Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất hóa học của cây giảo cổ lam ba lá gynostemma laxum(wall ) cogn của việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG LÊ THỊ LIỂU NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT HÓA HỌC CỦA CÂY GIẢO CỔ LAM BA LÁ [GYNOSTEMMA LAXUM (WALL.) COGN.] CỦA VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Đà Nẵng - Năm 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG LÊ THỊ LIỂU NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT HÓA HỌC CỦA CÂY GIẢO CỔ LAM BA LÁ [GYNOSTEMMA LAXUM (WALL.) COGN.] CỦA VIỆT NAM Chuyên ngành : Hóa hữu Mã số : 60.44.27 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS.TSKH TRẦN VĂN SUNG Đà Nẵng - Năm 2013 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Tác giả luận văn Lê Thị Liểu MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu Phƣơng pháp nghiên cứu 4.1 Các phƣơng pháp nghiên cứu lý thuyết 4.2 Các phƣơng pháp nghiên cứu thực nghiệm Bố cục luận văn Tổng quan tài liệu nghiên cứu CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 VỊ TRÍ PHÂN LOẠI CÂY GYNOSTEMMA LAXUM (WALL.) COGN 1.2 MÔ TẢ THỰC VẬT VÀ PHÂN BỐ CỦA CHI GYNOSTEMMA BLUME 1.2.1 Đặc điểm chung hình thái 1.2.2 Đặc điểm phân bố 1.2.3 Đặc điểm thực vật phân bố Gynostemma laxum (Wall.) Cogn 1.2.4 Đặc điểm thực vật phân bố số loài khác chi Gynostemma Blume 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƢỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI VỀ CHI GYNOSTEMMA BLUME 12 1.3.1 Các nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Markino 12 1.3.2 Các nghiên cứu thành phần hóa học lồi Gynostemma laxum (Wall.) Cogn 21 1.4 TÁC DỤNG VÀ CÔNG DỤNG 25 1.4.1 Tác dụng công dụng Gynostemma pentaphyllum 25 1.4.2 Tác dụng công dụng G laxum 27 1.5 HỢP CHẤT FLAVONOID 28 1.5.1 Định nghĩa 28 1.5.2 Phân loại 28 1.5.3 Tính chất số hợp chất flavonoid 29 1.5.4 Các phƣơng pháp định lƣợng 30 1.5.5 Các phƣơng pháp chiết xuất tổng hợp flavonoid 31 1.5.6 Tác dụng sinh học ứng dụng 32 CHƢƠNG NHỮNG NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 35 2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 35 2.1.1 Nguyên liệu 35 2.1.2 Hóa chất, thiết bị nghiên cứu 36 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 2.2.1 Phƣơng pháp chiết mẫu thực vật [18] 37 2.2.2 Phƣơng pháp tách tinh chế chất [18] 37 2.2.3 Phƣơng pháp xác định cấu trúc hóa học chất 38 2.2.4 Phƣơng pháp lựa chọn chất hấp phụ dung môi chạy cột sắc ký [18] 38 2.2.5 Tỉ lệ lƣợng mẫu chất cần tách với kích thƣớc cột [18] 39 2.2.6 Cách nạp silica gel vào cột [18] 40 2.2.7 Cách nạp mẫu vào cột [18] 41 2.3 THỰC NGHIỆM 42 2.3.1 Chiết mẫu thô 42 2.3.2 Sơ đồ thực nghiệm 44 2.3.3 Tách chất từ phần cao n–butanol 45 2.3.4 Tách chất từ phần cao n-hexan 47 2.4 XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG NHĨM HOẠT CHẤT CHÍNH TRONG CÂY CỔ YẾM LÁ BÓNG 50 2.4.1.Phƣơng pháp định lƣợng flavonoid toàn phần 50 2.4.2 Xác định hàm lƣợng hợp chất quercetin có nhóm chất flavonoid cổ yếm bóng 50 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52 3.1 NHẬN