Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện và xác định hàm lượng một số chất bị cấm sử dụng trong mỹ phẩm

Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện và xác định hàm lượng một số chất bị cấm sử dụng trong mỹ phẩm

A GIỚI THIỆU LUẬN ÁN 1.Tính cấp thiết luận án Từ xa xưa người có nhu cầu làm đẹp, biết làm đẹp Ngày nay, xã hội phát triển, kinh tế phát triển, nhu cầu làm đẹp ngày tăng cao Những sản phẩm “làm đẹp” cho người mỹ phẩm Chất lượng mỹ phẩm vấn đề cần phải quan tâm mỹ phẩm sử dụng tiếp xúc trực tiếp với phận bên thể, mỹ phẩm loại sản phẩm khơng có qui định liều lượng thời gian sử dụng, ảnh hưởng đến sức khỏe vẻ đẹp thể Trong phân loại sản phẩm, hàng hóa theo tính an tồn, mỹ phẩm thuộc nhóm - cần có quản lý nhà nước tính an tồn sản phẩm Đánh giá, giám sát chất lượng mỹ phẩm nhiệm vụ quan trọng hệ thống kiểm nghiệm Nhiệm vụ cơng tác kiểm tra chất lượng mỹ phẩm giám sát tiêu ảnh hưởng tới an toàn mỹ phẩm, quan trọng việc kiểm sốt có mặt chất bị cấm, bị giới hạn nồng độ, hàm lượng phép sử dụng, có mặt sản phẩm mỹ phẩm lưu hành thị trường Việt Nam Hiệp định hệ thống hòa hợp ASEAN quản lý mỹ phẩm, bổ sung vào năm 2013 có quy định danh sách 1373 chất nhóm chất khơng phép có mặt sản phẩm mỹ phẩm (Annex II, Part 1) 285 chất nhóm chất khơng phép sử dụng trừ trường hợp ngoại lệ phải tuân theo giới hạn điều kiện quy định kèm theo (Annex III, Part 1) Không giống lĩnh vực quản lý dược phẩm có hệ thống Dược điển xây dựng chặt chẽ từ nhiều năm, Việt Nam chưa có hệ thống phương pháp chuẩn để kiểm tra chất cấm, chất cần kiểm soát giới hạn hàm lượng mỹ phẩm theo yêu cầu Hiệp định hệ thống hòa hợp ASEAN Bản thân ASEAN ban hành phương pháp hòa hợp chung Trong số có phương pháp hóa lý để xác định hay định tính định lượng số kim loại nặng, tretinoin, 2-phenoxy ethanol số alkyl 4-hydroxybenzoat, hydroquinon, số chất màu cấm số glucocorticoid mỹ phẩm Những phương pháp đáp ứng phần nhỏ yêu cầu mặt kỹ thuật để kiểm tra, giám sát đối tượng chất cấm mỹ phẩm, thân phương pháp này, muốn triển khai thực tế Việt Nam, cần đánh giá thực nghiệm phù hợp áp dụng mẫu mỹ phẩm có mặt Việt Nam thực tế điều kiện trang thiết bị nước ta (đánh giá chuyển giao phương pháp) Để đáp ứng kịp thời cho cơng tác kiểm nghiệm, kiểm sốt an tồn mỹ phẩm kinh tế mở xu hướng hội nhập quốc tế, luận án “ Nghiên cứu xây dựng qui trình phát hiện và xác định hàm lượng một số chất bị cấm dùng mỹ phẩm” thực Mục tiêu luận án: 1) Thẩm định chuyển giao phương pháp phân tích hịa hợp ASEAN quản lý mỹ phẩm 2) Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích xác định số chất bị cấm mỹ phẩm 3) Kiểm tra, phát chất bị cấm chất có giới hạn hàm lượng sử dụng nghiên cứu số dạng mẫu mỹ phẩm thị trường Những đóng góp luận án: 3.1.Về việc triển khai, thẩm định chuyển giao các phương pháp ASEAN Đã thẩm định chuyển giao thành công phương pháp hòa hợp ASEAN để phát Tretinoin định lượng chì, arsen Đã đưa thơng số phân tích cụ thể điều kiện xử lý mẫu, thơng số thiết bị phân tích Kết phương pháp hịa hợp hồn tồn phù hợp triển khai Việt Nam với trang thiết bị sẵn có cán đào tạo phương pháp phân tích HPLC quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS 3.2.Về thiết lập và đánh giá quy trình phân tích mới: -1-  Đã xây dựng 10 quy trình phân tích, có quy trình phân tích đồng thời quy trình phân tích chất riêng biệt, cụ thể sau: 3.2.1 Quy trình phân tích đồng thời chất màu cấm son môi  Về điều kiện phân tích sắc ký: Dựa qui trình phân tích đồng thời ASEAN (ACM SIN 02) để phát chất màu cấm: MY, PO, RB, sử dụng pha động: nước - dd TBA 0,005M (25 : 75) Thực nghiệm cho thấy: Pha động có tủa lại kể sau lọc Thời gian để tủa trước lọc không nêu rõ, nêu “để yên vài giờ” mà thực tế để ngày tủa lại Vì nghiên cứu cụ thể thời gian, cách thức để pha động tủa hoàn toàn (để lạnh 14-15 oC 72 để yên nhiệt độ phòng ngày) lọc trước đưa vào hệ thống sắc ký Đã đưa thêm Pigment red 53 phân tích đồng thời với chất màu MY, PO RB  Về đánh giá qui trình: Đã đánh giá đầy đủ tiêu: độ thích hợp hệ thống (các pic cân đối, Rs nhỏ 2,2, số đĩa lý thuyết thấp 2592), độ lặp lại tốt cho chất màu cấm (RSD thời gian lưu nhỏ 1%, RSD diện tích pic nhỏ 2%), độ cao (tỷ lệ thu hồi từ 94,0% đến 101,5%) Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) thấp ASEAN nhiều lần (MY 100 lần, RB 200 lần; PO 2000 lần PR 0,003 µg/ml) Qui trình vừa để định tính (phát hiện) thơng qua số: độ tinh khiết píc, so sánh thời gian lưu chồng phổ píc nghi ngờ với píc chất chuẩn Qui trình định lượng cách so sánh diện tích píc píc thu từ mẫu thử với píc thu từ mẫu chuẩn Như vậy, ngồi việc phát đánh giá mức độ lạm dụng nguy hiểm, thể thành công việc triển khai cải tiến qui trình sẵn có ASEAN 3.2.2.Quy trình phát hiện, định lượng đồng thời chất Sudan  Về xử lý mẫu điều kiện sắc ký: Sau khảo sát, hỗn hợp methanol – ethyl acetat (1:1) lựa chọn làm dung mơi chiết mẫu Với hệ dung mơi này, nhóm chất Sudan tan tốt, dung dịch mẫu thử không bị lẫn nhiều tạp chất, qui trình chiết đơn giản, dễ dàng Đây dung môi mà tác giả Nguyễn Văn Yên cộng nghiên cứu năm sau dùng lại (năm 2010) để hòa tan sudan cắn thu sau chiết mẫu mỹ phẩm thực phẩm aceton Điều kiện phân tích bao gồm: cột C18 (250 x 4,6 mm, µm) (Phenomenex Apollo), pha động: methanol - nước (95:5), tốc độ dịng: 1,0 ml/phút, thể tích tiêm: 20 µl, điều kiện detector PDA: quét phổ dải 300-900 nm, lấy sắc đồ 488 nm Về đánh giá quy trình phân tích: Cho kết tốt độ thích hợp hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng, LOD, LOQ độ ổn định dung dịch chất màu Sudan LOQ thấp: Sudan I 0,23 µg/ml, Sudan II 0,24 µg/ml, Sudan III 0,25 µg/ml, Sudan IV 0,24 µg/ml cho phép phát chất bị cấm Sudan son, sơn móng, phấn trang điểm nồng độ nhỏ (ppm) 3.2.3.Quy trình phát đồng thời 12 chất steroid kem bơi da Về qui trình xử lý mẫu điều kiện sắc ký: Phương pháp hòa hợp ASEAN (ACM/MAL 07) để định tính chất thuộc nhóm steroid dùng methanol làm dung mơi chiết chất phân tích từ mẫu kem bôi da Tuy nhiên, qua khảo sát số chất thuộc 12 steroid nghiên cứu cho pic khơng cân đối, số mẫu có nhiều tạp phân tích sắc ký Vì vậy, chúng tơi chọn hỗn hợp dung môi dicloromethan-methanol (9 : 1) để chiết mẫu phối hợp làm nóng cách thủy Tiếp theo, thay ly tâm, hỗn hợp để lạnh nước đá để tủa tá dược, lọc bốc cách thủy tới cắn hòa tan cắn acetonitril - methanol - nước (20 : 30 : 30), lọc Với cách xử lý mẫu này, pic thu cân đối, mẫu phân tích (hầu khơng thấy xuất píc phụ) Giữ nguyên điều kiện cột sắc ký ASEAN (ODS 250 x 4,6 mm, 5µm) Pha động ACN - nước (48:52) chế độ đẳng dòng thay cho gradient dung môi phương pháp ASEAN Đã xây dựng qui trình định tính đồng thời 12 chất steroid có bao gồm chất phương pháp ASEAN -2- Về đánh giá qui trình phân tích: Kết đánh giá độ thích hợp hệ thống (độ lặp lại thời gian lưu, diện tích pic, hệ số phân giải Rs, số đĩa lý thuyết), độ đặc hiệu độ ổn định dung dịch đảm bảo yêu cầu để phân tích phát đồng thời 12 chất steroid mỹ phẩm dạng kem bơi da Qui trình áp dụng máy phân tích có bơm, kênh dung mơi 3.2.4 Quy trình phân tích thủy ngân mỹ phẩm dạng kem phấn bơi da Quy trình phân tích thủy ngân phương pháp hịa hợp xây dựng cho thiết bị đo dịng liên tục (khơng sẵn có điều kiện sở nghiên cứu), tiến hành khảo sát, thiết lập quy trình phân tích phù hợp với thiết bị đo gián đoạn tổng lượng thủy ngân cho đối tượng kem phấn bôi da - Với mẫu phấn bôi da, khảo sát lựa chọn hỗn hợp H 2SO4 – HNO3 (1:1), vơ hóa triệt để mẫu phấn, cụ thể hóa thơng số thiết bị vơ hóa mẫu vi sóng, bổ sung thêm giai đoạn xử lý mẫu (giai đoạn thêm dung dịch KMnO 4) để phù hợp với điều kiện thiết bị đơn vị nghiên cứu Kết thẩm định quy trình sau xây dựng cho thấy quy trình thiết lập đảm bảo độ đặc hiệu, độ đúng, độ lặp lại, có khoảng tuyến tính phù hợp với đối tượng áp dụng, đồng thời có LOD LOQ hồn tồn đáp ứng yêu cầu phương pháp ASEAN yêu cầu quản lý qui định Thông tư 06/2011/TT-BYT ngày 25/1/2011 Bộ Y tế Việt Nam (Giới hạn thủy ngân mẫu mỹ phẩm cho phép ≤ ppm, phương pháp xây dựng có LOD 30 ng, LOQ 100 ng thủy ngân mẫu phân tích tương ứng với 0,15 ppm 0,5 ppm mẫu mỹ phẩm) 3.2.5 Về qui trình định tính, định lượng Hydroquinon  Về xử lý mẫu điều kiện sắc ký: Hỗn hợp methanol - đệm phosphat pH 5,5 (50 : 50) dung môi tốt để chiết mẫu, dung dịch mẫu thử không bị lẫn nhiều tạp chất cho pic Hydroquinon cân đối Hơn nữa, pha động chương trình sắc ký để phân tích Hydroquinon khảo sát lựa chọn Phương pháp hòa hợp ACM INO 03 dùng ethanol 96% để chiết mẫu Áp dụng điều kiện sắc ký phương pháp ACM INO 03 đưa với số đối tượng mẫu thực tế, kết pic Hydroquinon khơng tách khỏi píc chất chưa biết có sẵn mẫu Thực tế cho thấy, pha động phương pháp ASEAN có ACN nước (45 : 55) nên khả rửa giải, phân tách chất hạn chế kể thay đổi tỷ lệ khác dung môi Thay pha động hỗn hợp ACN-đệm phosphat pH 5,5 (50 : 50) giải yêu cầu Sự có mặt dung dịch đệm làm thay đổi rõ rệt tính phân cực pha động, tương tác chất phân tích với pha động, píc Hydroquinon rửa giải tách biệt hoàn toàn  Về đánh giá qui trình phân tích: Những kết thẩm định độ đặc hiệu cao, độ lặp lại, độ tốt, LOD LOQ (thấp so với phương pháp ASEAN) cho thấy quy trình xây dựng thích hợp cho việc phát hiện, định lượng Hydroquinon đối tượng mỹ phẩm dạng kem bôi da mẫu có chất rửa giải gần với Hydroquinon mà dùng chương trình sắc ký phương pháp hịa hợp ASEAN khơng tách hồn tồn 3.2.6 Về quy trình phân tích chất màu riêng biệt cịn lại (MY, PO, PR, RB, CV) Về xử lý mẫu: Lựa chọn dung mơi chiết mẫu: có MY PO dùng hỗn hợp dung môi chiết giống phương pháp ASEAN (Dimethylformamid - acid phosphoric (95:5)) Các chất màu lại phải khảo sát thực nghiệm để lựa chọn Cụ thể sau: RB ACN - nước (1:1), PR dimethylsulfoxid, CV ACN - THF - dd đệm amoniac pH 9,5 -10,0 (2 : : 5) Các dung mơi chọn lựa hịa tan tốt chất cần phân tích, dịch chiết mẫu thử sạch, pic thu cân đối Với mẫu son thỏi, sơn móng (dạng sáp, thể chất quánh), dùng lượng nhỏ tetrahydrofuran hay dimethylformamid để phân tán mẫu chiết thay cho chiết pha