Đang tải... (xem toàn văn)
KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME PROTEASE,ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG PHÁP DNS, Định tính Amino acid, Xác định amino acid, Xác định hàm lượng protein thô, Ảnh hưởng của pH môi trường đến hoạt lực enzyme α-amylase, Xác định Lipide tổng,xác định các chỉ số acid và Peroxid của chất béo
Bài 1: Định tính Amino acid phản ứng Ninhydrin Lý thuyết: Tất α-amino acid tạo phwucs màu với thuốc thử Ninhydrin theo sau: Khi đun nóng, acid tác dụng với Ninhydrin để tạo thành cacbonic, ammoniac, aldehyde tương ứng có mạch carbon ngắn amino acid Carbon Ninhydrin bị khử Sau Ninhydrin bị khử kết hợp với NH3 vừa tạo thành tiếp tục phản ứng với phân tử Ninhydrin thứ hai tạo thành hợp chất màu xanh tím có độ hấp thu quang học bước sóng 57nm Các α-amino acid tạo phức màu xanh tím với Ninhydrin, amino acid khác tạo thành màu xanh tím với Ninhydrin không tạo CO2 Các Prolin Oxyprolin tác dụng với Ninhydrin lại tạo phức màu vàng không tạo NH3 Các protein, peptide, muối ammonium ammoniac tạo thành màu xanh tím với thuốc thử ninhydrin, muốn xác định riêng amino acid cần phải loại bỏ hợp chất khỏi dung dịch Chuẩn bị: 1.1 Dụng cụ: Ống nghiệm Đèn cồn Pipettete 1ml 1.2 Hóa chất Dung dịch Glycine 0.02 % Dung dịch Protein trứng Thuốc thử Ninhydrin 0.1% 1.3 Tiến hành: Lấy hai ống nghiệm đánh số thứ tự 2: Ống Glycine 0,02% (ml) Protein trứng (ml) Ninhydrin 0,1% (giọt) 1 5 Đun nóng hai ống nghiệm phút đèn cồn đun cách thủy nhiệt độ 700C phút Kết quả: Cả hai ống nghiệm có màu xanh tím Giải thích: Có màu xanh tím Ninhydrin phản ứng với Glycine albumin có protein trứng Ninhydrin chất dùng để nhận biết α-amino acid nhờ tạo phức màu xanh tím với ninhydrin Bài 2: Xác định amino acid phương pháp sắc khí mỏng Lý thuyết: Tùy thuộc vào cấu tạo hóa học mà amino acid có khả hịa tan dung mơi khác nhau, chịu lực tác động trọng trường khác Dựa theo tính chất tách hỗn hợp amino acid tùy theo hệ số phân bố chúng hai pha lỏng pha rắn hệ thống sắc ký Dung môi hữu (pha động) tác động lực mao quản chạy qua giá mang cellulose silica gel (pha tĩnh) có chứa hỗn hợp amino acid hịa tan amino acid phụ thuộc vào tính hịa tan loại amino acid loại dung môi hữu Như vậy, dung mơi hữu di chuyển liên tục qua chất mang (có cấu trúc rỗng tạo nên lực mao quản) làm cho amino acid di chuyển từ vạch xuất phát điểm kết thúc với vận tốc khác Cùng thời gian di chuyển giá mang dung môi hữu cơ, acid amino khác có chiều dài khoảng cách khác Chuẩn bị: 1.1 Dụng cụ: Sắc khí giấy Bồn sắc khí Micropipettete Bình phun ninhydrin Máy sấy tóc 1.2 Hóa chất Dung môi TLC Dung dịch Ninhydrin Mẫu acid amino chuẩn Mẫu acid amino thí nghiệm Tiến