eppendorf (*) Mồi xi 20µM µl Mồi ngược 20µM µl Hoà tan khuẩn lạc vào dung dịch phản ứng đầu típ vơ trùng Vortex spindown nhanh ống phản ứng Quy trình nhiệt phản ứng colony PCR: cài đặt theo bảng sau: Các nhiệt bước 950C 950C 620C 720C 720C 40C Thời gian Số lần lặp lại 10 phút 30 giây 30 giây 30 giây 10 phút ∞ lần 30 lần lần Điện di kiểm tra kết phản ứng colony PCR: Chuẩn bị gel agarose 1,5% IV Trộn 25l sản phẩm PCR vào 6,25l gel loading buffer (GLB) Nạp mẫu vào gel Điện di sản phẩm cắt 100 voltage 30 phút Quan sát xác định band sản phẩm PCR So sánh với marker để xác định kích thước Kết thí nghiệm Sau tiến hành thí nghiệm ta có kết sau: Hình Kết điện di gel agarose (L: Ladder 100bp – 1013bp, 1-10: Sản phẩm PCR khuẩn lạc vi khuẩn chứa gen mục tiêu, 1112: Đối chứng âm - dương) V Thảo luận + Giữ nguyên quy trình nhiệt, thay đổi nhiệt độ bắt cặp: Các nhiệt bước 950C 950C 520C 720C 720C 40C Thời gian Số lần lặp lại 10 phút 30 giây 30 giây 30 giây 10 phút ∞ lần 30 lần lần Kết điện di PCR khuẩn lạc lần Hình Kết điện di gel agarose lần (L: Ladder có kích thước từ 100 bp – 1013bp; 1-10: Sản phẩm PCR khuẩn lạc vi khuẩn chứa gen mục tiêu; 11-12 : Đối chứng dương : Sinh khối sau ly tâm dịch vi khuẩn cấy môi trường LB lỏng chứa Amp) Thảo luận kết - Sau thay đổi số điều kiện phản ứng PCR colony, nhìn vào gel sau điện di ta thấy giếng số số 10 xuất band, điều chứng tỏ gen mục tiêu chèn thành cơng vào plasmid khuẩn lạc Ước tính kích thước plasmid chứa đoạn gen giếng số 10 khoảng 900bp - Ở giếng lại (ngoại trừ ladder) không xuất band nào, kết luận plasmid không chèn thành công gen mục tiêu khuẩn lạc BÀI PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT DNA PLASMID TỪ TẾ BÀO VI KHUẨN I Nguyên tắc Quá trình chuyển gen đưa plasmid vào tế bào vi khuẩn bước quan trọng quy trình tạo dịng giúp chọn lọc nhân plasmid Với dòng vi khuẩn sàng lọc, tuyển chọn, việc nuôi cấy tách chiết plasmid cho phép thu nhận lượng lớn plasmid để dùng cho bước quy trình tạo dịng Thơng thường, sinh khối vi khuẩn ly giải kiềm giúp giải phóng plasmid khỏi tế bào Một bước xử lý acid hóa nhanh dung dịch kali acetate đậm đặc cho phép kết tủa protein DNA nhiễm sắc thể DNA plasmid trạng thái siêu cuộn xoắn, dung dịch giữ lại cột silica spin DNA plasmid rửa dung dịch ethanol va sau rửa giải nước đệm TE 10 mL dung dịch vi khuẩn chứa plasmid mục tiêu (pha lag) Hút mL dịch ni cấy Hình Quy trình tách chiết DNA plasmid từ sinh khối vi khuẩn dùng cột silica spin II Vật liệu: Ly tâm 11000 rpm phút - Sinh khối vi khuẩn nuôi cấy pha lag - Bộ kit tách DNA plasmid - Gel agarose 1.5% / Thu cặn tế bào Loại bỏ dịch III Quy trình thí nghiệm: Cho 250 mL PL1 buffer + 10 µl RNase A vào tube chứa 1.5 mL cặn tế bào Vortex Quy trình thu nhận sinh khối vi khuẩn tách chiết DNA plasmid từ sinh khối vi khuẩn kit: Thêm 250 µl PL2 buffer Đảo tube 6-8 lần Ủ nhiệt độ phòng khoảng phút Thêm 350 µl PL3 buffer Đảo tube 6-8 lần Ly tâm 11000 rpm phút Chuyển tối đa 600 µl sang cột silica Ly tâm 11000 rpm phút Giữ lại cột Loại bỏ chất lỏng bên Ly tâm 11000 rpm phút Giữ lại cột Đặt cột vào tube cũ Thêm 500 µl WB1 buffer Ly tâm 11000 rpm phút Loại bỏ chất lỏng bên Giữ lại cột Loại bỏ chất lỏng bên Đặt cột vào tube cũ Ly tâm 11000 rpm Thêm 500 trongµl2WB2 phút buffer Giữ lại cột Loại bỏ chất lỏng bên Ly tâm 11000 rpm 30 giây Chuyển cột sang tube Thêm 50 µl EB buffer Ủ nhiệt độ phòng khoảng phút Ly tâm 11000 rpm phút Thu dịch chứa