Tách dòng và biểu hiện gen chil 6 trong tế bào vi khuẩn e coli

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - NGUYỄN THY NGỌC TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN chIL-6 TRONG TẾ BÀO VI KHUẨN E.coli LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Hà Nội tháng 9/2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - NGUYỄN THY NGỌC TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN chIL-6 TRONG TẾ BÀO VI KHUẨN E.coli LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Chuyên ngành: Công nghệ sinh học NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : PGS.TS Phạm Việt Cường PGS.TS Khuất Hữu Thanh Hà Nội 9/2011 Nguyễn Thy Ngọc Luận văn tốt nghiệp MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN T 3T LỜI CẢM ƠN T 3T DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN T T MỞ ĐẦU T 3T A - Lý chọn đề tài T 3T B - Mục tiêu nghiên cứu luận văn: T T C - Nội dung nghiên cứu luận văn: T T PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU T T 1.1 Tổng quan Interleukin-6: T T 1.1.1 Nguồn gốc IL-6: T T 1.1.2 Lịch sử phát IL-6: 10 T T 1.1.3 Hoạt tính sinh học IL-6: 12 T T 1.1.4 Vai trò IL-6 đáp ứng miễn dịch: 16 T T 1.1.5 Cấu trúc IL-6 18 T 3T 1.2 Tình hình nghiên cứu gen chIL-6 Việt Nam giới: 21 T T 1.2.1 Tình hình nghiên cứu IL-6 giới 21 T T 1.2.2 Tình hình nghiên cứu IL-6 Việt Nam: 22 T T PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23 T T 2.1 Vật liệu 23 T 3T 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu : 23 T T 2.1.2 Hóa chất: 24 T 3T 2.1.3 Máy móc thiết bị: 25 T 3T 2.2 Phương pháp nghiên cứu: 26 T T 2.2.1 Tách chiết RNA tổng số từ mô lách gà 26 T T 2.2.2 Phương pháp xác định nồng độ quang phổ kế 27 T T 2.2.3.Phương pháp RT – PCR 28 T T 2.2.4 Khuếch đại đoạn gen phản ứng PCR 29 T T 2.2.5 Phương pháp tách chiết DNA plasmid 30 T T 2.2.6 Phương pháp cắt, nối DNA enzym giới hạn 30 T T Nguyễn Thy Ngọc Luận văn tốt nghiệp 2.2.7 Phương pháp chuẩn bị tế bào khả biến 31 T T 2.2.8 Phương pháp biến nạp vào E coli sốc nhiệt 32 T T 2.2.9 Phương pháp điện di gel agar 1% 32 T T 2.2.10 Phương pháp thu đoạn DNA từ gel agar (thôi gel) 33 T T 2.2.11 Phương pháp điện di protein SDS – PAGE 34 T T 2.2.12 Xác định Protein nội bào hay ngoại bào 36 T T 2.2.13 Xác định trạng thái Protein (hòa tan hay khơng hịa tan) 36 T T PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 T T A- KẾT QUẢ TÁCH DÒNG chIL-6: 38 T T 3.1 Kết tách chiết RNA tổng số 38 T T 3.2 Kết tạo cDNA chIL-6 phản ứng RT-PCR: 39 T T 3.3 Phản ứng gắn sản phẩm RT-PCR vào vector pCR®2.1 40 T P P T 3.4 Tách chiết plasmid tái tổ hợp 42 T T 3.5 Kiểm tra vector tái tổ hợp cách cắt với enzym giới hạn EcoRI 43 T T 3.6 Kết xác định trình tự gen chIL-6 gà 45 T T 3.7 So sánh trình tự gen trình tự axit amin chIL-6 phân lập Việt Nam T trình tự cơng bố 46 3T