DẠNG CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC 52 3.1.1 Chất GCLB17 52 3.1.1 Chất GCLH5.5 60 3.2 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG NHĨM HOẠT CHẤT CHÍNH TRONG CÂY CỔ YẾM LÁ BÓNG 71 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO 77 QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI (bản sao) DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT KÝ HIỆU δ Độ chuyển dịch hoá học (NMR) J Hằng số tƣơng tác (NMR) CHỮ VIẾT TẮT BuOH butanol br Broad (NMR) COSY Correlation Spectroscopy d Doublet (NMR) DEPT Distortionless enhancement by polarisation transfer DMSO Dimethyl sulfoxide D2O Nƣớc đƣợc đơteri hoá EI Electronic impact EtOAc Ethyl acetate G Gynostemma FT Fourier transform HMBC Heteronuclear multiple bond correlation HMQC Heteronuclear multiple quantum coherence HPLC High-performance liquid chromatography IR Infrared m Multiplet (NMR) Me Methyl MeOH Methanol MS Mass spectrometry NMR Nuclear magnetic resonance PDA Photodiode Array Detector ppm Parts per million Rf Retention factor s Singlet (NMR) SKLM Sắc ký lớp mỏng t Triplet (NMR) UV Ultraviolet DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu Tên bảng bảng 1.1 1.2 1.3 Ảnh hƣởng VN1-VN7 phát triển tế bào ung thƣ ngƣời Hoạt tính gây độc tế bào hợp chất 1-5 So sánh thành phần hoá học mẫu dƣợc liệu giảo cổ lam cổ yếm bóng thu hái Hồ Bình Trang 16 20 22 Số liệu phổ 13C-NMR 1H-NMR quercetin 3.1 [125/500 MHz,  (ppm)] Số liệu phổ 3.2 13 C-NMR 1H-NMR hỗn hợp β-sitosterol stigmasterol [125/500 MHz,  (ppm)] 53 61 DANH MỤC CÁC HÌNH Số hiệu Tên hình hình Trang 1.1 Lồi giảo cổ lam - Thất diệp đởm (G pubescen) 1.2 Loài giảo cổ lam - cổ yếm bóng (G laxum) 1.3 Lồi giảo cổ lam - Ngũ diệp sâm (G pentaphyllum) 10 1.4 Loài Gynostemma longipes 11 2.1 Ảnh Gynostemma laxum (Wall.) Cogn thu hái Hồ Bình 35 2.2 Sơ đồ chiết mẫu phận mặt đất cổ yếm bóng 43 2.3 Sơ đồ thực nghiệm 44 2.4 Sơ đồ phân lập tinh chế chất từ cao n-butanol 46 2.5 Sơ đồ phân lập tinh chế chất từ cao n-hexan 49 3.1 Phổ IR chất GCLB17 KBr 55 3.2 Phổ 1H-NMR chất GCLB17 56 3.3 Phổ 1H-NMR chất GCLB17 (giãn rộng) 57 3.4 Phổ 13C-NMR chất GCLB17 58 3.5 Phổ DEPT 13C-NMR chất GCLB17 59 3.6 Phổ 1H-NMR chất GCLH5 63 3.7 Phổ 1H-NMR chất GCLH5.5 (giãn rộng) 64 3.8 Phổ 1H-NMR chất GCLH5.5 (giãn rộng) 65 3.9 Phổ 13C-NMR chất GCLH5 66 3.10 Phổ 13C-NMR chất GCLH5.5 (giãn rộng) 67 3.11 Phổ 13C-NMR chất GCLH5.5 (giãn rộng) 68 3.12 Phổ DEPT 13C-NMR chất GCLH5 69 3.13 Phổ DEPT 13C-NMR chất GCLH5.5 (giãn rộng) 70 3.14 Sắc ký đồ HPLC dịch chiết EtOAc 72 66 Hình 3.9 Phổ 13C-N R chất GCLH5.5 67 Hình 3.10 Phổ 13C-N R chất GCLH5.5 (giãn rộng) 68 Hình 3.11 Phổ 13C-N R chất GCLH5.5 (giãn rộng) 69 Hình 3.12 Phổ DEPT 13C-N R chất GCLH5.5 70 Hình 3.13 Phổ DEPT 13C-N R chất GCLH5.5 (giãn rộng) 71 3.2 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG NHÓM HOẠT CHẤT CHÍNH TRONG CÂY CỔ YẾM LÁ BĨNG Qua kết nghiên cứu nhóm, chúng tơi thấy thành phần hoạt chất cổ yếm bóng (Gynostemma laxum) chất nhóm flavonoid Do vậy, để góp phần chuẩn hóa dƣợc liệu chúng tơi sử dụng phƣơng pháp