Khảo sát khả năng ức chế enzyme polyphenol oxidase từ thực vật

Đề tài Khảo sát khả năng ức chế enzyme Polyphenol oxidase từ thực vật MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 I Đặt vấn đề 2 II Tổng quan 2 1 Các enzyme 2 2 Rau răm (Persicaria odorata) 3 3 Rau đắng.

Đề tài: Khảo sát khả ức chế enzyme Polyphenol oxidase từ thực vật MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU TỔNG QUAN TÀI LIỆU I Đặt vấn đề II Tổng quan Các enzyme 2 Rau răm (Persicaria odorata) 3 Rau đắng (polygonum aviculare) .5 TRIỂN KHAI THÍ NGHIỆM I Điều chế cao mẫu thí nghiệm Điều chế cao cồn Điều chế cao nước .9 II Tách chiết enzyme polyphenol oxidase (từ củ khoai tây) .10 III Xây dựng đường chuẩn 10 Tiến hành kiểm hoạt tính cao mẫu 10 Tiến hành đo OD Tyrosin sau kiểm tra hoạt tính 11 IV Kết biện luận 12 Điều chế cao mẫu thí nghiệm 12 Xây dựng đường chuẩn 12 Kết đo OD Tyrosin sau kiểm tra hoạt tính 13 TÀI LIỆU THAM KHẢO 16 LỜI MỞ ĐẦU Một chế độ ăn uống hợp lý giúp cung cấp cho thể có đủ lượng hoạt động ngày sức đề kháng chống lại bệnh tật Một bữa ăn cân đối cần có đủ nhóm thức ăn: nhóm đường bột (các loại ngũ cốc), nhóm chất đạm (thịt, cá, trứng, sữa,…), nhóm chất béo (dầu thực vật động vật), nhóm vitamin khống chất (các loại trái cây, rau, củ, ) Trong đó, đặc biệt nhóm vitamin khống chất chất thiết yếu thể Tuy thể cần lượng nhỏ lại quan trọng để giúp thể phát triển khỏe mạnh Vitamin thường có loại trái cây, loại trái đa số người dân ăn thường ngày để bổ sung vitamin táo Nhưng ngày nay, người không quan tâm đến dinh dưỡng mà cịn có quan tâm đặc biệt thẩm mỹ thực phẩm Bạn nghĩ cuối bữa ăn gia đình có đĩa táo bị thâm đen? Tuy dinh dưỡng táo không bị ảnh hưởng mặt thẩm mỹ lại hồn tồn khơng có Hiện có nhiều cách để giúp táo không bị thâm đen như: ngâm táo vào nước chanh, nước muối, rượu gừng, bọc táo màng bọc thực phẩm,…Ngồi phương pháp nhóm em muốn tìm thêm phương pháp khác để giúp cải thiện vấn đề TỔNG QUAN TÀI LIỆU I Đặt vấn đề: Polyphenol oxydase (PPO) loại enzyme phổ biến thực phẩm sử dụng hàng ngày chúng ta, chúng xúc tác cho q trình oxi hóa phenol thành quinone, có màu nâu nhạt Việc biến đổi không làm ảnh hưởng đến giá trị dinh dưỡng thực phẩm lại làm giảm tính cảm quan, khiến người ăn khơng cịn thấy ngon Mặc dù có nhiều cách ngăn oxi hóa dùng nước muối, nước uống có ga, nước chanh,… Chưa thỏa mãn với phương pháp tại, nhiều người thắc mắc rằng: Có thể dùng thực vật để ức chế ngăn chặn trình oxi hóa này? Vì điều mà nhóm chúng tơi tiến hành thí nghiệm với mục tiêu: Khảo sát khả ức chế enzyme polyphenol oxydase từ thực vật Từ có thêm giải pháp để ngăn chặn oxi hóa phenol để thành quinone Thơng qua thí nghiệm vui đơn giản nhóm chúng tơi định sử dụng cao cồn cao nước chiết từ rau răm, rau đắng để thử khả ức chế oxi hóa có enzyme polyphenol oxydase làm chất xúc tác II Tổng quan: Các enzyme: - Enzyme Polyphenol Oxydase (PPO monophenol monooxygenase polyphenol oxydase 1-chloroplastic) tetramer có chứa nguyên tử Cu phân tử vị trí liên kết cho hợp chất thơm - Polyphenol Oxidase gồm monophenol oxydase diphenol oxydase (gồm: o-diphenol oxydase p-diphenol oxydase) Trong đó, monomphenol oxydase giúp thủy phân gốc monophenol tạo thành gốc o-diphenol oxydase - Tuy nhiên, polyphenol