lỏng - lỏng -3- (n-hexan dung môi chiết mẫu ASEAN) cho kết tương ứng cách làm đơn giản nhanh (vì khơng cần chuyển vào bình gạn chờ phân lớp) Về điều kiện sắc ký: Các qui trình để phân tích riêng MY, PO, PR dùng loại cột sắc ký C18, thành phần pha động hỗn hợp methanol - dd đệm pH 6,2, khác tỷ lệ thành phần pha động bước sóng lấy sắc ký đồ Đây thuận lợi thực tế thay đổi nhỏ phân tích chất màu với cột sắc ký thông dụng, dung môi dễ kiếm, cách chuẩn bị pha động đơn giản Tương tự, thay đổi bước sóng phân tích phân tích chất RB (550nm) CV (590nm) với pha động hỗn hợp: ACN-THF-dd đệm pH 9,0 (2:3:5) cột C18 Đã đánh giá phương pháp phân tích độ thích hợp hệ thống, độ đặc hiệu, độ xác, độ đúng, độ lặp lại, khoảng tuyến tính, LOD, LOQ Kết đánh giá cho thấy phương pháp có độ đặc hiệu cao, độ xác độ đạt yêu cầu, đảm bảo phù hợp với việc áp dụng kiểm tra chất cấm, chất cần kiểm soát hàm lượng mỹ phẩm mức nồng độ nhỏ, mẫu phức tạp LOD quy trình thiết lập đáp ứng yêu cầu đưa phương pháp hòa hợp có ASEAN Một số phương pháp phân tích có độ nhạy tốt nhiều lần so với phương pháp phân tích chất cấm tương ứng mà ASEAN đưa  Đã có 11/13 quy trình phân tích phê duyệt áp dụng thực tế để kiểm tra chất cấm cách kịp thời, phục vụ cho công tác quản lý chất lượng mỹ phẩm, quy trình cịn lại chờ phê duyệt 3.3 Về áp dụng các quy trình để kiểm tra các chất cấm các mẫu mỹ phẩm: Lần khảo sát thực tế tiến hành để đánh giá có mặt nhiều đối tượng chất cấm (bao gồm: chất màu nhóm chất màu (Metanil yellow, Rhodamin B, Pigment red 53, Pigment orange 5, Crystal violet Sudan), chất nhóm chất có tác dụng dược lý bị cấm hay có giới hạn hàm lượng sử dụng (Tretinoin, Steroid, Hydroquinon) kim loại nặng (As, Pb, Hg) với 230 mẫu mỹ phẩm thuộc nhóm sản phẩm khác (son, sơn móng, phấn, kem bơi da, sữa rửa mặt, dầu gội đầu) Kết có tới 30 mẫu phát thấy có chất bị cấm vượt giới hạn cho phép (chiếm khoảng 13%) Ý nghĩa luận án: - Đánh giá chuyển giao phương pháp ASEAN nhằm khẳng định tính khả thi, phù hợp áp dụng Việt Nam với trang thiết bị sẵn có cán đào tạo phương pháp phân tích HPLC AAS, sẵn sàng cho hòa hợp quản lý mỹ phẩm với nước ASEAN theo ”Hiệp định hòa hợp ASEAN quản lý mỹ phẩm” - Các quy trình phân tích xây dựng thẩm định chặt chẽ điều kiện trang thiết bị Việt Nam, tài liệu tham khảo quan trọng mặt chuyên môn, bổ sung cho phương pháp hòa hợp ASEAN cơng bố Các quy trình phân tích (kể các quy trình chuyển giao) tài liệu kỹ thuật có tính khoa học cao, thiết thực, kịp thời đáp ứng cho công tác kiểm tra chất cấm mỹ phẩm, cơng tác cịn mẻ Việt Nam Những quy trình áp dụng rộng rãi trung tâm kiểm nghiệm mỹ phẩm thuộc hệ thống quản lý doanh nghiệp sản xuất, kinh doanh mỹ phẩm để góp phần kiểm tra mức độ an toàn sản phẩm Năm 2012, đào tạo cho 76 học viên từ 30 trung tâm kiểm nghiệm phía Bắc phát chất màu cấm phương pháp xác định giới hạn chì, arsen Năm 2013 đào tạo cho 30 học viên từ 16 trung tâm kiểm nghiệm cán Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương quy trình phân tích phát corticoid kem bơi da mỹ phẩm - Bước đầu đánh giá thực trạng tình hình chất lượng mỹ phẩm thị trường Việt Nam có nhiều điểm bất cập tiêu an toàn, cần quan tâm quản lý cách sát nữa, tăng cường công tác kiểm tra hậu mại để đảm bảo an toàn cho người sử dụng Bố cục luận án -4- Luận án gồm 150 trang Đặt vấn đề (2 trang), Chương 1: Tổng quan tài liệu (40 trang), Chương 2: Đối tượng, nguyên vật liệu phương pháp nghiên cứu (14 trang), Chương 3: Kết (78 trang), Chương 4: Bàn luận (16 trang), Chương 5: kết luận kiến nghị (2 trang), 125 tài liệu tham khảo với 46 tài liệu tiếng Việt, 79 tài liệu tiếng Anh Phần nội dung có: 79 bảng, 32 hình, phụ lục B NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN Chương I TỔNG QUAN Đã tập hợp trình bày có hệ thống nội dung công tác quản lý kiểm tra chất lượng mỹ phẩm giới Việt Nam Giới thiệu tính chất hóa, lý, ứng dụng, độc tính phương pháp phân tích tác giả ngồi nước nhóm chất bị cấm chất có giới hạn hàm lượng sử dụng: nhóm chất màu: Metanil yellow (MY), Rhodamin B (RB), Pigment orange (PO), Pigment red 53 (PR) , Crystal violet (CV), chất Sudan; nhóm chất có tác dụng dược lý mà bị cấm hay có giới hạn hàm lượng sử dụng: Tretinoin, hydroquinon, corticoid; nhóm kim loại nặng: As, Pb, Hg Trình bày cụ thể phương pháp hòa hợp ASEAN liên quan đến đối tượng chất cấm mà luận án nghiên cứu Chương II ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng mẫu nghiên cứu: 06 nhóm mẫu mỹ phẩm mua thị trường: Son mơi (son thỏi, son nước), sơn móng, phấn trang điểm (phấn má, phấn mắt), kem bôi da mỹ phẩm, sữa rửa mặt, dầu gội đầu 2.2 Nguyên vật liệu thiết bị: - Chất đới chiếu: có nguồn gốc, lơ, hạn sử dụng rõ ràng (Phần lớn hãng Merck, Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương, Hàn quốc) - Dung mơi hóa chất: dung mơi sử dụng đạt tinh khiết cho phân tích HPLC, hóa chất đạt mức độ tinh khiết phân tích tinh khiết dùng cho AAS (superpure) - Thiết bị: Các thiết bị, máy phân tích Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương hiệu chuẩn theo qui định ISO/IEC 17025 gồm: Máy sắc ký lỏng hiệu cao Shimadzu có trang bị detector PDA; máy quang phổ hấp thụ nguyên tử Z-5000 (Hitachi, Nhật Bản) trang bị dụng cụ phân tích thuỷ ngân chuyên dụng "A.A-Mercury Reduction Unit" phân tích hóa hydrid chun dụng; cân phân tích Mettler Toledo AB204S xác đến 0,1mg; thiết bị vơ hóa mẫu vi sóng Milestone Start-D (Mỹ); hệ thống lọc nước trao đổi ion (Easypure UV/UF, Barnsted, Mỹ); cốc teflon chuyên dụng cho AAS 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp HPLC 2.3.1.1 Khảo sát, lựa chọn qui trình phân tích: Khảo sát, lựa chọn phương pháp xử lý mẫu: chọn dung môi phương pháp chiết cho chiết hồn tồn chất phân tích từ mẫu, loại bỏ tối đa ảnh hưởng mẫu, chất phân tích bền mơi trường pha mẫu (dựa vào yếu tố: tính tan chất phân tích, đặc điểm mẫu, phương pháp phân tích) Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký phù hợp: cột sắc ký, nhiệt độ cột, pha động, tốc độ dịng, bước sóng phân tích với detector PDA, thể tích tiêm mẫu Định tính so sánh thời gian lưu, độ tinh khiết pic chồng phổ UV-VIS, so sánh hệ số tương đương píc nghi ngờ thu từ mẫu thử với pic thu từ mẫu chuẩn Định lượng cách so sánh diện tích chiều cao píc thu từ mẫu thử với mẫu chuẩn 2.3.1.2 Đánh giá phương pháp phân tích: Với đối tượng nghiên cứu chất cấm nên thẩm định đánh giá phương pháp phân tích coi phép thẩm định đánh giá tạp chất (thường có nồng độ nhỏ mẫu) Tham khảo dự thảo hướng dẫn ASEAN đánh giá phương pháp phân tích mỹ phẩm, hướng dẫn ICH, Dược điển Mỹ (USP 34), Dược điển Anh BP 2010, -5- thông tư 22/TT-BYT, tài liệu đào tạo VKNTTW chuyên gia, qui định số cần đánh giá:  Với qui trình phân tích định tính: đánh giá tính thích hợp hệ thống sắc ký, độ đặc hiệu, giới hạn phát  Với qui trình phân tích xác định giới hạn tạp (Hg, Pb, As): độ thích hợp hệ thống, độ đặc hiệu, giới hạn phát (theo ICH), USP yêu cầu thêm: độ khoảng xác định  Với qui trình phân tích định lượng: độ phù hợp hệ thống sắc ký, tính đặc hiệu, độ xác, khoảng tuyến tính, độ đúng, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng đạt yêu cầu qui trình ASEAN đưa - Tính thích hợp hệ thống: Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn, tự tạo hay mẫu thử (ít lần tiêm) Yêu cầu: Độ phân giải pic liền kề với píc chất cần phân tích phải ≥ 1,5 Số đĩa lý thuyết ≥ 2000 Giá trị RSD thời gian lưu ≤ 1,0% diện tích píc phải ≤ 2,0% Trường hợp giá trị RSD > 2%, phải có giải thích phù hợp Các thơng số khác píc phải đáp ứng yêu cầu chung phương pháp HPLC - Độ đặc hiệu: Tiến hành sắc ký loại mẫu: mẫu trắng (dung mơi pha động/dung mơi hịa tan mẫu hay pha loãng mẫu); mẫu (mẫu mỹ phẩm khơng có chất cần phân tích); mẫu chuẩn; mẫu tự tạo (mẫu mỹ phẩm khơng có chất cần phân tích cho thêm chất chuẩn cần phân tích chuẩn bị theo quy trình) mẫu thử chuẩn bị theo quy trình Yêu cầu: Trên sắc ký đồ mẫu thử/mẫu tự tạo: píc chất cần phân tích phải tách hồn tồn khỏi píc khác (nếu có mẫu), píc chất cần phân tích có thời gian lưu khác khơng có ý nghĩa thống kê với pic chất chuẩn thu từ mẫu chuẩn Sắc ký đồ mẫu trắng, dung dịch mẫu khơng xuất píc khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu chất chuẩn Nếu có đáp ứng píc phải ≤ 1,0% so với đáp ứng píc mẫu chuẩn Píc chất cần phân tích sắc ký đồ dung dịch thử phải tinh khiết Hệ số chồng phổ UV-VIS píc hoạt chất cần phân tích thu sắc ký đồ dung dịch thử/tự tạo với píc tương ứng sắc ký đồ dung dịch chuẩn ≥ 0,99 - Khoảng nồng độ tuyến tính: Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn (5 dung dịch) Xác định phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan nồng độ chất chuẩn có mẫu đáp ứng píc thu sắc ký đồ phương pháp bình phương tối thiểu Yêu cầu: Hệ số tương quan (r) phải ≥ 0,997 (hay R2 ≥ 0,995) Trường hợp r < 0,997 phải có giải thích phù hợp Hệ số y-intercept nồng độ 100% (Y): Y ≤ 5,0% cho Hydroquinon (kem chứa Hydroquinon có hàm lượng tối đa cho phép ≤ 2%); Y ≤ 10% cho chất màu cấm, Tretinoin, nguyên tố độc với: Y = (Hệ số chắn x 100)/ Spic nồng độ 100% - Độ đúng: Xác định mẫu tự tạo Cách 1: Chuẩn bị 03 loại mẫu tự tạo cách thêm xác lượng chất chuẩn chất cần phân tích vào mẫu khơng có chất Với phép thử định lượng, lượng chất chuẩn thêm vào tương ứng với mức nồng độ 80%, 100% 120% so với nồng độ phân tích Tại mức nồng độ, thực 03 mẫu độc lập Tính kết thu hồi theo dung dịch chuẩn phương trình hồi quy tuyến tính Cách 2: chuẩn bị phân tích mẫu thử độc lập với lượng chất chuẩn thêm vào tương ứng với mức nồng độ 100% qui trình phân tích Tính lượng thu hồi theo công thức: Tỷ lệ thu hồi (%) = (Lượng chất phân tích tìm lại x 100)/ Lượng chất chuẩn thêm vào Tham khảo hướng dẫn ICH, ASEAN AOAC, yêu cầu với phép thử định lượng: Tỷ lệ thu hồi 98,0-102,0% cho qui trình phân tích định lượng Hydroquinon RSD tỷ lệ thu hồi ≤ 2,0% mức nồng độ Tỷ lệ thu hồi (80,0 – 110,0%) cho qui trình phân tích chất màu cấm, Tretinoin Hg (nồng độ chất phân tích nhỏ 100 ppb 10 ppm) Tỷ lệ thu