chiết chọn lọc nhóm chất flavonoid, xác định thành phần flavonoid nhóm chất Hàm lƣợng tổng chất flavonoid 1,65% so với khối lƣợng nguyên liệu khô Sử dụng phƣơng pháp HPLC cho thấy, nhóm flavonoid quercetin chiếm khoảng 47% (có sắc ký đồ kèm theo) Nhƣ dự đốn quercetin đóng vai trị quan trọng hoạt tính cổ yếm bóng 72 Hình 3.14 Sắc ký đồ HPLC dịch chiết EtOAc 73 Hình 3.15 Phổ UV-Vis peak peak 2(RT = 13.486 16.111 phút) 74 Hình 3.16 Phổ UV-Vis peak peak 4(RT 18.308 19.318 phút) 75 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Trong luận văn này, tiến hành phân lập khảo sát thành phần hóa học diện cao n–butanol cao n–hexan phần mặt đất giảo cổ lam ba hay gọi cổ yếm bóng (Gynostemma laxum) thuộc họ Bí (Cucurbitaceae) thu hái Hịa Bình, Việt Nam Bằng phƣơng pháp sắc ký cột silica gel pha thƣờng pha đảo, sắc ký lọc gel sephadex LH – 20 kết hợp với sắc ký lớp mỏng, với nhiều hệ dung ly khác nhau, cô lập đƣợc ba hợp chất Bằng phƣơng pháp phổ nghiệm IR, 1H-NMR, 13 C-NMR, DEPT- NMR, xác định đƣợc cấu trúc hợp chất GCLB17 GCLH5.5 phân lập từ dịch chiết n-butanol n-hexan nhƣ sau: GCLB17: Quercetin GCLH5.5: Hỗn hợp Stigmasterol β-sitosterol ( Stigmast-5-en-3-ol) có tỉ lệ 1: Hỗn hợp Stigmasterol β-sitosterol hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học, tồn phổ biến giới thực vật Hỗn hợp đƣợc cơng trình nghiên cứu khác xác định có tác dụng sinh học nhƣ: có tác dụng chống oxi hóa, giảm cholesterol máu làm tăng hàm lƣợng chất HDL–C (high density lipid – cholesterol) thành phần quan trọng để bảo vệ tim mạch, phòng chống xơ vữa động mạch, tăng sức đề kháng cho thể, nghiên cứu stigmasterol cịn chất cịn có tác dụng phòng chống ung thƣ định nhƣ: ung thƣ tuyến tiền liệt, ung thƣ vú, ruột già Các chất đƣợc phân lập trƣớc từ dịch chiết khác loài Gynostemma pentaphyllum Tuy nhiên, chất lần đƣợc phân lập từ dịch chiết n–butanol n–hexan loài Gynostemma laxum 76 Nhƣ vậy, có nhiều hợp chất flavonoid G laxum G pentaphyllum giống Bằng phƣơng pháp chiết chọn lọc nhóm chất flavonoid, xác định hàm lƣợng tổng chất flavonoid 1,65% so với khối lƣợng nguyên liệu khô Sử dụng phƣơng pháp HPLC cho thấy, nhóm flavonoid quercetin chiếm khoảng 47% Nhƣ dự đốn quercetin đóng vai trị quan trọng hoạt tính cổ yếm bóng KIẾN NGHỊ Tiếp tục phân lập khảo sát thành phần hóa học dịch chiết etylacetat phân đoạn lại dịch chiết n-butanol n–hexan Chạy sắc ký cột kết hợp với GC-MS phần cao n-hexan để xác định thành phần hóa học Thử hoạt tính sinh học chất tách để có nhìn tổng thể hố thực vật hoạt tính sinh học lồi cổ yếm bóng Ứng dụng thành phần có hoạt tính việc điều chế thuốc chữa bệnh bổ sung vào nguồn thực phẩm làm tăng giá trị sử dụng 77 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Phạm Phƣơng Anh (2011), Nghiên cứu thành phần hóa học lồi Gynostemma laxum (Wall.) Cogn., Khóa luận tốt nghiệp Dƣợc sĩ Đại học - Đại học Dƣợc Hà Nội [2] Phạm Tuấn Anh (2008), Nghiên cứu thành phần hoá học số tác dụng sinh học Giảo cổ lam thu hái Sapa, Luận văn Thạc sỹ Dƣợc học – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội [3] Bộ môn Dƣợc