hành: Dung bút chì vẽ đường thẳng làm vạch xuất phát cách mép sắc ký giá mang 1,5cm vạch đích đến cách mép 10cm Tiếp tục vẽ đầu chấm tròn lên vạch xuất phát đánh dấu vị trí tướng ứng mẫu amino acid Dùng micropipette chấm dung dịch amino acid lên giấy sắc ký vị trí đánh dấu vạch phát Dùng máy sấy tóc sấy giọt dung dịch acid amino vừa chấm, không cho dung dịch loang khỏi vòng tròn Chấm khoảng lần cho mẫu Cho dung môi chạy sắc ký vào bồn cho ngập qua mép sắc ký khoảng 1cm đậy sắc ký vào bồn, đậy nắp kín lại để yên 20 phút Lấy sắc ký ra, đặt vào tủ hotte 15 phút để đuổi hết dung môi Phun Ninhydrin lên sắc ký Dùng máy sấy tóc sấy khơ quan sát vệt màu xuất giaaysy sắc ký Xác định acid amino có mẫu cách so sánh vị trí vệt màu sắc ký đồ mẫu với sắc ký đồ dung dịch amino acid chuẩn Kết quả: Cơng thức tính qng đường mà acid amino di chuyển: Trong đó: l khoảng cách từ tuyến xuất phát đến tâm vệt sắc k í lo khoảng cách từ tuyến xuất phát tới tuyến dung môi Quãng đường amino acid di chuyển: Lycine: Rf = 0,73 (cm) Thyrocine: Rf = 0,79 (cm) Amino acid chuẩn: Rf = 0,69 (cm) Khi di chuyển dựa theo lực mao quản, Lycine Thyrocine di chuyển nhanh amino acid chuẩn, nên đốn Lycine Thyrocine có trọng lượng nhẹ amino acid chuẩn Bài 3: Tìm điểm đẳng điện protein phương pháp tạo pH khác Giới thiệu - Phương pháp tạo pH khác dựa phản ứng kết tủa protein pH mơi trường làm cho acid amio protein dung dịch dạng ion lưỡng cực Điểm đặc trưng điểm đẳng điệm khiến cho protein bị kết tủa tìm điểm đẳng điệm protein giúp ta biết điều kiện kết tủa protein ngược lại tránh gây kết tủa Vật liệu phương pháp tiến hành 2.1 Vật liệu: -Dung dịch protein trứng 5% thí nghiệm sử dụng protein Alumine trứng lý thuyết điểm đẳng điện protein 4,6 -Dung dịch Sodium phosphate dibasic 0.2M ( Na2HPO4 0.2M ) dung dịch Acid citric 0,1 M (C6H8O7 0.1M) hỗn hợp đệm cho cho khoảng đệm dài từ pH đến Ở thí nghiệm ta dùng hỗn hợp đệm để tạo dung dịch có pH 3.7, 4.7, 5.7 -Cồn 960 dung môi hữu giúp protein dễ dàng kết tủa điểm đẳng điện 2.2 Phương pháp tiến hành: -Lấy ống nghiệm đánh số thứ từ 1-3 STT Dung dịch NA2HPO4 0.2M (mL) Dung dịch C6H8O7 0.1M (mL) pH đạt 0.34 0.66 3.7 0.48 0.52 4.7 0.66 0.34 5.7 -Lắc ống để dung dịch đệm có độ pH tương ứng -Thêm vào ống mL dung dịch protein trứng 5%, lắc nhẹ -Thêm vào ống mL cồn 960, lắc nhẹ, để yên phút Kết giải thích 3.1 Kết quan sát: -Ống nghiệm 1: xuất lớp kết tủa phía trên, lớp kết tủa mỏn -Ống nghiệm 2: xuất kết tủa nằm ống nghiệm, lớp kết tủa dày -Ống nghiệm 3: không thấy xuất kết tủa 3.2 Giải thích kết kết luận: -Ở ống nghiệm ta khơng thấy xuất kết tủa kết luận pH 5.7 khơng phải điểm đẳng điện Albumine trứng -Ở ống nghiệm lớp kết tủa mỏng cho thấy