DNA Đo OD Bảo quản DNA plasmid -20ºC Điện di kiểm tra kết tách chiết DNA plasmid: Chuẩn bị gel agarose 1.5% Nạp khoảng 25 µl dung dịch DNA plasmid + GLB vào gel Điện di DNA plasmid 100V 30 phút IV Kết thí nghiệm: Quan sát, xác định chất lượng kích thước Kết đo OD: DNA plasmid Hình Kết nồng độ dung dịch DNA plasmid Kết điện di: Hình Kết điện di DNA plasmid (L: Ladder 100bp-1013bp, 1-2: Sản phầm tách chiết DNA plasmid) V Thảo luận Từ kết ta thấy: - Sau tiến hành tách chiết, thu DNA plasmid với nồng độ thấp 46 55 µg/mL Ngun nhân q trình thực thí nghiệm, lượng buffer khơng đủ so với dự tính, nhiệt độ ủ điều kiện phịng khơng phù hợp,… - Nhìn vào gel, ta thấy có xuất vệt band dài giếng thang chuẩn (marker/ladder), đồng thời giếng lại gel khơng xuất band khác Vì vậy, nói điện di DNA plasmid thất bại, nguyên nhân lớn dẫn đến kết có lẽ nồng độ DNA plasmid thu thấp thuốc thử safeview bị hỏng,… Bổ sung kết thực lần Do nồng độ DNA plasmid thấp nên nhóm thực hành tiến hành thực tách chiết DNA plasmid lần Kết quà đo OD: Hình Kết nồng độ dung dịch DNA plasmid lần Kết điện di: 1013bp L Uncut Cut1 Cut2 300bp Hình 10 Kết điện di DNA plasmid lần (L: Ladder 100bp- 1013bp, Uncut: Sản phầm tách chiết DNA plasmid với nồng độ 68 µg/ml) Thảo luận kết quả: - Sau thực với tách DNA plasmid lần 2, ta thu DNA plasmid với nồng độ cao 63 68 µg/ml mức độ thấp so với DNA plasmid thơng thường - Nhìn vào gel, ta thấy có xuất vệt band dài giếng thang chuẩn (marker/ladder) giống kết lần đầu, đồng thời giếng cịn lại gel khơng xuất band khác BÀI CẮT DNA BẰNG ENZYME CẮT GIỚI HẠN (RESTRICTION ENZYME) I Nguyên tắc Enzyme cắt giới hạn (restriction enzyme-RE) enzyme cắt DNA vị trí nhận biết đặc hiệu để tạo đầu (blunt end) đầu dính (sticky end) Trong phương pháp tạo dòng truyền thống, RE sử dụng để cắt DNA tạo đầu tương hợp giúp kết hợp chúng với tạo DNA tái tổ hợp Nguồn DNA sử dụng tạo dòng đa dạng, DNA tách chiết từ tế bào vi khuẩn từ quần thể vi sinh vật, dòng DNA cần chuyển từ vector sang vector khác (subcloning) RE sử dụng để tạo đầu tương hợp cho sản phẩm PCR Trong tất trường hợp, hay nhiều RE sử dụng để cắt DNA giúp chèn có định hướng khơng định hướng vào plasmid tương thích DNA gene (genome), từ nguồn nào, thường cắt với RE vị trí nhận biết đặc trưng gồm 6-8 base liên tiếp, dạng vị trí nhận biết với tần suất genome so với vị trí nhận biết base, dẫn đến tạo phân đoạn DNA có kích thước lớn Kích thước đoạn chèn mong muốn thư viện dòng nhân định loại enzyme điều kiện phản ứng cắt Thơng thường, chuỗi độ pha lỗng enzyme lựa chọn thường sử dụng để phân cắt nguồn vật liệu khởi đầu, sau kích thước đoạn chèn đoạn chèn mong muốn phân tách điện di gel agarose Phương pháp chuẩn bị tạo phần đoạn DNA có kích thước mong muốn với đầu tương thích với vector lựa chọn Thơng thường, quy trình subcloning u cầu sử dụng 1-2 RE cắt bên đoạn chèn mà khơng cắt đoạn chèn Các RE, có vị trí nhận biết vùng đa điểm tạo dòng (multi cloning sites-MCS), thường chọn sử dụng chúng khơng cắt vị trí khác DNA vector thường tạo hai phân đoạn dễ tách biệt Gene mục tiêu tạo dòng vào vector với mục tiêu nâng cao hiệu biểu thành protein giúp sàng lọc gene Trong trường hợp này, gene mục tiêu cần phải gắn chèn vào hướng năm khung đọc với promoter phiên mã Phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ enzyme polymerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) thường sử dụng để khuếch đại gene hay phân