oxydase gặp không khí trở thành o-quinone, thân oquinone khơng có màu nâu, tiếp tục phản ứng với amino acid khơng khí mà tạo melanin – chất tạo từ loài thực vật có màu nâu 2 Rau răm (Persicaria odorata): Là loài thực vật ăn thuộc họ Polygonaceae – họ thân đốt/họ Rau răm, loài thân thảo, chúng sử dụng rộng rãi bữa ăn khu vực Đông Nam Á Đây loài lưu niên, sinh trưởng tốt vùng nhiệt đới cận nhiệt đới điều kiện nóng ẩm Mặt có màu xanh sẫm, có chút đốm màu nâu nhạt, mặt màu đỏ, thân có đốt Hình Rau râm  Trong tinh dầu rau răm người ta tìm thấy chuỗi aldehyd chuỗi dài như: - Decanal chiếm 28% tinh dầu rau răm Decanal hợp chất hữu cớ có cơng thức hóa học C10H20O Decanal xuất tự nhiên Chi Citrus (thực vật có hoa bụi thuộc họ Rue, Rutaceae), với octanal (hợp chất hữu – với tính chất vật lý chất lỏng, có mùi, khơng màu; thành phần nước hoa), citral (đây hợp chất hữu terpenoid với cơng thức hóa học C10H16O), sinensal (cơng thức hóa học C15H22O), hay kiều mạch,và tinh dầu rau mùi sử dụng nước hoa hương liệu Hình Cơng thức cấu tạo Decanal - Dodecanal chiếm 44% tinh dầu răm răm Dodencanal gọi lauraldehyde dodecyl aldehyde, hợp chất hữu có cơng thức hóa học CH3(CH2)10CHO Đây chất lỏng khơng màu, thành phần nhiều loại nước hoa Trong tự nhiên thương có loại dầu có múi Hình Cơng thức cấu tạo Dodecanal - Decanol chiếm 11% tinh dầu rau răm Đây chuỗi fatty alcohol, có cơng thức hóa học C10H21OH, tồn tự nhiên có màu vàng, chất lỏng nhớt, khơng hịa tan nước có mùi thơm Decanol điều chế cách hydro hóa Acid Decanoic (cịn gọi Capric Acid Decylic, acid béo bão hịa, có cơng thức hóa học CH3(CH2)8COOH), trinhg hydro hóa xảy số dầu dừa (khoảng 10%) dầu hạt nhân Palm (một loại dầu thực vật ăn có nguồn gốc từ hạt nhân cọ dầu Elaeis guineensis) (khoảng 4%) Nó sản xuất tổng hợp qua trình Ziegler (phương pháp để sản xuất rượu béo từ ethylene, sử dụng hợp chất organoaluminium) Hình Cơng thức cấu tạo Decanol - Ngồi tinh dầu rau răm cịn tìm thấy sesquiterpene gồm: α-humulene (còn gọi α-humulene α-Caryophyllene, monocyclic sesquiterpene tự nhiên, cơng thức hóa học C15H24, tìm thấy hầu hết tinh dầu), β-caryophyllene chiếm khoảng 15% tinh dầu Hình Cơng thức cấu tạo α-Caryophyllene Hình Cơng thức cấu tạo Beta – caryophyllene Rau đắng (polygonum aviculare): Hay có người cịn gọi tơm, xương cá rau đắng, danh pháp khoa học: Polygonum aviculare loài thực vật thuộc họ Rau răm Rau đắng loài thân thảo, lưu niên, ứng dụng nhiều y tế, Đông y sử dụng phương thuốc có cơng dụng lợi tiểu, sát trùng, viêm bàng quan, sỏi niệu đạo, bí đái, đái buốt, trĩ, kiết lỵ, lở ngứa da, vàng da tắc mật,…Trong Tây y, rau đắng cịn có tác dụng hạ huyết áp, tăng cường hô hấp, tăng thời gian đơng máu,… Hình Rau đắng  Thành phần hóa học rau đắng gồm: - Tanin chiếm 0,35% rau đắng, hợp chất polyphenol có thực vật Các hợp chất tanin có nhiều nhiều lồi thực vật, chúng có vai trị bảo vệ khỏi bị lồi ăn chúng, có lẽ có tác dụng thuốc trừ sâu, điều hòa sinh trưởng thực vật Chất chát từ tanin tạo cảm giác khô puckery miệng sau ăn trái chưa chín rượu vang đỏ Cũng thế, phân hủy tanin theo thời gian đóng vai trị quan trọng việc làm cho trái chín ủ rượu vang Trong số trường hợp bị nhiễm trùng rắn độc cắn bác sĩ thường dùng chất để làm giảm nhiễm