hồi (60,0-115,0%) cho qui trình phân tích phương pháp AAS Pb, Cd, As kỹ thuật lò kỹ thuật hydrid (nồng độ phân tích 10 -8) Trường hợp nằm ngồi khoảng này, phải có giải thích phù hợp - Khoảng xác định: Được suy từ kết độ (từ giá trị nhỏ đến giá trị lớn độ đúng) -6- - Độ xác: Bao gồm độ lặp lại (định lượng 06 mẫu thử độc lập ngày) độ xác trung gian (tiến hành độ lặp lại khác ngày/khác kiểm nghiệm viên/khác hệ thống HPLC) Tham khảo hướng dẫn AOAC, giới hạn chấp nhận phù hợp cho mẫu phân tích nồng độ nhỏ (100 ppm): Giá trị RSD kết định lượng kiểm nghiệm viên/mỗi ngày (n=6) ≤ 3,0% hai kiểm nghiệm viên/khác ngày (n=12) phải ≤ 5,0% - Giới hạn phát (LOD), giới hạn định lượng (LOQ): Có thể tiến hành theo cách pha lỗng dựa vào đường tuyến tính độ lệch chuẩn đáp ứng Giá trị LOD = (3,3 x δ)/a, đó: δ: Độ lệch chuẩn đáp ứng mẫu (placebo), a: Hệ số góc đường hồi quy tuyến tính (y = ax +b) nồng độ đáp ứng píc chất cần phân tích LOQ = 3,3 x LOD (kl/tt) 2.3.2 Phương pháp AAS: Áp dụng định lượng thủy ngân (và kim loại độc) kem phấn bơi da mỹ phẩm  Thiết lập qui trình phân tích thủy ngân: Qui trình phải phù hợp với thiết bị hóa lạnh sẵn có, phương pháp đo toàn lượng gián đoạn (khác với ASEAN thiết bị đo dịng liên tục) mỹ phẩm dạng kem bơi da phấn trang điểm (phấn má, phấn mắt) Nghiên cứu thiết lập điều kiện cụ thể cho giai đoạn phương pháp phân tích thủy ngân: Khảo sát, lựa chọn qui trình xử lý mẫu (tác nhân vơ hóa, lượng mẫu đem phân tích, lượng tác nhân sử dụng) Xác định thông số làm việc máy quang phổ (vạch phổ đo, cường độ dòng làm việc đèn cathod rỗng, độ rộng khe (slit width), thời gian lấy tín hiệu, chế độ đo ) Thơng số hoạt động phân tích thủy ngân (nhất tốc độ quay bơm nhu động) Thao tác đo  Đánh giá qui trình phân tích: Các tiêu cần đánh giá: độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ đúng, độ xác, khoảng xác định, giới hạn phát giới hạn định lượng (tương tự phương pháp HPLC) Yêu cầu: Độ tuyến tính: r ≥ 0,997, y-intercept ≤ 10%; Độ xác: RSD ≤ 10% (n=6), RSD ≤ 11(n=12); Độ đúng: đánh giá qua tỷ lệ thu hồi 2.3.3 Thẩm định chuyển giao các phương pháp, tính khả thi qui trình ASEAN điều kiện Việt Nam: Thẩm định tính khả thi, chuyển giao phương pháp biên soạn lại qui trình phân tích Tretinoin, chì, arsen theo qui trình ASEAN đưa gồm: Độ thích hợp hệ thống, độ đặc hiệu, độ xác, khoảng tuyến tính, độ đúng, LOD, LOQ theo yêu cầu qui trình ASEAN đưa 2.3.4 Phương pháp xử lý sớ liệu phân tích: Các kết thực nghiệm xử lý tính giá trị thống kê Microsoft Excell để rút nhận xét kết luận Chương III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết xây dựng qui trình phân tích số hợp chất bị cấm sử dụng mỹ phẩm 3.1.1 Metanil yellow 3.1.1.1 Xử lý chuẩn bị mẫu: Đối tượng mẫu mỹ phẩm nghiên cứu áp dụng với Metanil yellow (MY) son mơi, sơn móng Qua khảo sát chọn dung môi chiết mẫu hỗn hợp DMF acid phosphoric (95:5) Mẫu thử chuẩn bị từ khoảng 2g mỹ phẩm 3.1.1.2 Lựa chọn điều kiện phân tích Metanil yellow: Sau q trình khảo sát thực nghiệm, điều kiện sắc ký lựa chọn: Cột Apollo C18 (250x 4,6mm; 5µm) cột sắc ký có tính tương đương; detector PDA đặt dải bước sóng từ 200-900nm, lấy sắc đồ 424 nm; pha động methanol-dung dịch đệm pH 6,2 (55: 45); 1,0 ml/phút; thể tích tiêm mẫu 20 µl; nhiệt độ phịng 3.1.1.3.Thẩm định quy trình  Tính thích hợp hệ sắc ký: Kết sau lần phân tích mẫu cho thấy: thời gian lưu có RSD < 1% diện tích píc có RSD < 2%, số đĩa lý thuyết trung bình 5468 Độ đặc hiệu: Đối với dung dịch chuẩn, sắc ký đồ xuất pic rõ ràng MY thời gian lưu khoảng 16,3 phút Đối với mẫu trắng (mẫu mỹ phẩm không chứa MY: mẫu MY01), sắc ký đồ pic xuất tương ứng với thời gian lưu MY Đối với -7- mẫu tự tạo (mẫu MY01 trộn thêm lượng xác MY chuẩn), sắc ký đồ (SKĐ) cho pic tương ứng với pic MY SKĐ dung dịch chuẩn t R phổ UV-VIS (hệ số chồng phổ 0,9997), đồng thời pic MY tách riêng khỏi pic khác  Độ tuyến tính: Trong khoảng nồng độ 0,4-20,0µg/ml, có tương quan tuyến diện tích pic nồng độ MY, hệ số tương quan r 0,9999 hệ số intercept nồng độ 100%: Y= 4,15%  Độ xác (gồm độ lặp lại ngày khác ngày): Qua lần phân tích độc lập mẫu tự tạo dựa son môi (mẫu MY01) cho RSD ngày 1,31% ngày 0,80%, mẫu dựa sơn móng tay (mẫu MY02) cho RSD 1,43% 2,00%  Độ đúng: Được đánh giá son môi cho tỷ lệ thu hồi tốt 97,5% (từ 95,1% đến 98,4%, mẫu tự tạo có sơn móng tay 86,0% (từ 84,8% đến 88,0%)  Giới hạn phát giới hạn định lượng: LOD cho MY 0,12 µg/ml (tương đương 1,2µg/g mẫu) LOQ 0,4 µg/ml (tương đương 4,0 µg/g mẫu) Giới hạn phát thấp tới 25 lần so với phương pháp ASEAN ACM SIN 02 đưa 3,0 µg/ml 3.1.2 Rhodamin B 3.1.2.1 Xử lý chuẩn bị mẫu : Đối tượng mỹ phẩm nghiên cứu áp dụng với Rhodamin B (RB) phấn mắt, phấn má, sơn móng, son nước, son thỏi Thêm xác lượng chuẩn RB vào mẫu (đã xác định sơ khơng chứa RB), để mẫu tự tạo có chứa RB với hàm lượng khoảng 20µg/g, chiết mẫu hỗn hợp acetonitril nước (1:1) Đối với mẫu son sơn móng phân tán mẫu n-hexan trước chiết 3.1.2.2 Lựa chọn điều kiện phân tích Rhodamin B Đã chọn điều kiện sắc ký tương đối phù hợp: Cột Alltech, Grace RP18 (250x 4,6 mm; µm) nhiệt độ phòng; detector PDA: quét phổ từ 300-900 nm, lấy sắc ký đồ 550 nm; pha động: ACN - THF - Dung dịch đệm pH 9,0 (2:3:5); 1,0ml/phút; tiêm mẫu 100 µl 3.1.2.3 Thẩm định phương pháp  Độ đặc hiệu: Trên sắc ký đồ: mẫu chuẩn xuất pic rõ ràng RB với thời gian lưu khoảng 8,9 phút; mẫu trắng khơng có pic xuất tương ứng với thời gian lưu RB; mẫu tự tạo cho pic tương ứng với pic RB sắc ký đồ dung dịch chuẩn thời gian lưu, đồng thời tách riêng khỏi pic khác Với mẫu phát có RB (RB14), sắc ký đồ dung dịch thử cho pic có thời gian lưu với pic dung dịch chuẩn RB phổ UVVIS trùng với phổ UV-VIS dung dịch chuẩn RB, hệ số chồng phổ 0,9949 a) b) c) Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu RB chuẩn (a), mẫu placebo với mẫu N2 (b) mẫu tự tạo N2 có thêm chuẩn (c) Khoảng nồng độ tuyến tính: Kết đáp ứng sắc ký đồ (thông qua chiều cao pic H) cho thấy phương pháp phân tích xây dựng cho đáp ứng tuyến tính tốt khoảng nồng độ phân tích RB từ 50 đến 1150 ng/ml với hệ số tương quan r = y-intercept 1,32%  Độ xác: Độ lặp lại ngày RB mẫu tự tạo N1 có RSD 1,38% 1,06% (n=6), mẫu RB14 (có RB) giá trị RSD 1,77% 1,50% Độ lặp lại khác ngày có RSD 1,65% mẫu tự tạo N1 RSD 1,2% mẫu RB14  Độ đúng: Thực nghiệm mẫu thêm chuẩn mẫu RB14 cho thấy phương pháp cho độ tương đối tốt, thể qua tỷ lệ tìm lại đạt khoảng 86,0 - 99,8% -8-  Giới hạn phát hiện: LOD RB 0,04µg/ml dung dịch tiêm sắc ký (lượng cân mẫu khoảng 0,5g, thể tích pha lỗng 25ml) LOD mẫu khoảng 2,0µg/g chế phẩm 3.1.3 Pigment red 53 3.1.3.1 Xử lý chuẩn bị mẫu : Đối tượng nghiên cứu với Pigment red 53 (RR) 20 mẫu mỹ phẩm (được ký hiệu PR01-PR20) gồm: mẫu son nước, mẫu son rắn mẫu phấn má Sau khảo sát, dimethylsulfoxid chọn làm dung môi chiết mẫu hồ tan PR loại nhiều thành phần khác mẫu với qui trình xử lý mẫu đơn giản 3.1.3.2 Lựa chọn điều kiện phân tích Pigment red 53 HPLC Triển khai thử nghiệm, điều kiện sắc ký chọn sau: Cột Apollo C18 (250 x 4,6 mm; µm); detector PDA lấy sắc ký đồ bước sóng 490 nm; pha động methanol - đệm pH 6,2 (65:35), thay đổi tỷ lệ cần; 1,0 ml/phút; thể tích mẫu tiêm 20 µl; nhiệt độ cột 30 oC 3.1.3.3 Thẩm định phương pháp  Độ đặc hiệu: Trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn xuất pic rõ ràng PR; mẫu trắng khơng có pic xuất tương ứng với thời gian lưu PR; với mẫu tự tạo, sắc ký đồ cho ta pic tương ứng với pic PR sắc ký đồ dung dịch chuẩn thời gian lưu, độ tương thích so sánh phổ UV-VIS, píc có độ tinh khiết cao (> 99%)  Khoảng tuyến tính: Trong khoảng nồng độ 1,2 – 7,7µg/ml có tương quan tuyến tính diện tích pic nồng độ PR với hệ số tương quan r 0,9997 hệ số y-intercept 1,4%  Độ lặp lại - Độ đúng: Việc đánh giá độ lặp lại độ thực đồng thời mẫu tự tạo: son nước (PR07), son rắn (PR10), phấn má (PR17) Kết thực nghiệm cho thấy, phương pháp có độ lặp lại tốt qua lần phân tích độc lập (đều có RSD thấp, từ 0,65% đến 1,39%) Tỷ lệ thu hồi PR loại mẫu cao (99,43% đến 101,09%)  LOD LOQ: LOD với PR xác định 0,4 µg/ml (tương ứng với 80µg/g mẫu mỹ phẩm) LOQ với PR xác định 1,2 µg/ml (tương ứng với 240 µg/g mẫu mỹ phẩm) 3.1.4 Pigment orange 3.1.4.1 Xử lý chuẩn bị mẫu: Đối tượng mẫu mỹ phẩm nghiên cứu áp dụng với Pigment orange (PO) son môi, sơn móng Qua khảo sát số dung mơi chiết hỗn hợp dung mơi N,Ndimethyl formamid acid phosphoric (95:5) hệ dung mơi phù hợp hồ tan hoạt chất cần phân tích (hiệu suất chiết cao) loại nhiều thành phần khác có mẫu Tuy nhiên, với mẫu son dạng thỏi, cần dùng dicloromethan để phân tán mẫu trước chiết 3.1.4.2 Lựa chọn điều kiện phân tích Pigment orange Đã tiến hành khảo sát chọn lựa điều kiện sắc ký phù hợp sau: Cột Apollo C18 (250ì4,6 mm; àm); pha ng methanol dung dch đệm pH 6,2 (85:15); 1,0 ml/phút; bước sóng lấy sắc đồ 490 nm; thể tích mẫu tiêm 20 µl; nhiệt độ phân tích 30 oC 3.1.4.3 Thẩm định phương pháp  Độ đặc hiệu: Kết cho thấy, sắc ký đồ mẫu chuẩn xuất rõ ràng pic PO (t R khoảng 10,5 phút); sắc ký đồ mẫu trắng không xuất pic tương ứng với thời gian lưu PO; sắc ký đồ mẫu tự tạo xuất rõ ràng pic có thời gian lưu tương ứng PO tách riêng khỏi pic khác mẫu So sánh phổ UV- VIS pic với pic thu từ mẫu chuẩn, hệ số tương đương 0,9953 Phương pháp có tính đặc hiệu PO  Khoảng nồng độ tuyến tính: Trong khoảng nồng độ 1,1- 86µg/ml có tương quan tuyến tính gữa diện tích pic nồng độ với hệ số tương quan r hệ số y- intercept 2,28%  Đánh giá độ lặp lại: Giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) từ kết hàm lượng PO tìm mẫu tự tạo (sau lần phân tích cho mẫu) dao động khoảng 1,26-1,64% Như phương pháp phân tích có độ lặp lại tốt vùng giới hạn định lượng (2,1 µg/ml)  Độ đúng: Kết cho thấy khả tìm lại nằm khoảng từ 97,6- 104,1% với độ lệch chuẩn tương đối nhỏ 2% (RSD từ 1,04 đến 1,92%) phương pháp có độ tốt chất có hàm lượng nhỏ mẫu giới hạn định lượng -9-  Giới hạn phát giới hạn định lượng: LOD xác định 0,65 µg/ml (26 µg/g mẫu mỹ phẩm), so với công bố phương pháp ASEAN ACM SIN 02 16 µg/ml, LOD qui trình thấp gần 25 lần LOQ xác định 2,15µg/ml 3.1.5 Crystal violet 3.1.5.1 Xử lý chuẩn bị mẫu: Đối tượng mẫu mỹ phẩm nghiên cứu áp dụng với Crystal violet (CV) son môi, sơn móng, phấn mắt Qua khảo sát chọn dung mơi chiết mẫu: cho son mơi sơn móng hỗn hợp ACN : THF : dung dịch đệm amoniac pH 9,5-10,0 (2:3:5); cho phấn mắt hỗn hợp acetonitril : dung dịch đệm amoniac pH 9,5-10,0 (2:5) 3.1.5.2 Lựa chọn điều kiện phân tích CV: Qua khảo sát chọn lựa điều kiện phân tích sau: Cột Alltech, Grace RP18 (250x 4,6 mm; µm), nhiệt độ phịng; detector PDA lấy sắc ký đồ 590 nm; pha động: ACN-THF-dung dịch đệm pH 9,0 (20:30:50);1,0 ml/phút; thể tích mẫu tiêm100 µl 3.1.5.3 Thẩm định phương pháp phân tích: Sử dụng mẫu mỹ phẩm kiểm tra sơ không chứa CV son nước Starshine 08 (CV13, N1), son thỏi Essance RD201(CV15, N2), sơn móng Melia tím (CV11 N3) phấn mắt Belove tím (CV03, N4) thẩm định phương pháp mẫu đặt tên mẫu trắng  Độ đặc hiệu: Các sắc ký đồ thu cho thấy: với dung dịch chuẩn xuất pic rõ ràng CV (tR khoảng 8,6 phút); với mẫu trắng khơng có pic xuất tương ứng với thời gian lưu CV; với mẫu tự tạo, sắc ký đồ cho ta pic tương ứng với pic CV sắc ký đồ dung dịch chuẩn thời gian lưu độ tương thích so sánh phổ UV-VIS  Độ lặp lại độ đúng: Trên mẫu, phương pháp có độ lặp lại, độ tốt, thể qua giá trị RSD thấp (0,73-2,03%) sau lần phân tích độc lập, tỷ lệ thu hồi tốt (94,0- 101,3%)  Giới hạn phát hiện: LOD CV 0,04 µg/ml (khoảng 2,0µg/g mẫu mỹ phẩm) 3.1.6 Các chất Sudan 3.1.6.1 Xử lý chuẩn bị mẫu: Đối tượng nghiên cứu hợp chất Sudan mẫu son (son gió son môi dạng thỏi) thu thập thị trường Sau khảo sát số hệ dung môi, hệ dung môi methanol - ethyl acetat (1:1) nhận thấy hệ mà nhóm chất Sudan tan tốt, dung dịch mẫu thử không bị lẫn nhiều tạp chất nên chọn làm dung môi chiết mẫu 3.1.6.2 Lựa chọn điều kiện phân tích Sudan: Khảo sát hệ thống máy HPLC Shimadzu, điều kiện phân tích chọn lựa: Cột Apollo C18 hay Phenomenex C18 (4,6 x 250 nm; µm); pha động: MeOH-nước (93:7);1,0 ml/phút; bước sóng lấy SKĐ 488 nm; thể tích tiêm mẫu 20 µl 3.1.6.3 Đánh giá phương pháp  Độ thích hợp hệ thống: Kết cho thấy, hệ sắc ký ổn định, đạt yêu cầu phân tích đồng thời chất Sudan: RSD thời gian lưu nhỏ 1% RSD diện tích pic nhỏ 2%, độ phân giải 6,28; 3,98 9,12 hệ số đối xứng pic 1,05; 1,02; 1,04 1,05  Độ đặc hiệu: Mẫu khơng có pic có thời gian lưu trùng với thời gian lưu pic Sudan, pic Sudan mẫu tự tạo tách khỏi píc mẫu, đồng thời tách hồn tồn khỏi có thời gian lưu phổ tương đương với píc Sudan thu từ dung dịch chuẩn (hệ số chồng phổ từ Sudan I đến Sudan IV là: 0,9984; 0,9996; 0,9999 0,9999)  Khoảng nồng độ tuyến tính: Trong khoảng nồng độ 0,45-5,63µg/ml (Sudan I) 0,48-5,96 µg/ml (Sudan II); 0,51-6,36µg/ml (Sudan III) 0,47-5,92µg/ml (Sudan IV) có tương quan tuyến tính diện tích pic nồng độ Sudan  Độ lặp lại: Kết cho thấy phương pháp có độ lặp tốt mẫu khảo sát SD03 SD05 (RSD từ 0,59% đến 2,73%)  Độ đúng: Được đánh giá mẫu tự tạo mức nồng độ 50%; 100% 120% Phương pháp có độ thu hồi cao hai mẫu khảo sát nồng độ phân tích nhỏ (0,45µg/ml) Sudan I: 94-102,1%; Sudan II: 98,9-106,1%; Sudan III: 86,5-95,7% Sudan IV: 86,7-100,0%  LOD LOQ: LOD xác định với Sudan I; II; II IV là: 0,23; 0,24; 0,25 0,24 µg/ml LOQ với Sudan I; II; II IV là: 0,75; 0,77; 0,76 0,76 µg/ml - 10 - 3.1.7 Định tính, định lượng đồng thời chất mầu bị cấm (MY, PO, PR và RB) 3.1.7.1 Xử lý chuẩn bị mẫu: Đối tượng nghiên cứu chất Metanil yellow (MY), Pigment orange (PO), Pigment red 53 (PR) Rhodamin B (RB) mẫu son (son nước, son gió, son mơi dạng thỏi) thu thập thị trường Dung môi pha mẫu N-N dimethyl formamid- acid phosphoric (95:5) 3.1.7.2 Lựa chọn điều kiện phân tích chất màu: Phương pháp ASEAN mã số ACM SIN 02 định tính chất màu MY, PO, RB có pha động hỗn hợp: nước- dung dịch TBA 0,005M (25:75) Dung dịch TBA 0,005M chuẩn bị sau: 65ml tetrabutylamonium hydroxyd (TBA) 20%, thêm nước vừa đủ 100 ml, thêm 2,8 g kali hydroxyd vào hỗn hợp trên, khuấy kỹ cho tan, điều chỉnh đến pH 7,0 với acid phosphoric để dung dịch TBA 0,5M Thêm 10 ml dung dịch TBA 0,5M vào 1000 ml methanol, lắc đều, để yên vài giờ, lọc Tuy nhiên, pha động dễ bị tủa lại (kể sau lọc), khắc phục cách: Sau thêm 10 ml dung dịch TBA 0,5M vào 1000 ml methanol, lắc đều, để yên 72 tủ lạnh 14-15 oC ngày nhiệt độ phịng để tạo tủa hồn tồn, lọc qua màng lọc 0,45µm Điều kiện sắc ký: cột Phenomenex C18 (4,6 x 250 nm; 5µm); phân tích nhiệt độ phịng; pha động nước- dung dịch TBA 0,005M (30:70); 1ml/phút; vùng quét phổ 275 – 760 nm; bước sóng lấy sắc ký đồ 435 nm (MY, PR, PO) 535 nm (RB); thể tích tiêm mẫu 20 µl 3.2.1.3 Thẩm định phương pháp phân tích:  Độ thích hợp hệ thống: Đạt yêu cầu với RSD diện tích pic MY, RB, PR, PO 0,6%, 0,85%, 1,28% 0,54%, RSD thời gian lưu 0,75%, 0,72%, 0,85%, 0,78% nhỏ 1% hệ số phân giải píc 8,6, 7,6, 17,9 bước sóng 435 nm 3,7, 7,6, 17,9 bước sóng 535 nm, đáp ứng yêu cầu xác định chất màu MY, RB, PR, PO  Đánh giá độ đặc hiệu: Trên sắc ký đồ mẫu tự tạo xuất pic tách biệt rõ ràng có thời gian lưu tương ứng MY, PR PO với thời gian lưu khoảng 7,5 phút, 17,3 phút 31,2 phút, pic RB nhỏ (12 phút), píc tách biệt với píc có mẫu (mẫu trắng) Khi so sánh phổ UV- VIS có độ tương thích tốt (hệ số similarity 0,9997; 0,9999; 0,9995 0,9919) Tại bước sóng 535nm píc thu từ mẫu tự tạo cho đáp ứng lớn pic RB (t R khoảng 12 phút), tách biệt rõ khỏi píc khác (các pic chuẩn pic mẫu), có độ tương thích cao (hệ số similarity 0,9953) so sánh phổ UV- VIS với pic thu từ mẫu chuẩn  Đánh giá độ tuyến tính: Pha dãy dung dịch chất chuẩn MY, PR, PO, RB dung môi pha mẫu, kết thu thể bảng 3.29 Bảng 3.29 Kết khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính hỗn hợp chất màu cấm STT Phương trình hồi qui r Y(%) Metanil yellow Nồng độ S pic (mAU.s) (µg/ml) 0,86 30748 1,73 62407 4,32 158323 6,91 254161 8,64 254161 10,37 382929 Rhodamin B Nồng độ S pic (mAU.s) (µg/ml) 0,82 75536 1,63 152158 4,08 386129 6,53 619756 8,16 773960 9,79 930822 Pigment red 53 Nồng độ S pic (mAU.s) (µg/ml) 2,34 34985 4,68 71328 11,70 181858 18,72 293610 23,40 367429 28,08 442756 Pigment orange Nồng độ S pic (mAU.s) (µg/ml) 2,04 52854 4,08 111263 10,20 300977 16,32 482294 20,40 608220 24,48 739349 y = 37029x - 1528 y = 95291x - 2737 y = 15839x - 2733 y = 30511x - 11710 1,0000 0,97 1,0000 0,71 1,0000 1,50 0,9999 3,89  Độ xác phương pháp: Kết cho thấy phương pháp có độ xác cao, độ lặp lại ngày có giá trị RSD với MY, RB, PR, PO 0,18% 0,26%; 0,15% 0,27%; 0,28% 0,45%; 0,97% 1,10%; (với n = 6) khác ngày 0,35%; 0,55%; 1,00%; 0,27% (với n=12) Hàm lượng chất trung bình xác định mẫu tự tạo (n = 12) với MY 86,90 µg - 11 - (RSD = 0,35%); với RB 95,83 µg (RSD = 0,27%); với PR 232,11 µg (RSD = 0,55%) với PO 171,28 µg (RSD = 1,02%)  Độ đúng: Tiến hành nhóm mẫu tự tạo mức nồng độ khác nhau, nhóm mẫu thử Kết cho thấy phương pháp có độ tương đối tốt mẫu mỹ phẩm phức tạp giới hạn chất cấm nhỏ cụ thể: tỷ lệ thu hồi với MY 100,70% (100,20-101,52), RB 98,09% (97,64-98,61), PR 97,68% (97,02-98,82) PO 95,27% (94,02-96,83)  Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng: LOD LOQ MY, PR, PO, RB 0,022 0,073; 0,079 0,259; 0,0061 0,0202; 0,0012 0,0040 µg/ml 3.2 Kết xây dựng qui trình phân tích số hợp chất có tác dụng dược lý bị cấm có giới hạn sử dụng mỹ phẩm 3.2.1 Hydroquinon 3.2.1.1 Xử lý chuẩn bị mẫu: Đối tượng mẫu mỹ phẩm nghiên cứu áp dụng kem bôi da Sau khảo sát, hỗn hợp methanol - đệm phosphat pH 5,5 (50:50) hệ dung môi phù hợp để chiết mẫu, dung dịch mẫu thử không bị lẫn nhiều tạp chất cho pic Hydroquinon cân đối 3.2.1.2 Lựa chọn điều kiện phân tích Hydroquinon: ASEAN ban hành phương pháp ACM INO 03 để định lượng Hydroquinon Tuy nhiên với điều kiện sắc ký nêu, tiến hành khảo sát với dung dịch mẫu mỹ phẩm có thêm Hydroquinon, thời gian lưu Hydroquinon 4,1 phút, khơng tách hồn tồn khỏi thành phần mẫu Tham khảo tài liệu khảo sát thực nghiệm, điều kiện phân tích sau chọn lựa: Cột Apollo C8 (250×4,6 mm; µm) nhiệt độ phịng; pha động: methanol- dd đệm phosphat pH 5,5 (5 : 95); 1,0 ml/phút; bước sóng lấy sắc đồ 285 nm; thể tích tiêm mẫu 20 µl 3.2.1.3 Thẩm định phương pháp phân tích  Độ đặc hiệu: Trên sắc ký đồ mẫu tự tạo xuất pic rõ ràng có thời gian lưu tương ứng với pic Hydroquinon mẫu chuẩn, có độ tương thích (hệ số similarity 0,9953) so sánh phổ UV- VIS, đồng thời tách riêng khỏi pic khác mẫu  Độ tuyến tính: Trong khoảng nồng độ từ 3,0 - 102,0 µg/ml có tương quan tuyến tính diện tích pic nồng độ với hệ số tương quan r = 0,9999, hệ số y-intercept Y = 2,4%  Độ lặp lại - Độ đúng: Kết cho thấy RSD xác định qua lần phân tích mẫu khác có có giá trị 1% (0,56-0,82%), khả tìm lại nằm khoảng từ 94,199,0% giá trị RSD từ 0,36% đến 1,23% Như phương pháp phân tích có độ lặp lại tốt, độ chấp nhận vùng giới hạn định lượng với mẫu mỹ phẩm có phức tạp  LOD LOQ: LOD LOQ xác định 0,3 µg/ml 1,0 µg/ml 3.2.2 Tretinoin 3.2.2.1 Xử lý chuẩn bị mẫu: Đối tượng mẫu mỹ phẩm nghiên cứu áp dụng kem bơi da Cân xác khoảng 2g mẫu kem, xử lý mẫu với methanol 3.2.2.2 Điều kiện sắc ký: Theo phương pháp ASEAN mã số ACM SIN 01 điều kiện sắc ký sau: Cột Apollo C18 (4,6 x 250 mm; 5µm); nhiệt độ phịng; bước sóng lấy sắc ký đồ 353nm; pha động methanol-acid acetic 5% (90:10);1,2 ml/phút; thể tích tiêm mẫu 20 µl 3.2.2.3 Thẩm định phương pháp phân tích  Độ đặc hiệu: đánh giá dựa vào thông số thời gian lưu (khoảng 12,5 phút) so sánh phổ UV-VIS píc thu từ mẫu tự tạo mẫu chuẩn (hệ số similarity 0,9988)  Khoảng nồng độ tuyến tính: Trong khoảng nồng độ 3,0 - 64,0µg/ml, có tương quan tuyến tính diện tích pic với nồng độ Tretinoin với hệ số r = hệ số y-intercept Y=1,03%  Độ lặp lại - Độ : RSD sau lần phân tích 3,17% Khả tìm lại từ 89,7%- 94,4% chấp nhận với chất có hàm lượng nhỏ mẫu vùng gần giới hạn định lượng  LOD LOQ: LOD xác định 1,0µg/ml LOQ xác định 3,3µg/ml 3.2.3 Các steroid: Glucocorticiod nhóm chất bị cấm sử dụng mỹ phẩm Nhóm gồm nhiều chất khác nhau, để tiết kiệm thời gian công sức, cần nghiên cứu xây dựng phương - 12 - pháp cho phép phân tích đồng thời 