B- BIỂU HIỆN GEN chIL-6 TRONG VI KHUẨN E.Coli 47 T T 3.8 Kết đồng hoá mã chIL-6 phù hợp E coli 47 T T 3.9 Kết thiết kế mồi thích hợp để gắn gen chIL-6 vào vector biểu hiện: 50 T T 3.10 Thiết kế vector biểu pGS-21a-chIL-6 52 T T 3.11.Biến nạp vào tế bào E.coli BL21 (DE3 star): 54 T T 3.12 Kết biểu pGS-21a-chIL-6 : 55 T T 3.13 Xác định trạng thái hòa tan protein: 56 T T 3.14 Nghiên cứu khảo sát số yếu tố điều kiện biểu cảm ứng: 58 T T PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61 T T 4.1 Kết luận: 61 T 3T 4.2 Kiến nghị hướng phát triển đề tài: 61 T T TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 T 3T PHỤ LỤC 65 T 3T Nguyễn Thy Ngọc Luận văn tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận văn tốt nghiệp “Tách dòng biểu gen chIL-6 vi khuẩn E.coli” kết nghiên cứu tôi, thực hướng dẫn khoa học PGS.TS Phạm Việt Cường (phòng Các chất chức sinh học - Viện Công nghệ sinh học PGS.TS Khuất Hữu Thanh (Trung tâm nghiên cứu phát triển Công nghệ sinh học, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội) Nội dung luận văn có tham khảo sử dụng tài liệu, thông tin đăng tải tác phẩm, tạp chí trang web theo danh mục tài liệu tham khảo luận văn Tác giả Nguyễn Thy Ngọc Nguyễn Thy Ngọc Luận văn tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS TS Phạm Việt Cường (phòng Các chất chức sinh học - Viện Công nghệ sinh học), PGS.TS Khuất Hữu Thanh (Trung tâm nghiên cứu phát triển Công nghệ sinh học, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội) hướng dẫn tận tình, chu đáo dìu dắt tơi q suốt q trình nghiên cứu thực đề tài Tơi xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Nguyễn Thị Kim Cúc, Th.S Vũ Thị Thu Huyền cán Phòng Các chất chức sinh học - Viện Công nghệ sinh học có góp ý quý báu cho tơi q trình thực đề tài Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè quan tâm, ủng hộ động viên suốt q trình nghiên cứu, giúp tơi hồn thành tốt khóa luận Do điều kiện, khả thời gian thực có giới hạn nên đề tài khơng thể tránh khỏi sai sót Tơi mong nhận đóng góp thầy bạn để đề tài tơi hồn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2011 Học viên thực NGUYỄN THY NGỌC Nguyễn Thy Ngọc Luận văn tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN Amp Ampicillin a.a Axit amin CLT Lymphô bào T gây độc tế bào DNA Deoxyribonucleotid Acid DEPC Diethylpyrocarbonat dNTP Deoxyribonucleotid 5’-triphosphates EtBr Ethidium bromide EDTA Ethylen diamine tetraacetic acid IFN Interferon IL Interleukin kb Kilo base kDa Kilo Dalton mRNA messenger RNA OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction Primer F Mồi xuôi Primer R Mồi ngược RE Enzym cắt giới hạn RNA Ribonucleotid Acid RNase Ribonuclease SDS Sodium dodecyl sulphate Sol Solution TAE Tris-Acetate-EDTA Nguyễn Thy Ngọc Luận văn tốt nghiệp DANH MỤC ẢNH KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Trang Hình 3.1: Kết tách chiết RNA tổng số từ máu gà 39 Hình 3.2: Điện di đồ sản phẩm PCR gel agar 1% 41 Hình 3.3: Các khuẩn lạc E.coli sau biến nạp mơi trường chọn lọc 42 Hình 3.4: Kết tách chiết Plasmid 44 Hình 3.5: Kết điện di kiểm tra sản phẩm cắt EcoRI 45 Hình 3.6: Kết tinh plasmid mang gen IL-6 46 Hình 3.7 Hệ số thích ứng codon CAI (Codon Adaptation Index) gen chIL-6 trước sau tối ưu hố 52 Hình 3.8: Kết điện di sản phẩm PCR 54 Hình 3.9: Ảnh điện di sản phẩm cắt vector pGS-21a sản phẩm PCR sau cắt enzym giới hạn Nco I Xho I 55 Hình 3.10: Ảnh điện di cắt kiểm tra plasmid pGS-21a-chIL-6 57 Hình 3.11: Điện di đồ SDS - PAGE protein biểu 58 Hình 3.12: Điện di đồ SDS-PAGE xác định trạng thái hòa tan protein 59 Hình 3.13: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng IPTG lên kết biểu protein tái tổ hợp 61 Hình 3.14: Khảo sát ảnh hưởng nhiêt độ lên kết biểu protein tái tổ hợp 62 Nguyễn Thy Ngọc Luận văn tốt nghiệp MỞ ĐẦU A - Lý chọn đề tài Cùng với gia tăng nhu cầu tiêu thụ sản phẩm thực phẩm gia cầm an tồn việc phát phòng trừ bệnh dịch gia cầm thách thức lớn Công nghiệp sản xuất thực phẩm Nhiều nhân tố gây bệnh gà xâm nhập vào thể vật chủ thông qua hệ thống đường ruột Để giải vấn đề cần có giải pháp tổng thể mang tính chiến lược việc phịng trừ nhân tố gây bệnh gia cầm dựa việc nghiên cứu tác động qua lại vật chủ - tác nhân gây bệnh Hiện nay, người ta nghiên cứu ứng dụng phương pháp sinh học phân tử, miễn dịch học việc phát hiện, điều trị phòng chống bệnh gia cầm nói chung gà nói riêng Trong hai thập kỉ gần đây, nhiều nghiên cứu ứng dụng thử nghiệm tác dụng kích ứng miễn dịch liệu pháp điều trị cytokin trọng, ví dụ: - Ứng dụng sản phẩm nguyên thể protein cytokin - Sản xuất vector tái tổ hợp để sản xuất chế phẩm ứng dụng - Nghiên cứu phát triển hệ thống vector tái tổ hợp phù hợp mang gen cytokin (đơn đa gen) đưa trực tiếp vào thể sử dụng chế phẩm hỗ trợ miễn dịch Cytokin phân tử protein tín hiệu nhỏ tế bào, tiết tế bào thần kinh đệm hệ thống thần kinh hệ thống miễn dịch, đóng vai trị quan trọng q trình thơng tin nội bào IL-6 cytokin đa chức năng, có vai trị quan trọng điều hồ miễn dịch q trình nhiễm virut cấp IL-6 sản xuất đường tái tổ hợp, tinh sản phẩm đưa vào thể để tăng cường miễn dịch, tốn đòi hỏi phương thức sử dụng đường tiêm, phức tạp, đặc biệt cho đối tượng gia cầm Do hướng nghiên cứu tập trung vào chọn lọc, phân lập gen IL-6, tái tổ hợp vào vector để đưa vector vào thể gia cầm, đặc biệt sử dụng loại vector cho uống / ăn / đường tiêu hóa / hơ hấp / niêm mạc lợi cơng nghệ nhân lên hàng chục lần, đặc biệt cho gia cầm nuôi mật độ đông Nguyễn Thy Ngọc Luận văn tốt nghiệp Với mục tiêu thử nghiệm sản xuất tinh lượng lớn protein interleukin gà (chIL-6) tinh khiết, chúng tơi tiến hành q trình thu nhận gen interleukin gà (chIL-6) tiến hành chuyển nạp vào vector biểu biểu gen hệ thống E.coli Để thực mục tiêu này, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tách dòng biểu gen chIL-6 tế bào vi khuẩn E.coli” Đề tài nhánh nghiên cứu vấn đề nghiên cứu sử dụng cytokin chIL-6 gà tăng cường chất miễn dịch cho gia cầm Đề tài thực Phòng Các chất chức sinh học – Viện Công nghệ Sinh học – Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam B - Mục tiêu nghiên cứu luận văn: Tiến hành tách dịng gen chIL-6 từ mẫu mơ lách gà, gắn vào vector tách dịng pCR2.1, giải trình tự gen chIL-6, đối chiếu với ngân hàng liệu Genbank Từ gen chIL-6 dịng hóa vector tách dòng pCR2.1, gắn vào vector biểu pGS-21a biểu tế bào E.coli chủng BL21 (DE3) Xác định protein thu trạng thái nội bào hay ngoại bào trạng thái hòa tan C - Nội dung nghiên cứu luận văn: - Tách mRNA tổng số từ mô lách gà - Tạo cDNA phản ứng RT-PCR, gắn vào vector tách dòng pCR2.1 - Giải trình tự gen chIL-6, so sánh với trình tự cơng bố - Tối ưu hóa mã gen chIL-6 để biểu tế bào vi khuẩn E.coli - Thiết kế mồi để gắn gen chIL-6 vào vector biểu pGS-21a - Biểu vector pGS-21a-chIL-6 tế bào E.coli - Khảo sát số điều kiện cảm ứng biểu gen chIL-6 E.coli Nguyễn Thy Ngọc Luận văn tốt nghiệp 3.14 Nghiên cứu khảo sát số yếu tố điều kiện biểu cảm ứng: Tiến ảnh khảo sát số yếu tố có ảnh hưởng đến mức độ biểu protein tái tổ hợp tế bào E.coli như: nhiệt độ cảm ứng, thời gian cảm ứng, nồng độ IPTG cảm ứng để tìm điều kiện thích hợp biểu gen chIL-6 Để khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ cảm ứng đến mức độ biểu gen, tiến hành cảm ứng chủng E.coli mang plasmid tái tổ hợp nhiệt độ 28oC, 30oC, P P P P 35oC 37oC IPTG nồng độ 0.5mg/ml, sau 3h cảm ứng P P P P Kết quả: Ở 35oC 37oC tế bào E.coli có mức độ biểu chIL-6 tái tổ P P P P hợp mạnh Để khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng IPTG đến mức độ biểu gen, tiến hành cảm ứng chủng E.coli mang vector pGS-21a-chIL6 37oC P P nồng độ IPTG 0.5mg/ml, 0.75mg/ml 1mg/ml sau 3h ni cấy Kết quả: nhận thấy tế bào E.coli có mức độ biểu cao ứng với nồng độ chất cảm ứng IPTG 0.5 mg/ml Để khảo sát ảnh hưởng thời gian cảm ứng đến mức độ biểu gen, tiến hành cảm ứng dòng tế bào chứa vector tái tổ hợp nhiệt độ 37oC, nồng độ chất cảm P P ứng IPTG 0.5 mg/ml với thời gian cảm ứng lần lượng 2h, 3h, 4h, h Kết quả: Sau 3h cảm ứng protein tái tổ hợp bắt đầu biểu mạnh sau 4h mức độ biểu cao Nhiệt độ cảm ứng 28oC 30 oC 35oC 37 oC Mức độ biểu + + ++ ++ Nồng độ IPTG (mg/ml) 0.5 0.75 Mức độ biểu ++ + + Thời gian cảm ứng 2h 3h 4h 5h Mức độ biểu +/- + ++ ++ P P P P P P P P Bảng 5: Khảo sát số yếu tố điều kiện biểu gen chIL-6 Khảo sát số điều kiện biểu cảm ứng +/- : Mức độ biểu thấp không quan sát điện di SDS-PAGE 58 Nguyễn Thy Ngọc + Luận văn tốt nghiệp : Mức độ biểu quan sát điện di SDS-PAGE ++ : Mức độ biểu tốt