pH dung dịch 3.7 khiến cho protein kết tủa không nhiều chứng tỏ chưa điểm đẳng điện Albumine trứng -Ở ống nghiệm lớp kết tủa dày cho thấy pH 4.7 khiến cho Albumin trứng có tổng điện tích nên chúng khơng dễ dàng di chuyển điện trường kết tủa lại với tạo thành tủa protein Từ cho thấy pH 4.7 điểm đẳng điện Albumine trứng Bài KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME PROTEASE Lý thuyết Cho protease tác dụng với casein hemoglobin, ức chế enzyme Tricloacetic Acid (TCA) để dừng phản ứng, xác định sản phẩm tạo thành phản ứng màu với thuốc thử Folin Biểu diễn hoạt tính đơn vị hoạt độ lượng enzyme phút 30ºC phân giải lượng protein tương ứng với mol tyrosin Thực hành 2.1 Dụng cụ- hóa chất 2.1.1 Dụng cụ - Ống nghiệm: 15 - Phểu lọc: - Bồn ổn nhiệt - Máy so màu 2.1.2 Hóa chất - Thuốc thử Folin (pha loãng lần) - TCA 5% - Casein 1% dung dịch đệm phosphate 1/15M pH 8.0 - Dung dịch Tyrosin chuẩn mol (0.09g tyrosin 500mL dd HCl 0.2N) 2.1.3 Nguyên liệu Chọn thơm xanh tươi, gọt bỏ lớp ngoài, cắt nhỏ xay nát Lọc qua vải vắt nước Nước thơm đem ly tâm 6000 vòng/phút 10 phút Lấy dịch bên có chứa enzyme Bromeline 2.2 Thực hành 2.2.1 Dựng đường chuẩn Tyrosin Thực theo bảng sau: Ống nghiệm Dung dịch Tyrosin chuẩn(mL) 0.2 0.4 0.6 0.8 Dung dịch HCl 0,2N (mL) 4.8 4.6 4.4 4.2 4.0 Dung dịch NaOH 0,5N (mL) 10 10 10 10 10 Thuốc thử Folin pha loãng (mL) 3 3 Lắc mạnh, sau 10 phút đo OD bước sóng 660nm 720nm Dung dịch hóa chất 5.0 10 2.2.2 Xác định lượng Tyrosin dung dịch nghiên cứu Ống nghiệm Hóa chất Ống thử (1) Dung dịch Casein 1% (mL) Dung dịch TCA 5% (mL) Dung dịch enzyme mẫu (mL) Lắc giữ 35.5ºC 10 phút Dung dịch TCA 5% (mL) 10 Để yên 30 phút, lọc lấy dịch bên Ống thử (2) 10 Lấy ống nghiệm mới, đánh dấu A, B Cho vào ống A 5mL dịch lọc từ ống nghiệm cho vào ống B 5mL dịch lọc từ ống nghiệm Thêm vào ống 10mL NaOH 0,5N 3mL thuốc thử Folin, lắc mạnh, sau 10 phút, đo OD bước sóng 660nm 720nm Tính ΔOD= ODT – OD0 Dựa vào đồ thị chuẩn suy µM Tyrosin 2.2.3 Kết ΔOD= 0.538- 0.284= 0.254 Đồ thị đường chuẩn biểu diễn lượng Tyrosin (mL) bước sóng 660nm ống nghiệm 0.18 f(x) = 0.19x 0.16 R² = 0.98 0.14 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 y= 0.1874x → x= = = 1.355 (mL) Vậy hoạt tính enzyme Bromeline là: Hoạt độ P = = = 2.168×10-3 (UI) Với: V: thể tích hỗn hợp mL Casein 1% + 10 mL TCA 5% + 1mL enzyme v: thể tích dịch lọc đem phân tích (mL) t: thời gian thủy phân (phút) m: khối lượng mẫu enzyme đem xác định hoạt tính (g) Giải thích: Dung dịch Casein thí nghiệm đóng vai trị chất Protease tác dụng với casein để tạo tyrosin amino acid khác Càng nhiều tyrosin tạo chứng tỏ hoạt tính protease mạnh Thuốc thử Folin thuốc thử hoá học dùng để đo nồng độ amino acid, màu đậm nồng độ amino acid cao Bài : ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG PHÁP DNS I/ LÝ THUYẾT Phương pháp dựa sở phản ứng tạo màu đường khử với thuốc thử DNS Cường độ màu hỗn hợp phản tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử phạm vi định II/ DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ Dụng cụ: Ống nghiệm có nắp: Becker 250ml: Pipet 10ml: Đũa thủy tinh: Pipet 1ml: Chén cân: Bình định mức 100ml: Cuvet: Bóp cao su: Máy đo màu Hóa chất Thuốc thử Acid ditrosalisylic (DNS) Dung dịch Glucose mẫu (500ppm) III/ TIẾN HÀNH Cân 4-6 gram táo, giã nhuyễn, tiến hành trích ly 40ml cồn 90o cách chưng cách thủy khoảng 10 phút becher 250ml Chuyển dịch trích ly sang 40ml cồn 80o, thực hành lần để đảm bảo lượng đường trích ly hồn tồn Làm khơ dịch trích ly becher khác chưng cách thủy đến dịch khơ đến 30ml, cho vào bình khác thêm vào để đạt 100ml, lắc Cho dung dịch vào ống nghiệm tương ứng, chưng cách thủy đến dung dịch bình chuyển sang màu nâu đỏ Ống nghiệm Chuẩn Glucose 500ppm Dịch xác định Dung dịch DNS 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 M1 M2 2 0.5 0.5 7.5 7.5 Đậy nắp ống nghiệm, chưng cất thủy sôi Nước cất 9.5 8.5 Sau đo hấp thu bước sóng 530nm 7.5 6.5 5.5 IV/ KẾT QUẢ Đường chuẩn nồng độ đường khử (mg/ml) bước sóng 530nm 0.6 f(x) = 0.19x R² = 0.97 0.5 OD 530 nm 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0.5 1.5 2.5 Glucose 500ppm (ml) y= 0,1942x Cx = = = 4,56ml Hàm lượng đường nguyên liệu Cx x n = 4,56 x 50 = 228 + n: hệ số pha loãng + Cx (ml): chuẩn Glucose 500ppm dịch xác định V/ BIỆN LUẬN: Do thao tác lúc thực hành khơng xác sai xót đo nên sai số lớn dẫn đến kết bị chênh lệch Lượng đường Glucose nhiều màu dịch đậm 3.5 Bài 8: Xác định Lipide tổng Giới thiệu -Xác định lipide tổng có nguyên liệu giàu lipide để xác định hàm lượng lipide có loại nguyên liệu để ứng dụng vào tạo nên chế phẩm sinh học cấu thành nên lời khuyên dinh dưỡng -Ở thí nghiệm sử dụng thiết bị Soxhlet để xác định lipide Dựa vào tính tan hồn tồn chất béo vào dung môi hữu Dùng dung môi hữu trích ly chất béo có sản phẩm thực phẩm Sau làm bay hết dung mơi, chất béo cịn lại đem cân, tính hàm lượng chất béo có sản phẩm thực phẩm Vật liệu phương pháp tiến hành 2.1 Vật liệu: -Nguyên liệu đậu phộng chứa hàm lượng lớn lipide, chủ yếu acid khơn bão hịa đơn acid khơng bão hòa đa Thường sử dụng làm dầu đậu phộng -Cồn 960 dung mơi hữu để hịa tan lipide -Thiết bị Soxhlet dung để trích dẫn lipide khỏi nguyên liệu 2.2 Phương pháp tiến hành: -Chuẩn bị mẫu: Cân xác khoảng 5g nguyên liệu nghiền nhỏ Ở thí nghiệm khối lượng mẫu bảng sau: Đậu Đậu giấy lọc Mẫu 5,045 5,73 Mẫu 5,091 6,142 -Làm khô nguyên liệu cách