12 corticoid thông thường mỹ phẩm (Phương pháp ASEAN phân tích đồng thời chất) 3.2.3.1 Xử lý chuẩn bị mẫu: Cân khoảng 0,2g chế phẩm, thêm 50ml hỗn hợp dicloromethan methanol (9:1), khuấy kỹ đặt cách thủy ấm, làm nguội nước đá 1h, lọc qua giấy lọc bốc cách thủy tới khơ Hịa lại cắn 25ml hỗn hợp acetonitril-methanol-nước (20:30:30), lọc qua màng lọc 0,45µm trước tiêm sắc ký 3.2.3.2 Lựa chọn điều kiện sắc ký: Toàn trình phân tích tiến hành hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu cao có trang bị detector PDA Sau thực khảo sát, tối ưu hoá để tách riêng corticoid, điều kiện sắc ký lựa chọn sau: Cột Phenomenex Luna C18 (250 x 4,6 mm; µm); pha động: acetonitril : nước (48:52); 1,0 ml/phút; bước sóng phát 240 nm; thể tích tiêm 5µl 3.2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích  Tính thích hợp hệ thống sắc ký: Tiến hành tiêm lặp lại lần dung dịch chuẩn hỗn hợp 12 steroid pha động có nồng độ khoảng 10 µg/ml vào hệ thống sắc ký Kết cho thấy hệ thống sắc ký có: Độ lặp lại tốt với RSD thời gian lưu 0,4% diện tích pic 1,4 %; số đĩa lý thuyết 8000; hệ số bất đối 1,4 độ phân giải 1,6 Do đáp ứng yêu cầu phân tích cho 12 hợp chất  Độ đặc hiệu:Tiến hành sắc ký theo điều kiện chọn mẫu: mẫu placebo; mẫu thử dung dịch chuẩn Kết thu cho thấy: Trên sắc ký đồ mẫu placebo không xuất pic thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu chất số 12 corticoid nghiên cứu Trên sắc ký đồ dung dịch mẫu tự tạo cho 12 pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu 12 pic thu từ sắc ký đồ dung dịch hỗn hợp chuẩn  Khoảng nồng độ tuyến tính: Pha dẫy dung dịch hỗn hợp 12 chuẩn pha động có nồng độ bảng , tiến hành sắc ký theo điều kiện chọn Xác định phương trình hồi qui hệ số tương quan r Kết cho thấy có tương quan tuyến tính chặt chẽ diện tích pic nồng độ chất phân tích khoảng nồng độ khảo sát với hệ số tương quan r gần  Độ xác: Độ xác tiến hành thử nghiệm mẫu tự tạo Kết cho thấy với 12 steroid có RSD 1% (0,3-0,9%)  Độ đúng: Thêm xác lượng chất chuẩn corticoid vào mẫu placebo, cho sau xử lý theo qui trình phân tích nồng độ dung dịch cuối đem sắc ký phải nằm khoảng 50 - 150% so với nồng độ định lượng Tiến hành mức nồng độ khác nhau: mức 50% (A), mức 100% (B) mức 150% (C); nồng độ thực lần Kết cho thấy tỷ lệ thu hồi trung bình steroid từ 97,99% (Betamethason propionat) đến 102,31% (Dexamethason)  LOD LOQ: LOD corticoid nằm khoảng 0,1 µg/ml (Prednison) đến 2,0 µg/ml (Betamethason propionat) Giá trị LOQ nằm khoảng 0,3-6,0 µg/ml 3.3 Kết xây dựng qui trình phân tích kim loại nặng 3.3.1 Thủy ngân 3.3.3.1 Xác định điều kiện vơ hóa mẫu: Để xây dựng quy trình xử lý mỹ phẩm trước phân tích thuỷ ngân, yếu tố sau tiến hành khảo sát: tác nhân vơ hóa, lượng mẫu đem phân tích, lượng tác nhân oxy hóa sử dụng Để vơ hóa triệt để mẫu mỹ phẩm điều kiện phản ứng khơng q mạnh, thích hợp với việc áp dụng thiết bị vơ hóa mẫu vi sóng (tiến hành điều kiện kín hồn tồn, q trình vơ hóa mẫu phải khống chế áp suất nhiệt độ) Sau vơ hóa mẫu thiết bị xử lý mẫu lị vi sóng, thêm dung dịch kali permanganat 5% để ổn định tồn lượng thủy ngân có mẫu dạng Hg 2+, sau lượng kali permanganat dư loại bỏ dung dịch hydroxylamin để chuẩn bị sẵn sàng cho q trình khử hóa Hg2+ Hg0 dạng để phân tích quang phổ hấp thụ nguyên tử Chương trình nhiệt độ cho thiết bị vơ hóa mẫu vi sóng xác lập - 13 - Khối lượng mỹ phẩm sử dụng cho lần phân tích định lượng tác nhân oxy hố cần sử dụng vơ hố mẫu Thiết bị phân tích thuỷ ngân sở cho phép xác định dải khối lượng thuỷ ngân từ 100 ng đến 1000 ng mẫu phân tích Kết thực nghiệm thu cho thấy đối tượng mẫu mỹ phẩm phân tích, lượng mẫu tối ưu cần thiết cho lần đo khoảng 0,2 g mỹ phẩm Lượng tác nhân vô hố sử dụng với lượng mẫu phân tích khoảng 0,2g xác định thích hợp là: 3ml acid nitric 65% 1ml hydroperoxid 30% cho q trình vơ hố mẫu thích hợp cho mẫu mỹ phẩm dạng kem bơi da; đồng thể tích 3ml acid nitric 65% 3ml acid sulfuric 98% với mỹ phẩm dạng phấn bôi da 3.2.2.2 Chuẩn bị mẫu đo: Cân xác khoảng 0,2000g mẫu mỹ phẩm cần xác định thủy ngân vào cốc teflon thiết bị vô hóa mẫu vi sóng Nếu lượng thủy ngân mẫu lớn điều chỉnh giảm lượng cân mẫu xuống, lượng cân mẫu đem vơ hóa phải đảm bảo không 50mg Thêm vào cốc lượng tác nhân vơ hóa tương ứng Đậy kín cốc, cho vào thiết bị vơ hóa mẫu vi sóng Vận hành thiết bị sử dụng chương trình nhiệt độ, áp suất xác định Sau q trình vơ hóa kết thúc, nhiệt độ, áp suất cốc teflon trở cân với mơi trường phịng thí nghiệm Lấy cốc teflon khỏi thiết bị Chuyển dung dịch cốc teflon vào cốc đo thủy ngân Tráng cốc teflon 20ml dung dịch acid sulfuric 5%, chuyển dịch tráng cốc sang cốc đo thủy ngân Cho thêm vào cốc đo thủy ngân nước trao đổi ion đến khoảng 100ml Thêm vào cốc giọt dung dịch kali permanganat 5% acid sulfuric 5% dung dịch cốc có màu hồng bền 15 phút Trước tiến hành đo thủy ngân, loại bỏ lượng dư kali permaganat dung dịch hydroxylamin 10% nước trao đổi ion đến màu hồng xử lý thêm để loại bỏ số tạp chất có phấn bơi da khơng bị phân hủy hết q trình vơ hóa 3.2.2.3 Xác định thơng số làm việc máy quang phổ:  Thông số máy quang phổ hấp thụ nguyên tử: vạch phổ đo: 253,7nm; cường độ dòng làm việc đèn cathod rỗng 7,5mA; độ rộng khe (slit width) 1,3nm; thời gian lấy tín hiệu 20 giây; tốc độ bơm nhu động thiết bị phân tích thủy ngân 300 vịng/phút  Thao tác đo:Chuyển dung dịch cần đo thủy ngân vào bình đo phân tích thủy ngân, thêm 10ml dung dịch SnCl 10%, đậy nắp bình đo lại lắc 10 giây Chuyển thiết bị chế độ tuần hoàn (CIRCULATE), bật bơm nhu động Khi tín hiệu hấp thụ cao ổn định tiến hành đo để ghi lại độ hấp thụ Sau thực phép đo, chuyển sang chế độ mở (OPEN) Khi độ hấp thụ đo máy quang phổ hấp thụ nguyên tử trở có nghĩa hệ thống làm thuỷ ngân lặp lại q trình đo mẫu khác Thực đo độ hấp thụ dung dịch chuẩn thủy ngân trước để thiết lập đường chuẩn thực nghiệm Sau đo độ hấp thụ dung dịch thử, dựa vào đường chuẩn thực nghiệm để tính lượng thủy ngân mẫu thử 3.2.2.4 Thẩm định qui trình  Tính đặc hiệu: Tiến hành vơ hóa ba mẫu thiết bị vơ hóa lị vi sóng với tác nhân điều kiện vơ hóa xác định Kết thu độ hấp thụ 253,7nm với mẫu 0, mẫu tự tạo 0,0420 mẫu chuẩn 0,0398  Khoảng nồng độ tuyến tính: Trong khoảng tổng lượng thủy ngân 100-1000ng có tương quan tuyến tính độ hấp thụ lượng thủy ngân với hệ số tương quan r 0,9987  Độ lặp lại: tiến hành lần phân tích độc lập theo điều kiện cách tiến hành xác định Kết cho thấy sau lần định lượng độc lập với mẫu mỹ phẩm dạng kem bơi da (HG01) có RSD mức 5,8% Kết tương tự với dạng phấn bôi da (HG02) có RSD mức 6,4% Mức - 14 - lặp lại chấp nhận với phương pháp phân tích dùng để kiểm tra phát thủy ngân mẫu mỹ phẩm dạng kem bôi da phấn bơi da  Độ đúng: Tỷ lệ tìm lại trung bình với mẫu dạng kem bơi da 102,26% (dao động từ 88,82% đến 116,55%) Tỷ lệ tìm lại trung bình với mẫu dạng phấn bơi da 100,69% (dao động từ 92,43% đến 107,49%) Kết chấp nhận với lượng thủy ngân cho vào mẫu nhỏ  Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ):LOD phương pháp xác định 30ng tính theo tổng lượng thủy ngân có phần mẫu đem phân tích Cịn LOQ 100ng thủy ngân Với lượng mẫu mỹ phẩm lấy đem phân tích 0,2g LOD LOQ tương ứng với hàm lượng thủy ngân mẫu 150 ppb 500 ppb 3.3.2 Chì (Pb): Theo phương pháp ASEAN 3.3.2.1 Xử lý mẫu : Cân xác khoảng 0,2 g mẫu vào cốc teflon dung tích 100 ml, thêm ml acid nitric 65%, ml nước oxy già 30%, để yên Lắp cốc teflon vào lò vi sóng tiến hành vơ hóa theo chương trình xác định 3.3.2.2 Qui trình phân tích  Các thơng số máy: Đèn cathod rỗng chì; cường độ đèn mA; bước sóng 283,3nm; độ rộng khe sáng 1,3 nm; cuvet graphit: tube A; tốc độ khí mang (Argon) giai đoạn nguyên tử hoá 30 ml/phút; thể tích mẫu 20µl; thể tích dung dịch 10µl  Cách tiến hành: Với thông số chọn, tiến hành đo độ hấp thụ chì dung dịch chuẩn, dung dịch thử thiết bị quang phổ hấp thụ ngun tử, kỹ thuật ngun tử hố khơng lửa, sử dụng cuvet graphit (pha loãng dung dịch thử cần) Mẫu trắng dung dịch acid nitric % Tính tốn nồng độ chì dung dịch thử dựa vào đường chuẩn 3.3.2.3.Thẩm định qui trình:  Tính đặc hiệu: dung dịch mẫu thử, mẫu trắng cho độ hấp thụ không đáng kể (nhỏ 30% giới hạn định lượng) Mẫu thử thêm chuẩn mẫu chuẩn chì cho độ hấp thụ lớn 0,05 bước sóng đặc trưng chì 283,3 nm Kết cho thấy phương pháp có độ đặc hiệu cao  Khoảng nồng độ tuyến tính: Trong khoảng nồng độ 5- 40 ng/ml có tương quan tuyến tính chặt chẽ nồng độ chì độ hấp thụ, hệ số tương quan r = 0,9995 hệ số y-intercept = 9,1%  Độ lặp lại, độ đúng: RSD nhỏ 9,5%, khả thu hồi mẫu khảo sát nằm khoảng 86,2 - 96,1%  LOD LOQ: LOD 0,8 ng/ml (200 ng/g mẫu thử) LOQ 2,6 ng/ml (660 ng/g mẫu thử) 3.3.3 Arsen (As): Theo phương pháp ASEAN 3.3.3.1 Chuẩn bị mẫu thử nghiệm: Cân xác khoảng 0,15 đến 0,2 g mẫu vào cốc teflon dung tích 100 ml, thêm ml acid nitric 65%, ml nước oxy già 30%, để n Tiến hành vơ hóa lị vi sóng theo chương trình nhiệt độ, cơng suất áp suất xác định Khi q trình vơ hóa mẫu kết thúc, để nguội, chuyển cốc phá mẫu khỏi lị vi sóng, mở nắp để khói cốc bay hết Thêm 10 ml nước trao đổi ion vào cốc, lắc đều, lọc vào bình định mức 50 ml Tráng rửa cốc phá mẫu, giấy lọc lần, lần 10 ml nước trao đổi ion, gộp dịch rửa vào bình định mức trên, vừa đủ nước trao đổi ion đến vạch, lắc Hút xác 10 ml dung dịch vào bình định mức 50 ml, thêm 10 ml acid hydrocloric 37%, thêm ml dung dịch kali iodid 20%, thêm vừa đủ nước trao đổi ion đến vạch, lắc 3.3.3.2 Qui trình phân tích  Các thơng số máy: đèn cathod rỗng arsen; cường độ đèn12mA; bước sóng 193,7nm; độ rộng khe sáng 0,4nm; tốc độ dẫn dung dịch natri borohydrid 0,5% 8ml/phút; dẫn dung dịch acid hydrocloric 4N 8ml/phút; dẫn mẫu 12ml/phút; khí acetylen 2,1lít/phút; áp suất khơng khí nén 160kPa; khí mang (Argon) 300ml/phút  Cách tiến hành:Trước tiến hành phân tích, để dung dịch chuẩn, thử trắng vào nước nóng 70 oC 30 phút, để nguội Với thông số chọn, tiến hành đo mẫu trắng, - 15 - autozero để đưa độ hấp thụ 0, đo độ hấp thụ arsen dung dịch chuẩn, dung dịch thử thiết bị quang phổ hấp thụ nguyên tử, kỹ thuật hố hydrid (pha lỗng dung dich thử cần) Tính tốn nồng độ arsen dung dịch thử dựa vào đường chuẩn 3.3.3.3 Đánh giá quy trình  Độ đặc hiệu: sử dụng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử, trang bị đèn cathod rỗng arsen đặc hiệu để phân tích arsen vạch phát xạ arsen 193,7 nm  Khoảng nồng độ tuyến tính: khoảng nồng độ 1-8 ng/ml có tương quan tuyến tính chặt chẽ nồng độ arsen dung dịch chuẩn độ hấp thụ với hệ số tương quan r 0,9990  Độ lặp lại, độ đúng: Kết cho thấy phương pháp có độ lặp lại, độ chấp nhận mẫu có mẫu phức tạp hàm lượng arsen thấp Độ lặp lại phương pháp mẫu khảo sát có RSD 6,2%, khả thu hồi khoảng từ 80,3% đến 105,0%  LOD LOQ: LOD 0,3 ng/ml (75ng/g mẫu) LOQ 0,99 ng/ml (247,5ng/g mẫu) 3.4 Kết kiểm tra số hợp chất bị cấm có giới hạn sử dụng mỹ phẩm lưu hành thị trường 3.4.1 Metanil yellow Quy trình phân tích để phát MY áp dụng để kiểm tra mẫu son mơi mẫu sơn móng mua thị trường Kết phát thấy mẫu sơn móng tay khơng có nhãn mác, địa nhà sản xuất (mẫu MY07) cho pic có thời gian lưu phổ UV-VIS (với hệ số tương đồng so sánh phổ 0,9913) pic MY chuẩn Những kết định tính cho phép kết luận mẫu chứa MY (hình 3.22) Hàm lượng MY mẫu xác định 28,33 µg/g 3.4.2 Rhodamin B: Qui trình xây dựng áp dụng để kiểm tra mẫu son mơi, mẫu sơn móng, mẫu phấn mắt 1mẫu phấn má mua thị trường Trong 18 mẫu kiểm tra có mẫu sơn móng (mẫu số RB09 RB10) mẫu son nước (mẫu RB14) cho pic có thời gian lưu phổ UV-VIS tương ứng với pic chuẩn Rhodamin B, chứng tỏ mẫu có Rhodamin B, kết định lượng mẫu RB14 cho hàm lượng Rhodamin B 20,0 µg/g 3.4.3 Pigment red 53 Áp dụng phương pháp phát Pigment red 53 vừa xây dựng để kiểm tra 14 mẫu son môi, mẫu phấn má mua thị trường Đã phát mẫu có chứa PR, số có mẫu son (PR01, PR11, PR12 PR14) mẫu phấn má (PR15 PR20) Thời gian lưu pic nghi ngờ trùng với thời gian lưu pic PR chuẩn So phổ UV-VIS pic với píc PR chuẩn thu hệ số tương thích phổ (Similarity) cao Tiến hành định lượng PR mẫu này, kết cho thấy hàm lượng PR mẫu son tương đối nhỏ tỷ lệ mẫu phấn má cao, Tuy số mẫu kiểm tra chưa nhiều tỷ lệ có chứa PR đáng lo ngại (30%), chứng tỏ nguy lạm dụng PR mỹ phẩm cao Do cần mở rộng thêm việc kiểm tra PR mỹ phẩm để có kết luận xác 3.4.4 Pigment orange Quy trình phân tích để phát Pigment orange áp dụng để kiểm tra 13 mẫu son mơi, 10 mẫu sơn móng mua thị trường, khơng phát thấy mẫu có Pigment orange 3.4.5 Crystal violet (Tím tinh thể) Áp dụng để kiểm tra mẫu son mơi, mẫu sơn móng, mẫu phấn mắt mẫu phấn má mua thị trường Kết có mẫu phấn mắt (CV05) có chứa Crystal violet 3.4.6 Sudan: Tiến hành kiểm tra Sudan 25 mẫu son, kết cho thấy: có mẫu son có chứa Sudan I mẫu son có chứa Sudan IV, số có mẫu son có chứa loại Sudan 3.4.7 Kiểm tra đồng thời chất mầu bị cấm (MY, PR, PO và RB) Kiểm tra 15 mẫu son thu mua từ chợ Đồng Xuân (12 mẫu son thỏi ký hiệu SR mẫu dạng gel ký hiệu SN) Kết quả: phát mẫu có chất cấm Pigment red 53 3.4.8 Hydroquinon : - 16 - Quy trình thao tác chuẩn để phát Hydroquinon áp dụng để kiểm tra 10 mẫu kem bôi da mua thị trường Kết khơng có mẫu có chứa Hydroquinon 3.4.9 Tretinoin : Đã tiến hành kiểm tra 18 mẫu kem mã số từ TR01 đến TR18, có mẫu phát có Tretinoin TR04 TR05 Hai mẫu TR04 TR05 dạng đóng gói khơng có lơ sản xuất, hạn sử dụng, nơi sản xuất (7 67 đường Trường Chinh, Kiến An, Hải Phịng) có chứa Tretinoin Cách ký hiệu SĐK mẫu kem khác với mẫu khác: số viết trước ký hiệu QLD-CL mẫu khác QLD-CL viết trước, số viết sau khơng có tên nhà sản xuất có tên địa sản xuất 3.4.10 Các glucocorticoid : Kiểm tra 11 mẫu kem mỹ phẩm, phát mẫu GC01, GC05 GC06 có pic có thời gian lưu tương ứng với pic clobetason dipropionat, chồng phổ với phổ chuẩn clobetason dipropionat cho hệ số chồng phổ xấp xỉ (lần lượt 0,9933; 0,9954; 0,9968) 3.4.11 Thủy ngân: Quy trình thao tác chuẩn để phát thủy ngân áp dụng để kiểm tra mẫu kem bôi da, mẫu sữa rửa mặt mẫu dầu gội đầu mua thị trường Trong có mẫu có thủy ngân: HG02 (29,96ppm); HG03 (1,36ppm); HG20 (0,88ppm); HG22 (0,64ppm) HG23 (0,58ppm) 3.4.12 Chì : Áp dụng phương pháp hịa hợp ASEAN để kiểm tra chì 35 mẫu mỹ phẩm có đến 32 mẫu có chứa chì nhiên khơng có mẫu vượt q giới hạn Pb theo qui định thông tư 06/2011/TT-BYT Bộ Y tế Chương IV BÀN LUẬN 4.1 Về việc triển khai phương pháp ASEAN  Về phương pháp ACM THA 05: xác định kim loại nặng (arsen, cadmium, chì thủy ngân) mỹ phẩm Phương pháp hòa hợp ASEAN mã số ACM THA 05 áp dụng để xác định hàm lượng Pb, As thiết bị phân tích AAS Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương đánh giá chuyển giao đạt yêu cầu Q trình thực nghiệm đưa thơng số cụ thể cho điều kiện phân tích nguyên tố Đã viết qui trình phân tích cụ thể cho nguyên tố As, Pb tài liệu chuyên môn phục vụ cho công tác kiểm tra chất lượng mỹ phẩm (Mã số tài liệu Pb: VKN/TQKT-MP/19; As: VKN/TQKT-MP/21) Đã áp dụng quy trình để kiểm tra Pb 40 mẫu mỹ phẩm vài mẫu kiểm tra arsen (không báo cáo luận án), chưa có mẫu vượt giới hạn qui định cao chì (≤ 20 ppm) arsen (≤ 5ppm) Hơn nữa, với phương pháp hóa học theo Dược điển cho độ nhạy 10 ppm (đối với tổng kim loại nặng) 1ppm cho arsen Một câu hỏi đặt ASEAN lại chọn phương pháp AAS, kỹ thuật có độ nhạy cao, thiết bị đắt tiền, điều kiện phịng thí nghiệm đạt độ cao cần phải có cán đào tạo Phải mẫu mỹ phẩm phong phú, phức tạp, khó xử lý, dùng vơ hóa lị vi sóng thực hồn tồn, bảo tồn lượng chì arsen, tránh nhiễm bẩn, phương pháp đo AAS đặc hiệu, độ nhạy cao (ppb) xác Kết thực nghiệm ra, có nhiều mẫu mỹ phẩm vơ hóa đốt bếp điện nhiều thời gian dung dịch thu có màu, làm phép thử so màu cho kết khơng xác, lại cịn phụ thuộc vào đánh giá chủ quan người làm phân tích Vì phương pháp AAS, kỹ thuật ngun tử hóa lị graphit để phân tích chì kỹ thuật hydrid để phân tích arsen cho kết xác tin cậy, độ nhạy cao chọn làm phương pháp hòa hợp chung nước ASEAN Riêng quy trình phân tích thủy ngân phương pháp hịa hợp xây dựng cho thiết bị khơng sẵn có điều kiện sở vật chất Viện, nên phải tiến hành khảo sát, thiết lập quy trình phân tích  Phương pháp ACM SIN 01: định tính Tretinoin mỹ phẩm TLC HPLC Tiến hành thẩm định chuyển giao thiết bị HPLC Viện hoàn toàn phù hợp khả thi Qui trình định tính, định lượng Tretinoin mỹ phẩm HPLC biên soạn thành - 17 - qui trình thao tác chuẩn (SOP) áp dụng để kiểm tra chất cấm Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (Mã số tài liệu VKN/TQKT-MP/09)  Phương pháp ACM INO 03: định tính, định lượng Hydroquinon mỹ phẩm TLC HPLC Khi triển khai phương pháp HPLC mẫu mỹ phẩm nghiên cứu, không tách Hydroquinon khỏi píc có mẫu Vì qui trình phân tích nghiên cứu xây dựng thẩm định nhằm tách hoàn tồn Hydroquinon khỏi pic có mẫu  Phương pháp ACM SIN 02: định tính số chất màu cấm mỹ phẩm TLC HPLC Phương pháp cho phép định tính đồng thời chất màu cấm: Metanil yellow (MY), Pigment orange (PO), Rhodamin B (RB) lợi lớn, nhiên q trình triển khai cho thấy pha động khơng ổn định, có tượng tủa lại cách từ từ (ngay lọc qua màng lọc 0,45µm) Điều nguy hại cho hệ thống sắc ký không loại bỏ được, gây áp suất không ổn định q trình phân tích lâu dài gây tắc cột Vì vậy, qui trình phân tích chất màu nghiên cứu thiết lập Trong thực tế gặp lạm dụng nhiều chất màu cấm sản phẩm nên qui trình phân tích riêng lẻ có tác dụng để kiểm tra có mặt chất màu bị cấm Hơn nữa, thực tế mẫu mỹ phẩm nghiên cứu lại cho thấy xuất với tỷ lệ cao chất màu Kiểm tra phát chất màu Pigment Red 53 (PR) qui trình phân tích phát định lượng PR nghiên cứu xây dựng  Phương pháp ACM MAL 07: định tính hydrocortison acetat, dexamethason, betamethason, betamethason 17-valerat, triamcinolon acetonid mỹ phẩm TLC HPLC Phương pháp cho phép định tính đồng thời chất thuộc nhóm chất bị cấm Glucocorticoid cách dễ dàng với thiết bị TLC HPLC thơng thường Tuy nhiên để định tính, định lượng đồng thời nhiều chất thuộc nhóm steroid, nghiên cứu thực nhằm phát định lượng đồng thời 12 chất steroid HPLC 4.2 Về qui trình phân tích thiết lập Quá trình nghiên cứu thiết lập qui trình phân tích xác định chất cấm chất có giới hạn hàm lượng sử dụng mỹ phẩm hướng tới hịa hợp mặt kỹ thuật với tồn khối ASEAN, nên luận án bám sát phương pháp hịa hợp sẵn có ASEAN Một số trường hợp, chưa có phương pháp hịa hợp hay điều kiện phương pháp hòa hợp tỏ chưa phù hợp sau trình khảo sát sơ bộ, phải tiến hành thiết lập thay đổi điều kiện phân tích cho phù hợp với đối tượng mẫu mỹ phẩm cần kiểm tra điều kiện trang thiết bị có, đặc biệt kịp thời cho cơng tác kiểm tra chất cấm thời điểm cần thiết theo yêu cầu Bộ Y tế thực tế chưa có qui trình phân tích sẵn có (ví dụ Sudan, Pigment red 53, Crystal violet…) 4.2.1 Về các qui trình phát hiện các chất màu cấm: Đối tượng mẫu áp dụng mỹ phẩm dạng son (son thỏi dạng sáp, "son nước" dạng gel ), sơn móng phấn trang điểm cho chất mầu cấm như: MY, PO, PR, CV, Sudan… 4.2.1.1 Các chất màu có phương pháp hịa hợp: Phương pháp hịa hợp ACM SIN 02 đưa quy trình định tính đồng thời chất màu cấm: PO, MY RB phương pháp TLC HPLC Tuy nhiên, thời điểm nghiên cứu triển khai (2009-2010), thực nghiệm cho thấy có tượng tủa lại từ từ thành phần pha động Vì vậy, nghiên cứu qui trình định tính, định lượng riêng chất màu với điều kiện phân tích (như nói trên) nhằm đáp ứng kịp thời cho công tác kiểm nghiệm đồng thời khơng phát mà cịn đánh giá mức độ nhiễm chất cấm Về quy trình xử lý mẫu mỹ phẩm: Phương pháp hòa hợp sử dụng dung môi chiết mẫu hỗn hợp DMF-acid phosphoric (95:5) Dung môi cho kết xử lý mẫu tốt tiến hành phân - 18 - tích MY PO, giữ ngun quy trình phân tích hai chất màu Riêng trường hợp RB, chiết mẫu dung môi kết thu hồi không tốt nên phải khảo sát lại chuyển sang dùng hỗn hợp acetonitril - nước (1:1) Hệ dung môi cho kết cao (tỷ lệ thu hồi từ 83,7% đến 109,7% tùy theo mẫu) Hơn nữa, với mẫu son thỏi (dạng sáp, thể chất quánh) thay chiết pha lỏng - lỏng (n-hexan dung môi chiết mẫu ASEAN), dùng lượng nhỏ tetrahydrofuran hay dimethylformamid để phân tán mẫu chiết cho kết tốt phương pháp ASEAN cách làm đơn giản nhanh hơn, không cần chuyển vào bình gạn chờ phân lớp Về qui trình phân tích sắc ký: Đã khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký phù hợp để phân tích chất định tính định lượng Định tính xét thời gian lưu, độ tinh khiết pic so sánh phổ (chồng phổ tính hệ số tương đồng similary index) píc nghi ngờ mẫu thử với píc thu từ mẫu chuẩn Định lượng so sánh diện tích (hoặc chiều cao) píc thu từ mẫu thử với píc thu từ mẫu chuẩn Về cách đọc kết quả: Sử dụng detector PDA đọc phổ độ tinh khiết pic píc nghi ngờ có thời gian lưu với píc chuẩn (ASEAN khơng nêu rõ mà nói đến thời gian lưu) Như tính đặc hiệu phương pháp khẳng định Về đánh giá qui trình phân tích: Các qui trình xây dựng thẩm định tiêu độ thích hợp hệ thống sắc ký, độ đặc hiệu, khoảng nồng độ tuyến tính, độ xác, độ đúng, LOD LOQ mẫu tự tạo với mẫu mỹ phẩm khơng có chất cấm Qua thẩm định thực nghiệm, quy trình phân tích đáp ứng yêu cầu kiểm tra chất màu cấm tương ứng Hơn nữa, quy trình thiết lập có giới hạn phát tốt so với cơng bố phương pháp hịa hợp ACM SIN 02 với đối tượng chất màu mà phương pháp đưa giới hạn phát (ví dụ với MY PO giới hạn phát nhỏ 25 lần, với RB giới hạn phát nhỏ 1000 lần so với công bố ASEAN) 4.2.1.2 Các chất màu chưa có phương pháp hịa hợp: Pigment red 53 (PR), Crystal violet (CV) chất thuộc nhóm Sudan chưa có phương pháp hịa hợp ASEAN, phải xây dựng hồn tồn quy trình phân tích cho chất màu Về quy trình xử lý mẫu mỹ phẩm: Tùy theo chất mà lựa chọn dung môi chiết mẫu phù hợp, với mẫu son thỏi (dạng sáp) hay sơn móng, dùng lượng nhỏ tetrahydrofuran hay dimethylformamid vừa đủ phân tán mẫu chiết cho kết tốt (tỷ lệ thu hồi cao trình thẩm định từ 83,7% đến 109,7% ), cách làm đơn giản, tránh thất khơng phải qua nhiều bước xử lý Với Pigment red 53 chất khó tan nước, dùng dimethylsulfoxid hịa tan chiết hoàn toàn chất này, mẫu Với Crystal violet (CV), h ỗn hợp acetonitril dung dịch đệm amoniac pH 9,5 - 10,0 (2 : 5) dung môi chiết mẫu tốt lựa chọn Khi khảo sát thử với môi trường acid hay kiềm mạnh (NaOH 0,01M) cho píc khơng cân đối không ổn định Hơn nữa, dung môi chiết mẫu có thành phần giống với pha động (ACN - THF - đệm pH 9,0 (20:30:50)) nên pic sắc ký thu cân đối, ổn định, cho kết lặp lại, độ tốt điều phù hợp Đây nguyên tắc lựa chọn dung môi pha mẫu Với Sudan, hệ dung môi methanol – ethyl acetat (1:1) hệ mà nhóm chất Sudan tan tốt, dung dịch mẫu thử không bị lẫn nhiều tạp chất, qui trình chiết đơn giản, dễ dàng Hệ dung mơi có ethyl acetat nên khơng cần dùng chất THF để phân tán mẫu son dạng sáp hay sơn móng Đây dung mơi mà tác giả Nguyễn Văn Yên cộng lựa chọn (năm 2010, sau kết nghiên cứu năm) để hòa tan sudan cắn thu sau chiết mẫu mỹ phẩm thực phẩm aceton sau tiêm vào hệ sắc ký Về điều kiện phân tích sắc ký: Để phân tích PR, cần thay đổi tỷ lệ thành phần pha động điều kiện phân tích PO hỗn hợp methanol-dung dịch đệm pH 6,2 từ tỷ lệ 85:15 thành 65:35 Kết thuận lợi cho người làm phân tích: gần với điều kiện phân tích cột sắc ký, nhiệt độ cột, pha động, tốc độ dòng, cần thay đổi tỷ lệ thành phần pha động - 19 - bước sóng lấy sắc ký đồ định tính, định lượng chất màu: MY, PO PR Kết khảo sát cho thấy, thành phần dung môi thông thường, dễ kiếm: methanol dung dịch đệm pH 6,2 (chuẩn bị dung dịch triethylamin 3mM nước, chỉnh pH 6,2 acid acetic 30%), pha động ASEAN chuẩn bị phức tạp, dùng chất tạo cặp ion đắt tiền (TBA) Với Crystal violet (CV): lựa chọn cột Alltech RP18 (250x 4,6 mm, µm) cột C18 Phenomenex nhiệt độ phòng, detector PDA đặt dải 300 - 900 nm (lấy sắc đồ 590 nm), pha động: hỗn hợp acetonitril – tetrahydrofuran – dung dịch đệm pH 9,0 (20:30:50), tốc độ dịng: 1,0 ml/phút, thể tích tiêm mẫu: 100 µl Điều kiện phân tích cho thấy pha động có thành phần gần dung mơi pha mẫu, píc thu cân đối, có độ lặp lại độ cao, hệ sắc ký ổn định Qui trình phân tích đồng thời chất Sudan với điều kiện phân tích đơn giản, dễ thực hiện, dung mơi hóa chất dễ kiếm, dễ dàng áp dụng đơn vị có máy HPLC với detector PDA Điều kiện phân tích bao gồm: cột C18 (250 x 4,6 mm, µm) (Phenomenex Apollo), pha động: methanol – nước (95:5), tốc độ dịng: 1,0 ml/phút, thể tích tiêm: 20 µl, lấy sắc đồ 488 nm  Về đánh giá quy trình phân tích: Các quy trình phân tích thẩm định chặt chẽ cho kết tốt độ thích hợp hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng, LOD, LOQ (và độ ổn định dung dịch chất màu Sudan), đáp ứng yêu cầu kiểm tra chất màu cấm tương ứng Hơn nữa, quy trình thiết lập phân tích chất màu cấm chưa có phương pháp hịa hợp (PR, CV chất Sudan) có giới hạn phát thấp: PR 0,4µg/ml (tương ứng 80µg/g mẫu); CV 0,04 µg/ml (tương ứng 2µg/g mẫu), Sudan (µg/ml): Sudan I: 0,23, Sudan II: 0,24, Sudan III: 0,25 Sudan IV: 0,24 cho phép phát chất bị cấm son, sơn móng, phấn trang điểm nồng độ nhỏ (ppm) 4.2.1.3 Về qui trình phân tích phát định lượng đồng thời chất màu: Qui trình cải tiến từ qui trình phân tích đồng thời MY, PO, RB ASEAN đưa thêm PR phân tích đồng thời với chất màu MY, PO RB  Về xử lý mẫu mỹ phẩm: Dùng phương pháp chiết lỏng-lỏng dung môi pha mẫu với nhexan qui trình ASEAN đưa phát chất màu MY, PO RB  Về điều kiện phân tích sắc ký: Đây qui trình phân tích dựa qui trình phân tích đồng thời MY, PO, RB ASEAN, nhiên, nghiên cứu cụ thể thời gian, cách thức để pha động tủa hoàn toàn (để lạnh 14-15oC 72 mà ASEAN nêu để yên vài ) lọc trước đưa vào hệ thống sắc ký, đảm bảo ổn định toàn hệ thống trình sắc ký khơng hại cột Hơn nữa, đưa thêm Pigment red 53 phân tích đồng thời với chất màu qui trình ASEAN  Về đánh giá qui trình: Qui trình đánh giá đầy đủ tiêu độ thích hợp hệ thống (các pic cân đối, tách rời hoàn toàn với R s nhỏ 2,2, số đĩa lý thuyết thấp 2592) Kết qui trình phân tích có độ lặp lại tốt cho chất màu cấm (RSD thời gian lưu nhỏ 1%, RSD diện tích pic nhỏ 2%), độ cao (tỷ lệ thu hồi từ 94,0% đến 101,5%) LOD LOQ thấp ASEAN nhiều lần (MY 100 lần, PR 200 lần; PO 2000 lần ) nên phương pháp có độ nhạy tốt Qui trình vừa để định tính (phát hiện) thơng qua số: độ tinh khiết píc, so sánh thời gian lưu chồng phổ píc nghi ngờ với píc chất chuẩn Qui trình dùng để định lượng cách so sánh diện tích píc píc thu từ mẫu thử với píc thu từ mẫu chuẩn Đây lợi lớn phân tích, ngồi việc phát đánh giá mức độ lạm dụng nguy hiểm, thể thành công việc triển khai cải tiến qui trình sẵn có ASEAN 4.2.2 Về qui trình định tính, định lượng Hydroquinon  Về xử lý mẫu: Sau khảo sát số dung mơi hồ tan mẫu, chúng tơi lựa chọn hỗn hợp methanol - đệm phosphat pH 5,5 (50:50) dung môi tốt để chiết mẫu, dung dịch mẫu thử không bị lẫn nhiều tạp chất cho pic Hydroquinon cân đối Hơn nữa, - 20 - pha động chương trình sắc ký để phân tích Hydroquinon khảo sát lựa chọn (Phương pháp hòa hợp ACM INO 03 dùng ethanol 96% để chiết mẫu)  Về điều kiện phân tích sắc ký: Đã tiến hành khảo sát thực nghiệm điều kiện sắc ký phương pháp hòa hợp ACM INO 03 đưa Tuy nhiên, kết thu cho thấy với đối tượng mẫu khảo sát sơ bộ, điều kiện phương pháp hòa hợp chưa đáp ứng yêu cầu cho phép phát chọn lọc Hydroquinon (do pic chất không tách khỏi mẫu) Thực tế cho thấy, pha động phương pháp hịa hợp ASEAN có ACN nước (45 : 55) khả rửa giải, phân tách chất hạn chế kể thay đổi tỷ lệ khác dung môi Vì vậy, nghiên cứu thay pha động hỗn hợp ACN dung dịch đệm phosphat pH 5,5 với tỷ lệ thích hợp Chính dung dịch đệm làm thay đổi rõ rệt tính phân cực pha động, tương tác chất phân tích với pha động, kết píc Hydroquinon tách hồn tồn khỏi píc có mẫu kem khảo sát Tuy nhiên, với mẫu kem đơn giản, áp dụng quy trình phân tích ASEAN cho kết tốt, thời gian phân tích nhanh Thực tế, khoa Mỹ phẩm - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương nhiều lần tham gia có kết tốt chương trình thử nghiệm thành thạo phép thử “Xác định hàm lượng Hydroquinon kem bôi da” theo quy trình phân tích ASEAN, mẫu chương trình gửi tới  Về đánh giá qui trình phân tích: Những kết thẩm định (độ đặc hiệu cao, độ lặp lại, độ tốt, LOD, LOQ thấp so với phương pháp ASEAN) cho thấy quy trình xây dựng thích hợp cho việc phát hiện, định lượng Hydroquinon đối tượng mỹ phẩm dạng kem bơi da mẫu có chất rửa giải gần với Hydroquinon dùng chương trình sắc ký phương pháp hịa hợp ASEAN khơng tách 4.2.3 Về qui trình định tính 12 chất steroid kem bơi da Về qui trình xử lý mẫu: Phương pháp hòa hợp ASEAN mã số ACM/MAL 07 để định tính chất thuộc nhóm steroid dùng methanol làm dung môi chiết chất phân tích từ mẫu kem bơi da Tuy nhiên, qua khảo sát số chất thuộc 12 steroid nghiên cứu cho pic khơng cân đối, số mẫu có nhiều tạp phân tích sắc ký Vì vậy, chọn hỗn hợp dung môi dicloromethan-methanol (9:1) để chiết mẫu đặt cách thủy Sau đó, thay ly tâm, để lạnh nước đá để tủa tá dược, lọc bốc cách thủy tới cắn hòa tan cắn acetonitril - methanol - nước (20:30:30), lọc Với cách xử lý mẫu này, pic thu cân đối, mẫu phân tích (ít xuất píc phụ) Về điều kiện sắc ký: Giữ nguyên điều kiện cột sắc ký (ODS 250 x 4,6 mm, 5µm) Pha động ACN – nước (48:52) chạy đẳng dòng (ASEAN chạy gradient dung mơi) Bám sát qui trình phân tích ASEAN, nghiên cứu bổ sung thêm chất khác thuộc nhóm glucocorticoid, xây dựng qui trình định tính đồng thời 12 chất steroid có bao gồm chất phương pháp hòa hợp ASEAN Về đánh giá qui trình phân tích: Kết đánh giá độ thích hợp hệ thống (RSD thời gian lưu, diện tích pic; hệ số phân giải R s; số đĩa lý thuyết ), độ đặc hiệu độ ổn định dung dịch đảm bảo yêu cầu để phân tích phát đồng thời chất mỹ phẩm dạng kem bôi da Qui trình phân tích chạy đẳng dịng đơn giản áp dụng máy phân tích có bơm, kênh dung môi 4.2.4 Về qui trình phân tích thủy ngân mỹ phẩm dạng kem và phấn bôi da Các điều kiện xử lý mẫu quy định phương pháp hòa hợp ASEAN mã số ACM THA 05 cho kết tốt khảo sát thực nghiệm với đối tượng mẫu kem bôi da, sữa rửa mặt dầu gội đầu Do áp dụng nguyên vẹn điều kiện tác nhân oxy hóa, lượng cân mẫu phương pháp hịa hợp ASEAN xây dựng phương pháp kiểm tra thủy ngân mỹ phẩm dạng kem Với mẫu phấn bôi da, khảo sát lựa chọn hỗn hợp acid sulfuric acid nitric tỷ lệ 1:1, vô hóa triệt để mẫu phấn có chứa nhiều ngun liệu từ khống vật Bên cạnh đó, cụ thể hóa thơng số thiết bị vơ hóa mẫu vi