Hình 3.13: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng IPTG lên kết biểu protein tái tổ hợp Giếng 1: Tế bào không cảm ứng Giếng 2: Cảm ứng với nồng độ IPTG 0.5 mg/ml Giếng 3: Cảm ứng với nồng độ IPTG 0.75 mg/ml Giếng 4: Cảm ứng với nồng độ IPTG 1.0 mg/ml Giếng M: Marker protein Hình 3.14: Khảo sát ảnh hưởng nhiêt độ lên kết biểu protein tái tổ hợp 59 Nguyễn Thy Ngọc Luận văn tốt nghiệp Giếng 1: Tế bào cảm ứng biểu nhiệt độ 37oC P P Giếng 2: Tế bào cảm ứng biểu nhiệt độ 35oC P P Giếng 3: Tế bào cảm ứng biểu nhiệt độ 30oC P P Giếng 4: Tế bào cảm ứng biểu nhiệt độ 28oC P P Giếng M: Marker protein Qua khảo sát sơ điều kiện biểu nhằm thu lượng lớn protein chIL-6 tái tổ hợp, định chọn biểu chủng tái tổ hợp E.coli BL21 DE3 mang vector pGS-21a-chIL6 điều kiện nhiệt độ 37oC, nồng độ chất cảm ứng P IPTG 0,5 mg/ml thu protein sau 4h cảm ứng 60 P Nguyễn Thy Ngọc Luận văn tốt nghiệp PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận: • Đã tách dịng xác định trình tự gen chIL-6 từ mẫu lách gà, đoạn gen có trình tự 726 nu Trình tự gen chIL-6 phân lập có mức độ tương đồng 95% so với trình tự IL-6 mã số NM_204628.1 99% so với trình tự mã số HM367074.1 Ngân hàng gen Quốc tế) • Đã tối ưu hóa đoạn gen chIL-6 phần mềm Optimum Gen Codon Optimization Analysis (GenScript) để phù hợp với điều kiện biểu E.coli Đoạn gen chIL-6opt có 143/242 ba bị biến đổi so với trình tự chIL6 gốc Tỉ lệ axit amin tương đồng 100% • Biểu thành cơng protein tái tổ hợp có trọng lượng khoảng 27 kDa tương đương với kích thước ước tính chIL-6 chuẩn gà.Protein tái tổ hợp chủ yếu biểu dạng thể vùi (khơng tan) nằm tế bào E.coli • Khảo sát sơ số điều kiện thích hợp để biểu gen chIL-6 E.coli Chọn nhiệt độ nuôi cảm ứng 37oC, nồng độ chất cảm ứng IPTG P P 0.5mg/ml thu protein sau 4h cảm ứng 4.2 Kiến nghị hướng phát triển đề tài: • Tối ưu hóa điều kiện biểu để thu nhận protein dạng hịa tan • Tiếp tục tiến hành thao tác tinh protein tái tổ hợp thu xác định hoạt tính sinh học protein 61 Nguyễn Thy Ngọc Luận văn tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bùi Thị Huyền, Đặng Thành Nam, Nguyễn Nam Long, Nguyễn Bích Nhi, Phan Văn Chi (2005) Expression and identification of the mature human Interleukin-2 Vietnam Journal of Biotechnology Bùi Quốc Thắng (2006), Vai trò IL-6 tiên lượng rối loạn chức đa quan trẻ mắc hội chứng nhiễm khuẩn toàn thân, Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Hội hồi sức cấp cứu TP.HCM - 2006 Khuất Hữu Thanh (2006), Kỹ thuật gen, nguyên lý ứng dụng, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Lê Đình Lương (2001), Nguyên lý kỹ thuật di truyền, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Thị Kim Cúc, Phạm Việt Cường, Allision McLean (2005),Tách dịng xác định trình tự gen IL-6 từ gà, Tạp chí cơng nghệ sinh học Việt Nam, 3(1), 23 – 28 Nguyễn Văn