sấy nguyên liệu tủ sấy nhiệt độ 700C đến khối lượng khơng đổi, để nguội bình hút ẩm Ghi nhận khối lượng ngun liệu sấy khơ hồn tồn - Cho gói mẫu vào ống trụ -Bật bếp cách thủy nhiệt độ 45-500C -Mở nước hệ thống ống sinh hàn -Ether sôi, chuyển thành dạng hơi, theo siphon dẫn lên bình chiết, bay vào ống dẫn sinh hàn, gặp lạnh, ngưng tụ lại rơi vào bình chiết, hịa tan lipide ngun liệu bình chiết - Khi mức ether có chứa lipide bình chiết dâng lên, ngập siphon dẫn dung mơi xuống bình đun, ether chảy xuống bình đun Tại ether đun sôi, chuyển thành dạng hơi, theo siphon dẫn dung mơi lên bình chiết, bay vào ống sinh hàn, ngưng tụ lại rơi vào bình chiết Quá trình lặp lặp lại Kết nhận xét 3.1 Xác định lipide đồng thời nhiều mẫu nguyên liệu: - Tháo bình chiết, gấp mẫu đũa thủy tinh, đặt lên becher, để tủ hút cho bay hết ether Để tủ sấy, sấy nhiệt độ 1050 C giờ, để nguội bình hút ẩm, cân bao giấy có chứa mẫu kết sau: Đậu sấy Mẫu 5,76 Tính kết quả: Hàm lượng lipide có nguyên liệu: Mẫu 5,846 Với: G: Khối lượng mẫu đem phân tích (g) B: Khối lượng bao giấy có chứa mẫu độ kho tuyệt đối (g) (khối lượng giấy khô tuyệt đối + khối lượng mẫu giấy khơ tuyệt đối) C: Khối lượng bao giấy có chứa mẫu chiết rút lipide độ khô tuyệt đối (g) Hàm lượng Lipide có mẫu 1: % lipide = Hàm lượng Lipide có mẫu 2: %lipide = 3.2 Nhận xét: - Ta thấy mẫu ta thu % lipide 5,814 mẫu - cho thấy có chênh lệnh so với lý thuyết từ thấy sai xót thí nghiệm như: Có sai xót cân m ẫu sấy mẩu chưa khô nước Sau trích ly xong sấy chưa khơ mẫu gây ảnh hưởng đến kết - Vì cần cẩn thận cân mẫu tăng thời gian sấy khơ mẫu cho thí nghiệm sau 3.1 Kết quan sát: - Ống nghiệm 1: xuất lớp kết tủa phía trên, lớp kết tủa mỏn - Ống nghiệm 2: xuất kết tủa nằm ống nghiệm, lớp kết tủa dày - Ống nghiệm 3: không thấy xuất kết tủa 3.2 Giải thích kết kết luận: - Ở ống nghiệm ta không thấy xuất kết tủa kết luận ph 5.7 điểm đẳng điện Albumine trứng - Ở ống nghiệm lớp kết tủa mỏng cho thấy pH dung dịch 3.7 khiến cho protein kết tủa không nhiều chứng tỏ chưa điểm đẳng điện Albumine trứng - Ở ống nghiệm lớp kết tủa dày cho thấy pH 4.7 khiến cho Albumin trứng có tổng điện tích nên chúng khơng dễ dàng di chuyển điện trường kết tủa lại với tạo thành tủa protein Từ cho thấy pH 4.7 điểm đẳng điện Albumine trứng Bài 9: xác định số acid Peroxid chất béo Xác định số acid: 1.1 Lý thuyết: Định nghĩa: số acid lượng mg KOH cần thiết để trung hòa acid tự chứa 1g chất cần thử Nguyên lý: Dùng NaOH 0,1N để trung hòa acid tự chất cần thử, với phenolphetalein làm thị màu 1.2 Thực hành: a) Dụng cụ: - Buret 25ml - Giá đỡ buret - Erlen 25ml - Cốc 100ml - ống đong 50ml - pipette 5ml b) Hóa chất: - Cồn 960 - Ether trung tính - NaOh 