sóng, bổ sung - 21 - thêm giai đoạn xử lý mẫu để phù hợp với điều kiện thiết bị đơn vị nghiên cứu Quy trình phân tích thủy ngân phương pháp hòa hợp xây dựng cho thiết bị đo dịng liên tục (khơng sẵn có điều kiện sở nghiên cứu), tiến hành khảo sát, thiết lập quy trình phân tích phù hợp với thiết bị đo gián đoạn tổng lượng thủy ngân Kết thẩm định quy trình sau xây dựng cho thấy quy trình thiết lập đảm bảo độ đặc hiệu, độ đúng, độ lặp lại, có khoảng tuyến tính phù hợp với đối tượng áp dụng, đồng thời có giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng hoàn toàn đáp ứng yêu cầu phương pháp hòa hợp ASEAN yêu cầu quản lý qui định Thông tư 06/2011/TT-BYT ngày 25/1/2011 Bộ Y tế Việt Nam (Qui định giới hạn thủy ngân mẫu mỹ phẩm cho phép ≤ ppm, phương pháp chúng tơi xây dựng có giới hạn phát 30ng, giới hạn định lượng 100ng thủy ngân mẫu phân tích tương ứng với 0,5 ppm mẫu mỹ phẩm) Tóm lại: Có thể thấy trình đánh giá thực nghiệm phương pháp hịa hợp sẵn có ASEAN liên quan tới 12 đối tượng chất cấm, chất cần kiểm soát hàm lượng mà đề tài nghiên cứu, cho thấy phương pháp bộc lộ nhiều hạn chế, không thật khả thi thực tế với điều kiện trang thiết bị đơn vị nghiên cứu Trong 12 đối tượng chất cấm, chất cần kiểm soát hàm lượng mà đề tài nghiên cứu, có đối tượng áp dụng phương pháp hịa hợp sẵn có ASEAN, cịn lại phải thiết lập quy trình phân tích Tuy nhiên, tận dụng từ phương pháp hịa hợp sẵn có số điều kiện xử lý mẫu để phân tích thủy ngân, dung mơi chiết mẫu để phát Metanil yellow Pigment orange Ngoài ra, toàn điều kiện xử lý mẫu cho đối tượng nghiên cứu khác, toàn quy trình phân tích AAS HPLC, phải khảo sát, xây dựng cho phù hợp Những quy trình thiết lập thẩm định cách chu đáo, đảm bảo độ đặc hiệu, độ đúng, độ lặp lại, đồng thời có giới hạn phát thấp so với giới hạn tương ứng đưa phương pháp hòa hợp ASEAN (trong trường hợp có giới hạn cơng bố phương pháp hòa hợp) 4.3 Về khả áp dụng qui trình Trong năm vừa xây dựng qui trình, vừa áp dụng kiểm tra 12 chất nhóm chất cấm hay bị giới hạn hàm lượng sử dụng nghiên cứu, 230 lượt mẫu mỹ phẩm kiểm tra Kết cho thấy nhiều mẫu mỹ phẩm khác dạng sản phẩm nghiên cứu (son môi, phấn bôi da, phấn mắt, kem bôi da, dầu gội đầu, sữa rửa mặt), chất cấm phát nồng độ nhỏ Các qui trình phân tích ổn định, dùng cột phân tích có chất pha tĩnh, kích thước hạt hãng khác tiến hành phân tích nhiệt độ phịng (25-30 oC) Ngồi việc kiểm tra tính thích hợp hệ thống, độ lặp lại lần phân tích, để khẳng định tính chắn, thêm lượng chuẩn biết vào mẫu nghi ngờ để phân tích đánh giá (như đánh giá độ đúng) Đây yêu cầu kiểm tra đánh giá tính ổn định, khả thi qui trình phân tích theo tiêu chuẩn ISO 17025 (đánh giá thường xun) Các qui trình phân tích HPLC xây dựng có điều kiện xử lý mẫu, phân tích sắc ký khơng q phức tạp, cột sắc ký loại phổ biến, dung môi thông dụng, không đắt, dễ dàng áp dụng sở có máy phân tích HPLC Tuy nhiên, địi hỏi người làm phân tích phải đào tạo lý thuyết, thực hành, cách đọc kết phương pháp HPLC Các qui trình phân tích AAS địi hỏi thiết bị đắt tiền, dung mơi hóa chất có độ tinh khiết cao, môi trường, dụng cụ phân tích đạt độ cao, người làm phân tích cần đào tạo cơng phu Các điều kiện phân tích hai qui trình phân tích As, Pb ASEAN phù hợp, nên luận án cụ thể hóa thơng số máy phân tích, hồn tồn áp dụng sở phân tích có máy AAS thực cán đào tạo Thực tế với giới hạn cao chì arsen (không 20 ppm ppm) theo qui định thơng tư 06/2011/TT-BYT Bộ Y tế, làm phương pháp hóa học, nhiên cần khảo sát lựa chọn điều kiện vơ hóa phù hợp để rút ngắn thời gian vơ hóa mẫu phương pháp đốt nên áp dụng phương pháp - 22 - mang tính sàng lọc, với mẫu mà mẫu có màu sau vơ hóa cần chuyển sang phương pháp AAS để đảm bảo có kết xác Riêng với qui trình phân tích thủy ngân thiết lập hồn tồn phù hợp đáp ứng kịp thời cho công tác kiểm tra chất lượng hậu mại mỹ phẩm Viện Kiểm nghiêm thuốc Trung ương đơn vị có thiết bị AAS với phân tích thủy ngân đo tổng lượng, gián đoạn 4.4 Về tình hình nhiễm chất cấm mỹ phẩm Hơn 230 mẫu mỹ phẩm thuộc nhóm sản phẩm khác nhau, có tới 30 mẫu, chiếm 13,04% số mẫu khảo sát, bị phát có chứa chất kiểm tra Trong số chất nhóm chất màu cấm kiểm tra có chất nhóm chất màu cấm phát (trừ Pigment orange 5) Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng pha đảo với detector PDA để xác định chất màu nhóm Sudan 25 mẫu son mơi, phát mẫu có Sudan (năm 2007) Trong 20 mẫu son phấn kiểm tra có mẫu có chứa Pigment red 53, đặc biệt có mẫu hàm lượng lên đến 4% Trong mẫu son môi mẫu sơn móng tay có mẫu sơn móng tay có chứa Metanil yellow với hàm lượng 28,33 mg/g Trong 18 mẫu kiểm tra gồm: phấn, sơn móng, son nước, son thỏi có mẫu sơn móng mẫu son nước có chứa Rhodamin B, đặc biệt mẫu son nước hàm lượng lên đến 20mg/g Phát thấy chất nhóm chất có tác dụng dược lý mà bị cấm có giới hạn sử dụng (trừ Hydroquinon), có 3/15 mẫu kiểm tra có corticoid, có 2/18 mẫu kem bơi da khảo sát có chứa Tretioin Trong số nguyên tố độc kiểm tra (As, Pb, Hg), có 2/18 mẫu bị nhiễm thủy ngân, đặc biệt có mẫu thủy ngân vượt giới hạn cho phép 30 lần Những kết nghiên cứu ban đầu cho thấy nguy lạm dụng chất cấm mỹ phẩm tiềm tàng, chất cấm bị lạm dụng đa dạng Chương V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã thẩm định chuyển giao thành cơng phương pháp hịa hợp ASEAN để phát định lượng chì, arsen Tretinoin Kết đưa thơng số phân tích cụ thể điều kiện xử lý mẫu, thông số thiết bị phân tích Kết phương pháp hịa hợp hồn tồn phù hợp triển khai Việt Nam với trang thiết bị sẵn có cán đào tạo phương pháp phân tích HPLC quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS Đã xây dựng 10 quy trình phân tích, có quy trình phân tích đồng thời quy trình phân tích chất riêng biệt, cụ thể sau: - Quy trình phân tích phát hiện, định lượng đồng thời chất màu bị cấm (Metanil yellow, Rhodamin B, Pigment red 53, Pigment orange 5) son môi sơn móng phương pháp HPLC với detector PDA - Quy trình phân tích phát hiện, định lượng đồng thời chất màu thuộc nhóm Sudan (Sudan I, II, III, IV) son mơi sơn móng phương pháp HPLC với detector PDA - Quy trình phân tích phát đồng thời 12 chất màu bị cấm thuộc nhóm steroid kem bôi da phương pháp HPLC với detector PDA - Quy trình phân tích phát hiện, định lượng chất màu Metanil yellow son mơi, sơn móng phương pháp HPLC với detector PDA - Quy trình phân tích phát hiện, định lượng chất màu Rhodamin B son mơi, sơn móng, phấn mắt, phấn má phương pháp HPLC với detector PDA - Quy trình phân tích phát hiện, định lượng chất màu Pigment red 53 son mơi, sơn móng, phấn má phương pháp HPLC với detector PDA - Quy trình phân tích phát hiện, định lượng chất màu Pigment orange son môi, sơn móng phương pháp HPLC với detector PDA - Quy trình phân tích phát hiện, định lượng chất màu Crystal violet son mơi, sơn móng phương pháp HPLC với detector PDA - Quy trình phân tích để phát hiện, định lượng Hydroquinon kem bôi da phương pháp HPLC với detector PDA - Quy trình phân tích phát hiện, định lượng thủy ngân kem bơi da, sữa rửa mặt, dầu gội đầu, phấn trang điểm phương pháp AAS với kỹ thuật hóa lạnh - 23 - Những quy trình đánh giá độ thích hợp hệ thống sắc ký, độ đặc hiệu, độ đúng, độ lặp lại, giới hạn phát hiện, định lượng, khoảng tuyến tính Kết đánh giá phương pháp cho thấy phương pháp có độ đặc hiệu cao, độ lặp lại độ đạt yêu cầu, đảm bảo phù hợp với việc áp dụng kiểm tra chất cấm, chất cần kiểm soát hàm lượng mỹ phẩm mức nồng độ nhỏ Giới hạn phát quy trình thiết lập đáp ứng yêu cầu giới hạn phát đưa phương pháp hịa hợp có ASEAN Một số phương pháp phân tích có độ nhạy tốt so với phương pháp phân tích chất cấm tương ứng mà ASEAN đưa nhiều lần Đã có 11/13 quy trình phân tích phê duyệt áp dụng thực tế để kiểm tra chất cấm cách kịp thời, phục vụ cho công tác quản lý chất lượng mỹ phẩm, quy trình chờ phê duyệt Đã kiểm tra 12 chất nhóm chất tương ứng 230 lượt mẫu mỹ phẩm, phát thấy khoảng 13% số mỹ phẩm bị nhiễm chất cấm hay có giới hạn hàm lượng như: Metanil yellow, Rhodamin B, Pigment red 53, Crystal violet, Sudan, thủy ngân, chì, số corticoid Đặc biệt có mẫu mỹ phẩm có chứa thủy ngân Pigment red 53 nhiều giới hạn cho phép nhiều lần Đã triển khai khóa đào tạo kỹ thuật cho trung tâm Kiểm nghiệm hệ thống kiểm nghiệm nước kiểm tra chất cấm mỹ phẩm Kiến nghị - Cần trọng nâng cao lực cho hệ thống kiểm nghiệm (tăng cường trang thiết bị, dung mơi, hóa chất, chất chuẩn ), nâng cao nhận thức cho viên chức làm kiểm nghiệm mỹ phẩm quản lý thị trường - Song song với triển khai phương pháp hòa hợp thẩm định cần triển khai nhiều phương pháp mới, đơn giản đủ độ tin cậy để áp dụng tất Trung tâm kiểm nghiệm tỉnh thành nhằm triển khai công tác kiểm tra giám sát chất lượng mỹ phẩm cách kịp thời toàn quốc đáp ứng yêu cầu kiểm nghiệm mỹ phẩm nước khu vực, góp phần bổ sung phương pháp hịa hợp khu vực (vì danh sách chất bị cấm hay giới hạn hàm lượng mỹ phẩm lớn) - Cần thiết phải tăng cường kiểm tra giám sát hậu mại nhóm chất cấm, chất có giới hạn nồng độ, hàm lượng sử dụng mỹ phẩm đảm bảo an tồn cho người sử dụng, góp phần vào công tác quản lý chất lượng mỹ phẩm ngày đòi hỏi cao phù hợp với xu hướng hội nhập quốc tế - Bên cạnh mở rộng kênh để thu thập thông tin phản ứng có hại mỹ phẩm bên cạnh phản ứng có hại thuốc Trên sở bổ sung thêm đối tượng chất cấm cần nghiên cứu Trước mắt tập trung vào hợp chất có nguy bị lạm dụng cao - 24 - ... 0,75; 0,77; 0,76 0,76 µg/ml - 10 - 3.1.7 Định tính, định lượng đồng thời chất mầu bị cấm (MY, PO, PR và RB) 3.1.7.1 Xử lý chuẩn bị mẫu: Đối tượng nghiên cứu chất Metanil yellow (MY), Pigment... liệu thiết bị: - Chất đới chiếu: có nguồn gốc, lơ, hạn sử dụng rõ ràng (Phần lớn hãng Merck, Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương, Hàn quốc) - Dung mơi hóa chất: dung mơi sử dụng đạt tinh khiết... III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết xây dựng qui trình phân tích số hợp chất bị cấm sử dụng mỹ phẩm 3.1.1 Metanil yellow 3.1.1.1 Xử lý chuẩn bị mẫu: Đối tượng mẫu mỹ phẩm nghiên cứu áp dụng với Metanil