liệu, trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội (2002), Thực tập dược liệu – Phần hố học [4] Bộ mơn Dƣợc liệu, trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội (2006), Bài giảng dược liệu tập I [5] Bộ môn Thực vật, trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội (2004), Thực tập thực vật nhận biết thuốc, Trung tâm thông tin – thƣ viện, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội [6] Bộ môn Thực vật, trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội (2004), Thực vật dược phân loại thực vật [7] Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam, tập 2, 308 [8] Võ Văn Chi (2007), Sách tra cứu tên cỏ Việt Nam, NXB Giáo dục, 285 [9] Nguyễn Thị Minh Dân (2008), Tính đa dạng chi Gynostemma tỉnh Cao Bằng, Khoá luận tốt nghiệp Dƣợc sỹ Đại học – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội [10] Nguyễn Tiến Dẫn (1999), Nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng sinh học Thất diệp đởm, Luận văn thạc sỹ Dƣợc học – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội 78 [11] Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hoá học thuốc, NXB Y học, 42 – 75, 131 – 196, 243 – 299 [12] Nguyễn Thị Thanh Duyên (2000), Tiếp tục nghiên cứu thành phần hoá học tác dụng sinh học Thất diệp đởm, Khoá luận tốt nghiệp Dƣợc sỹ Đại học – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội [13] Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ, I, 563 – 576 [14] Phạm Thanh Hƣơng (2003), Nghiên cứu thành phần hoá học tác dụng sinh học Giảo cổ lam, Khoá luận tốt nghiệp Dƣợc sỹ Đại học – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội [15] Trần Thị Thu Hƣơng (2006), Nghiên cứu thành phần hoá học Giảo cổ lam thu hái Sapa, Khoá luận tốt nghiệp dƣợc sỹ Đại học – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội [16] Phạm Thanh Kỳ, Phạm Tuấn Anh, Trần Thị Thu Hƣơng, Chu Đình Kính (2008), “Ombuin, Quercetin, Acid vanilic phân lập từ Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Markino) Việt Nam”, Tạp chí Dược học, (387) [17] Bùi Thị Thanh Mai (2009), Chiết xuất phân lập saponin dược liệu Giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum (Thunb.), Khoá luận tốt nghiệp dƣợc sỹ Đại học – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội [18] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Các phương pháp cô lập hợp chất tự nhiên, NXB ĐHQG Tp HCM, tr – 73; 151 – 206; 323 – 334 Tài liệu tiếng Anh [19] Chen B.H et al (2008), “Determination of flavonoids and saponins in Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) chromatography-mass spectrometry”, Markino by liquid Analytica Chimica Acta, 626(2), 200-201 [20] C Murugan, G Jeya Jothi, V S Manickam (2008), Flora of Tirunelveli 79 hills (southern Western ghats), Bishen Singh Mahendra Pal Singh, 1(1), 426 [21] DING Shu-li, ZHU Zhao-yi, LI Yong (1994), Pharmacognostical study of genus Gynostemma of cucurbitaceae in China, Chinese pharmaceutical journal [22] Elmer Drew, Merrill (1904 – 1992), Note worthy Philippine Plants, Bureau of Public Printing, Manila [23] Elmer Drew, Merrill (1923), An enumeration of Philippine flowering plants, Bureau of printing, Manila [24] Feng Yin et al (2004), Dammarane Type Glycosides from Gynostemma pentaphyllum, J.Nat.Prod, 67(6), 942 – 952 [25] Home Nan Zhu (2001), Dictionary of seed plants name, Latin – Chinese – English, Science Press, China [26] Institute of Science and Technology (1922), The Philippine journal of Science Vol.20, Bureau of printing, Manila [27] Kuwahara, M., et al , "Dammarane saponins of Gynostemma pentaphyllum Makino, Isolation of malonylginsenosides-Rb1, -Rd, and malonylypenoside V", Chemical & Pharmaceutical Bulletin, vol 37, no 1, pp.135-139, 1989 [28] Ning Li , Chun-Fu Wu, Xin-Yue Xu , Zhen-Yang Liu, Xian Li , YuQing Zhao (2012), “Triterpenes possessing an unprecedented skeleton isolated from hydrolyzate of total saponins from Gynostemma pentaphyllum”, European Journal of Medicinal Chemistry, 50 (2012) 173-178 [29] Pham Thanh Ky et al (2011), Benzyl Glycosides from the Aerial parts of Gynostemma laxum and Their NF-κB Inhibitory Activity in HepG2 Cells, Bull Korean Chem Soc 2011, Vol 32, No 10 3763 80 [30] Pham Thanh Ky et al (2010), “Dammaran type saponins from Gynostemma pentaphyllum, Phytochemistry”, (71), 994 – 1001 [31] R N Mishra, Dharnidhar Joshi (2011), “Jiao Gu Lan Gynostemma pentaphyllum : The Chinese Rasayan- Current Research Scenario, International Journal of Reseach in Phamaceutial and Biomedical Siences”, Vol 2(4) Oct-dec 2011 (1483-1506), ISSN: 2229-3701 [32] Wu Zheng Yi, Peter H Raven, Hong Deyuan (2008), Flora of China Vol.19, Science Press, China [33] Toshiko Satake, Kohei Kamiya, Yin An et al (2007), The anti thrombotic Active Constituents from Centella asiatica Biol Pharm Bull., 30(5), 935-940 [34] Zhang Xiuli, Tan Huarong, Hu Yinghui (1997), Nutritional component of Gynostemma laxum from Anhui province, Journal of Anhui Normal University (Natural Science), 1997(3) [35] Zhou ZJ, Lin AP, Zhou XD, Liao YK (1989), A comparative identification of four Gynostemma spp herbs and their various species from Guangxi, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi (China journal of Chinese materia medica), 14(4), 202-6, 253 Tài liệu tiếng Trung Quốc [36] Vũ Đức Tuyên, Dƣơng Tuấn Sơn (2002), Sổ tay hố học phân tích (ấn thứ 2) 7, Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân, NXB Cơng nghiệp hố học Bắc Kinh, 820 ... (Wall .) Cogn. ] Việt Nam? ?? Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu thành phần hóa học giảo cổ lam ba (Gynostemma laxum) Việt Nam Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu - Dịch chiết mẫu giảo cổ lam ba Việt Nam - Chiết mẫu... đích thực 1.1 VỊ TRÍ PHÂN LOẠI CÂY GYNOSTEMMA LAXUM (WALL .) COGN Theo tài liệu Thực vật dược phân loại thực vật [6], Cây cỏ Việt Nam [13], vị trí G.laxum (Wall .) Cogn hệ thống phân loại thực vật... (Magnolliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp Sổ (Dileniidae) Liên Hoa tím (Violanae) Bộ Bí (Cucurbitales) Họ Bí (Cucurbitaceae) Chi Gynostemma Lồi Gynostemma laxum Khố phân loại chi Gynostemma