0,1N - Phemolphtalein 1% c) Phương pháp tiến hành: Cân 5g dầu mỡ, hòa tan 50ml hỗn hợp gồm 25ml cồn 25ml ether trung tính Chuẩn độ NaOH 0,1N có màu hồng bền vững với phenolphtalein sau 30 giây Đối với loại tinh dầu có nhiều este dễ bị xà phịng hóa, ta sử dụng dung dịch NaOH 0,05N để chuẩn độ d) Kết giải thích: Thể tích NaOh dùng để chuẩn độ 0,7ml Chỉ số acid: A= = (mg) Trong đó: 5,61: số mg KOH tương ứng với 1ml NaOH 0,1N a: số ml NaOH 0,1N sử dụng định lượng b: trọng lượng chất thử để định lượng (g) lượng KOH cần để trung hòa acid tự chứa 1g chất thử 0,79mg Chất béo chưa bị oxi hóa nhiều => chất béo cịn tươi Sự hóa chất béo – Chỉ số Peroxid 2.1 Lý thuyết Khi có mặt O2 khơng khí, acid béo có thành phần dầu mỡ acid béo không no dễ dàng bị hóa phần tạo thành peroxide Hiện tượng xảy làm dầu mỡ bị ôi hay bị khơ Việc xác định số peroxide dựa vào phản ứng sau: RC2O2H2R’-COOH + 2KI + 2CH3COOH -> RC2OH2-R’-COOH + I2 + 2CH3COOK + H2O Lượng Iodine phóng thích chuẩn độ dung dịch natrithiosunfat: Na2S2O3 + I2 -> 2NaI + Na2S4O6 2.2 Dụng cụ - hóa chất: 2.2.1 Dụng cụ: - Erlen 250ml - Erlen nút nhám - Bóp cao su - Ống đong - Buret 25ml - Becher 100ml 2.2.2 Hóa chất - EDTA 5% - Chroforom - Acid acetid - Dung dịch KI bão hòa (59,8g KI/100ml) - Na2S2O3 0,002N - Chỉ thị hồ tinh bột 1% 2.3 Thực hành - Cho vào erlen khoảng 100ml dầu thực vật Ở erlen bổ sung thêm 5ml EDTA 5% (cho dịng khí qua erlen này, dùng máy bơm) - Sau thời gian giờ, lấy 5ml dung dịch dầu đem xác định số peroxide - Thêm vào 30ml hỗn hợp Cloroform – acid acetid tỷ lệ 1:2 - Lắc - Thêm tiếp 1ml dung dịch KI bão hòa Đậy nắp - Lắc hỗn hợp cẩn thận phút (thỉnh thoảng mở nắp), để yên phút bóng tối - Thêm vào hỗn hợp khoảng 50ml nước cất Định phân iod dung dịch Na2S2O3 0,002N vài giọt thị hồ tinh bột 1% dung dịch màu xanh tím hồn tồn Nếu lượng Na2S2O3 0,002N dùng q nhiều chuẩn độ lại với dung dịch Na2S2O3 0,1N - Đồng thời làm thí nghiệm kiểm chứng khơng có chất béo Nếu chuẩn màu trắng vượt qua 0,1ml Na2S2O3 phải pha lại hóa chất Kết giải thích: - Erlen chứa mẫu dầu cần 0,5ml Na2S2O3 để chuẩn độ - Erlen chứa 50ml nước cất không cần chuẩn độ Na2S2O3 => lượng Na2S2O3 0ml = (mmol peroxide/1kg chất khử) Trong đó: 0,05: 1N) số milimol peroxide tướng ứng với 1ml Na2S2O3 chuẩn độ (dung dịch V: Số ml Na2S2O3 0,002N dùng để chuẩn độ mẫu thử v: số ml Na2S2O3 0,002 N dùng để chuẩn độ mẫu trắng p: trọng lượng mẫu thử dùng để định lượng 500: Là chuyển từ dung dịch 0,002N sang dung dịch 1N Chỉ số PoV thấp chứng tỏ độ ôi mẫu chất béo mang phân tích thấp => chất béo cịn tươi - Mẫu khơng chứa dầu không cần Na2S2O3 để chuẩn độ => chứng minh khơng có chất béo => khơng có I2 tạo để phản ứng màu với tinh bột