trùng vết thương tanin tạo thành chất kết tủa với protit nọc rắn Tanin có tác dụng khử gốc tự do, ngăn ngừa bện tim, có khả chơng oxy hóa ngăn ngừa ung thư Hình Cơng thức cấu tạo Acid tanic - tanin - Vitamin C hay gọi acid ascorbic loài dinh dưỡng thiết cho loài linh trưởng bậc cao cho số nhỏ loài khác Sự diện ascorbic cần thiết loạt phản ứng trao đổi chất tất động vật cối được tạo thể tất thể sinh vật, loại trừ loài người, khỉ, cá heo thiếu enzyme đặc hiệu xúc tác chuyển hóa Glucose thành Vitamin C Đây chất người biết đến rộng rãi vitamin mà thiếu gây bệnh scorbut cho người Hình Cơng thức cấu tạo Acid Ascorbic - Flavonoid (hoặc bioflavonoid) loại chất chuyển hóa trung gian thực vật Tuy nhiên số flavonoid có màu xanh, tím đỏ có số khác lại khơng có màu Nhóm Flavonoid rau đắng gồm có: + Avicularin flavonol hoạt động sinh học, phân lập từ số loài thực vật polygonum aviculare, Rhododendron aureum Taxillus kaempferi Hình 10 Cơng thức cấu tạo Avicularin + Juglanin flavonoid tìm thấy polugunm aviculare Hình 11 Công thức cấu tạo Juglanin + Astragalin hợp chất hóa học phân lập từ phytolacca americana chiết xuất methanolic Fronds dương xỉ Phegopteris connectilis Nó cịn tìm thấy rượu vang Hình 12 Cơng thức cấu tạo Astragalin +Aviculin Lignan, cô lập từ Pseudocydonia sinensis Polygonum aviculare Hình 13 Cơng thức cấu tạo Aviculin TRIỂN KHAI THÍ NGHIỆM I Điều chế cao mẫu thí nghiệm: Điều chế cao cồn: Rửa mẫu, để nước Cân mẫu, giã nhuyễn thêm cồn 96 bảng Lọc lấy dịch trích, bảo quản 200C Mẫu vật Rau râm Rau đắng Khối lượng (g) 25 40 o Cồn 96 (ml) 25 40 Bảng Mẫu vật thí nghiệm điều chế cao cồn Điều chế cao nước: Rửa mẫu, để nước Cân mẫu, giã nhuyễn thêm nước cất bảng Lọc lấy dịch trích, bảo quản 200C Mẫu vật Khối lượng Rau râm 15 Rau đắng 50 (g) Nước cất 15 50 Bảng (ml) Mẫu vật thí nghiệm điều chế cao nước II Tách chiết enzyme polyphenol oxidase (từ củ khoai tây): Rửa mẫu, đem xay nhuyễn với nước cất Lấy 25 ml dịch mẫu xay thêm 25 ml cồn 960, đem ly tâm 6000 vòng/phút Xong thu lấy cặn thêm 10 ml nước cất, tiếp tục đem ly tâm 6000 vòng/ phút Xong thu lấy dịch III Xây dựng đường chuẩn: Tiến hành chuẩn bị ống nghiệm bảng Rồi tiến hành đo OD bước sóng 260 nm Vẽ đồ thị biểu diễn đường chuẩn Ống nghiệm Tyrosin mM 0 0.2 0.4 0.6 0.8 (ml) HCl 0.2 N (ml) NaOH 0.5 N 0.8 0.6 0.4 0.2 2 (ml) Bảng Số liệu tiến hành xây dựng đường chuẩn Tiến hành kiểm hoạt tính cao mẫu Tiến hành thực thí nghiệm bảng Ống nghiệm Blank Cao Cao Cao Cao cồn nước cồn nước rau rau rau rau râm râm đắng đắng Buffer (ml) (1) (2) (3) (4) Polyphenol 1 1 Tyrosin 1m 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 (ml) Inhibitor (ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 oxidase (ml) Ủ 20 phút Đun sôi ống nghiệm để dừng phản ứng Bảng Số liệu chuẩn bị thí nghiệm kiểm tra hoạt tính ức chế emzyme polyphenol oxidase Sau thêm vào ống blank 0.5 ml Inhibitor để cân ống nghiệm Tiến hành đo OD Tyrosin sau kiểm tra hoạt tính Tiến hành thực thí nghiệm bảng Sau đo OD ống nghiệm bước sóng 260 nm Ống nghiệm Dung dịch sau Blank Cao Cao Cao Cao cồn nước cồn nước rau rau rau rau râm râm đắng đắng (1) (2) (3) (4) 2 2 kiểm tra hoạt tính (ml) NaOH 0.5 N (ml) Bảng Số liệu thí nghiệm đo OD Tyrosin sau kiểm tra hoạt ức chế IV