Cách, (2005) Tin - sinh học, Nhà xuất khoa học Kỹ thuật Hà Nội Ngô Dũng Cường, Cao Tấn Phước, Vũ Thị Minh Phương (2008), Khảo sát interleukine-6, interleukine-8, TNF-α tiên đoán sớm độ nặng viêm tụy cấp, Hội nghị khoa học kỹ thuật bệnh viện cấp cứu Trưng Vương, 21 – 35 Trần Quốc Dung, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ (2006), Công nghệ chuyển gen, Nhà xuất đại học Huế Trương Nam Hải, Bùi Thị Huyền, Đặng Thành Nam, Nguyễn Nam Long, Nguyễn Bích Nhi, Hoàng Quốc Trường, Phan Văn Chi (2005), Phân lập biểu gen cytokin (IL-2) người dùng điều trị bệnh ung thư, Tạp chí Cơng nghệ sinh học Việt Nam, 3(2), 143 - 148 62 Nguyễn Thy Ngọc Luận văn tốt nghiệp TÀI LIỆU TIẾNG ANH: 10 Asif M, Jenkins KA, Hilton LS, Kimpton WG, Bean AG (2004), “Cytokins as adjuvants for avian vaccines”, Immuno cell Biol 11 ARNA E ANDREWS, GARRY J BARCHAM, KETTA, ELSNT, MEEUSEN (1993), ”Molecular cloning and characterization of a ruminant in interlekin - IL6 cDNA”, Immunology and Cell Biology 12 Borish L, Rosenwasser L (1996), “Update on cytokins”, J Allergy Clin Immunol 13 Ebrahimi B, Roy DJ, Bird P, Sargan DR (1995), “Cloning, sequencing and expression of the ovine interleukin gen”, 7(3), 232 – 236 14 Giansanti F, Giardi MF and Botti D (2006), “Avian Cytokins- An Overview”, Current Pharmaceutical Design 15 Gombert AK, Kilikian BV (1998), “Recombinant gen expresion in scherichia coli cultivation using lactose as inducer”, J Biotechnol 16 Hadara T, Kurimoto E, Moriyama Y, Ejima D, Sakai T, Nohara D, Kato K (2001), “Application of combined reagent solution to the oxidative refolding of recombinant human interleukin-6”, Chem Pharm Bull 17 H.E.Grenett, N.I Fuentes and G.M Fullen (1990), “Cloning and sequence analysid of the cDNA for Murire interleukine” 18 Jacques Van Snick (1990), “Interleukin-6: an overview”, Annu Rev Immunol 19 Kalser P, Rothwell L, Goodchild M, Bumstead N (2004), “The chicken proinflamamatory cytokins interleukin-1 and interleukin-6: differences in gen structure and gentic location compared with their mammalian orthologues”, Animal Gentics 20 Kirsten Schneider, Reinhard Klaas, Bernd Kaspers and Peter Staeheli (2001), Chicken interleukin-6 cDNA structure and biological properties , Euro Jor Biochem 268 21 Kishimoto T (2005), “Interleukin-6: from basic science to medicine- 40 years in immunology”, Annu Rev Immunol 63 Nguyễn Thy Ngọc Luận văn tốt nghiệp 22 Liu Xu, Bo Zeng, Rui Peng, Fangdong Zou, Bisong Yue (2008), “Molecular cloning and sequence analysis of the gen encoding interleukin-6 of the giant panda”, Journal of Natural History 23 Min Li, Yuanping Wang, NianLiZhou, Sanjie Cao (2010), The policlonal Antibody againts chicken interleukin- prepared by immunization of Recombinant Eukaryotic plasmid can react efficiently with its prokaryotic expression