đoạn DNA gene mục tiêu, từ nguồn DNA nào, để tạo dòng Để tạo đầu tương thích, thường trình tự nhận biết RE thêm vào đầu 5' hai mồi PCR Hơn nữa, để tạo hiệu gắn kết cắt RE, số gốc base thêm vào phía trước phía sau điểm nhận biết đầu 5' Khi chọn vị trí cắt giới hạn để thêm vào trình tự mồi, điều quan trọng xác định vị trí cắt phải tương hợp với vector, chiều đoạn chèn vị tri cắt không xảy gene phân đoạn DNA II Vật liệu phương pháp Vật liệu - Plasmid pET11a: 10µl EcoRI: 10µl BamHI: 10µl Buffer 10X: 10µl Gel agarose 1.5%: DNA marker 100bp: 5µl Phương pháp - Thực phản ứng cắt plasmid DNA với enzyme BamHI Thực phản ứng cắt plasmid DNA với enzyme EcoRI BamHI III Quy trình thí nghiệm Thực phản ứng cắt plasmid DNA với enzyme BamHI Chuẩn bị eppendorf rộn nhẹ micropipette Trộn nhẹ micropipette Ủ 370C 60 phút 16µl DNA 2µl Điện di 100 voltage 60 phút Chuẩn b rộn nhẹ sát Quan vàmicropipette so sánh Ủ, 370C 60 phút Nạp thang chuần Nạp mẫu phản ứng cắt 14,5µl mẫu khơng cắt 3µl loadin 20µl mẫu cắt enzyme 4µ 20µl mẫu cắt enzyme 4µ Chuẩn bị gel agarose 1.5% Thực phản ứng cắt plasmid DNA với enzyme EcoRI BamHI Điện di kiểm tra kết cắt DNA enzyme cắt giới hạn IV Kết thí nghiệm: Sau điện di gel agarose 1.5% 100 voltage 60 phút , ta thu kết hình bên Hình 11 Kết điện di gel agarose (L: Ladder 100bp-1013bp; 1-2: DNA plasmid không cắt; 3-4: DNA plasmid cắt BamHI; 5-6: DNA plasmid cắt enzyme EcoRI + BamHI EcoRI + PstI; 7-8: DNA plasmid khơng cắt nhóm sáng) V Thảo luận - Sau có kết điện di, nhận thấy vạch điện di xuất không rõ ràng, không phân đoạn tách biệt Ở DNA marker dùng làm mẫu nên xuất rõ ràng cắt plasmid mẫu thí nghiệm, điều khó xác định phân cắt hai phản ứng cắt enzyme cắt giới hạn Vì khơng so sánh khả cắt plasmid RE so với plasmid chưa cắt - Sau điện di, vạch điện di xuất khơng rõ ràng tỉ lệ đổ gel agarose không phù hợp ảnh hưởng đến di chuyển đoạn DNA môi trường diện di, hay dung dịch điện di không đạt chuẩn ảnh hưởng đến kết VI Trả lời câu hỏi Vì phản ứng cắt plasmid DNA với enzyme giới hạn lại sử dụng enzyme BamHI mà không sử dụng enzyme EcoRI? Trả lời: Bởi vị trí nhận biết để phân cắt enzyme BamHI có vị trí 319bp nằm gần nhiều so với vị trí nhận biết enzyme EcoRI (5675bp) hiệu cắt enzyme BamHI plasmid dễ dàng Bổ sung kết thực lần Thực cắt DNA enzyme cắt giới hạn với nồng độ DNA plasmid cao (68 µg/ml) Kết điện di gel agarose 1013bp L Uncut Cut1 Cut2 300bp Hình 12 Kết điện di gel agarose (L: Ladder 100bp-1013bp; Uncut: DNA plasmid khơng cắt với nồng độ 68 µg/ml; Cut1: DNA plasmid cắt BamHI; Cut2: DNA plasmid cắt enzyme EcoRI + BamHI) Thảo luận kết quả: - Sau thực cắt DNA enzyme cắt giới hạn với nồng độ DNA plasmid cao hơn (68 µg/ml), nhiên kết đạt không mong muốn, gel không xuất band band thang chuẩn - Nguyên nhân nồng độ DNA plasmid thấp nên cắt DNA không thu kết ... nên ảnh hưởng đến kết *Nhóm thực hành định chọn thuốc nhuộm Ethidium bromide (EtBr) để thay cho safeview: - Cách thực hiện: Điện di gel agarose 1.5% Dùng sản phẩm điện di ngâm vào EtBr 15 phút Quan... plasmid chưa cắt - Sau điện di, vạch điện di xuất khơng rõ ràng tỉ lệ đổ gel agarose không phù hợp ảnh hưởng đến di chuyển đoạn DNA môi trường di? ??n di, hay dung dịch điện di không đạt chuẩn ảnh hưởng... kết mong muốn, tiếp tục tiến hành thực lại thí nghiệm lần với số thay đổi: + Giữ nguyên thể tích thành phần: My Taq mix nước, thay đổi thể tích mồi xi mồi ngược: Các thành phần H2O My Taq mix 2X