Kết biện luận: Điều chế cao mẫu thí nghiệm: Xây dựng đường chuẩn: - Sau đo có kết bảng Ống nghiệm OD260nm 0.184 0.327 0.428 0.863 1.042 Bảng Kết đo OD tyrosin 1nM bước sóng 260 nm Hình 16 nước rau raurâm đắng râm Hình 17 Cao cồn Hình15 14.Cao Caonước cồnrau - Xây dựng đường chuẩn theo bảng Hình 17 Đường chuẩn Tyrosin 1nM với OD 260nm Kết đo OD Tyrosin sau kiểm tra hoạt tính: Hình 18 kết đo Tyrosin sau kiểm tra hoạt tính - Sau đo có kết bảng 7: Ống nghiệm OD260nm Blank 2.294 Cao Cao Cao Cao cồn nước cồn nước rau rau rau rau râm râm đắng đắng (1) 1.904 (2) 1.330 (3) 2.113 (4) 1.655 Bảng Kết đo OD Tyrosin sau kiểm tra hoạt tính - Dựa vào phương trình đường tuyến tính đường chuẩn Tyrosin 1nM với OD 260 nm ta tính lượng tyrosin ống nghiệm sau kiểm tra hoạt tính.: Ống nghiệm Lượng Blank 3.360 Cao Cao Cao Cao cồn nước cồn nước rau rau rau rau râm râm đắng đắng (1) 2.789 (2) 1.948 (3) 3.095 (4) 2.424 Tyrosin (ml) Bảng Lượng Tyrosin sau kiểm tra hoạt tính - Lượng Tyrosin bị enzyme polyphenol osidase oxy hóa trở thành o-quinone Do lượng tysosin mẫu cịn nhiều cho thấy tyrosin bị oxy hóa Dựa vào kết thấy được: Mẫu blank khơng có chất ức chế lượng tyrosin ống nghiệm 3.360 ml cao lượng tyrosin có ống nghi ệm có chất ức chế Dựa kết khảo sát trước thực thí nghi ệm hoạt tính ức chế enzyme polyphenol osidase rau đắng rau râm - Do kết thí nghiệm bị ảnh hưởng yếu tố làm sai lệnh kết như: + Mẫu vật thí nghiệm khơng tươi, khơng đạt chất lượng + Điều kiện bảo quản mẫu cao không tốt + Sai xót q trình thao tác thí nghiệm + Sai trình tự thực bước thí nghiệm +Thực sai phương pháp - Nhưng kết thấy được: Hình 19 Mẫu táo ngâm rau râm + Hoạt tính ức chế cao cồn lớn hoạt tính ức chế caoMẫu nước Hình 20 táoLượng ngâm trongtrong nướcnước rau đắng 16 16 giờ tyrosin ống cao cồn rau râm 2.789 ml lượng tyrosin có ống cao nước rau râm có 1.948ml Kết so sánh cao cồn cao nước rau đắng cho kết luận tương tự +Hoạt tính ức chế rau đắng cao hớn hoạt tính ức chế rau râm Lượng tyrosin ống cao cồn rau đắng 3.095 ml cao lượng tyrosin có ống cao cồn rau râm Kết so sánh cao nước rau đắng cao nước rau râm cho kết tương tự TÀI LIỆU THAM KHẢO [1], [2], [3] Gertzen R, Escobar M A, (2014), "Assays of Polyphenol Oxidase Activity in Walnut Leaf Tissue", Bio-protocol, (16), pp e1213 2 Kotagiri D, Chaitanya V, (2017), "Antimicrobial and Antioxidant Activities in the Root, Stem and Leaf Extracts of Centella asiatica", advances in biotechnology & microbiology, pp Peng X, Du C, Yu H, Zhao X, et al, (2019), "Purification and characterization of polyphenol oxidase (PPO) from water yam (Dioscorea alata)", CyTA - Journal of Food, 17 (1), pp 676-684  ... Có thể dùng thực vật để ức chế ngăn chặn q trình oxi hóa này? Vì điều mà nhóm chúng tơi tiến hành thí nghiệm với mục tiêu: Khảo sát khả ức chế enzyme polyphenol oxydase từ thực vật Từ có thêm... có chất ức chế Dựa kết khảo sát trước thực thí nghi ệm hoạt tính ức chế enzyme polyphenol osidase rau đắng rau râm - Do kết thí nghiệm bị ảnh hưởng yếu tố làm sai lệnh kết như: + Mẫu vật thí... nước chiết từ rau răm, rau đắng để thử khả ức chế oxi hóa có enzyme polyphenol oxydase làm chất xúc tác II Tổng quan: Các enzyme: - Enzyme Polyphenol Oxydase (PPO monophenol monooxygenase polyphenol