protein, Journal of Animal and veterinary advances 24 Scott T.R, Lillehoj H.S (2006), “ Monoclonal antibodies against chicken interleukin-6”, Veterinary Immunology and Immunopathology 25 Shabo Y, Lotem J, Rubinstein M, Revel M, Clark S.C, Wolf S.F, Kamen R, Sachs L (1988), “The myeloid blood cell differentiation inducting Protein MGI-2A is interleukin-6” 26 Tetsuji Naka, Norihino Nishimoto and Tadamitsu Kishimoto (2002), “The paradigm of IL-6 : from basic science to medicine”, Arthritis Res 27 William Somers, Mark Stahl and Jasbir S Seehra (1997), “1,9 crystal structure of interleukin 6: implications for a novel mode of receptor dimerization and signaling”, The EMBO Journal, Vol 16 ,No.5 28 http://en.wikipedia.org/wiki/Interleukin 29 http://en.wikipedia.org/wiki/Interleukin_6 30 http://en.wikipedia.org/wiki/Cytokin 31 http://en.wikipedia.org/wiki/Kozak_consensus_sequence 64 Nguyễn Thy Ngọc Luận văn tốt nghiệp PHỤ LỤC Phụ lục 1: Sơ đồ cấu trúc vị trí cắt giới hạn vector pCR 2.1 Thành phần vị trí vector tách dịng pCR ®2.1 P Thành phần Gen LacZ Sp6 promoter Vị trí tạo dòng T7 promoter F1 ori Gen kháng Kanamycin Gen kháng Ampicillin ColE1 ori P Vị trí – 57 239 – 255 269 – 381 388 – 407 572 – 986 987 - 2114 2133 - 2992 3182 - 3765 Phần trình tự biểu thị vector pCR®2.1 đính kèm sản phẩm liên kết TA P P 65 Nguyễn Thy Ngọc Luận văn tốt nghiệp Phụ lục 2: Trình tự đoạn gen IL-6 mã số HM367074 GenBank LOCUS HM367074 726 bp mRNA linear VRT 10-AUG-2010 DEFINITION Gallus gallus interleukin-6 precursor, mRNA, complete cds ACCESSION HM367074 EU170468 SOURCE Gallus gallus (chicken) ORGANISM Gallus gallus 3T 3T Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Archosauria; Dinosauria; Saurischia; Theropoda; Coelurosauria; Aves; Neognathae; Galliformes; Phasianidae; Phasianinae; Gallus REFERENCE (bases to 726) AUTHORS Li,M., Wang,Y and Huang,Y TITLE Expression of interleukin-6 of chicken in Escherichia coli and preparation of its polyclonal antibody JOURNAL REFERENCE AUTHORS Unpublished (bases to 726) Liu,R and Huang,Y China atgaacttca ccgagggctg cgaggcgacg ggacggcggc cggggagcgc cgggagccgc 17T 61 cgccggagag cgccccgtcc cggccccgtc gcgctgctgc cgctgctgct gccgctgctg 17T 121 ctgccgcccg ccgccgccgt cccactgccc gccgccgcgg actcgtccgg agaggttggg 17T 181 ctggaggagg aggcgggggc gcggcgggcg ctgctcgact gcgagccgct ggcccgggtg 17T 241 ctgcgcgacc gcgccgtcca gctgcaggac gagatgtgta agaagttcac cgtgtgcgag 17T 301 aacagcatgg agatgctcgt ccggaacaac ctcaacctgc ccaaggtgac ggaggaggac 17T 361 ggctgcctgc tcgccggctt cgacgaggag aaatgcctga cgaagctctt cagtggtctg 17T 421 ttcgcctttc agacctacct ggaattcatt caagagactt tcgatagcga aaagcagaac 17T 481 gtcgagtctc tgtgctacag cacaaagcac ctggcggcca cgatccggca gatggtgata 17T 541 aatcccgatg aggtggtcat cccagactcg gccgcccaga aatccctcct cgccaatctg 17T 601 aagtcagata aggactggat agagaaaatc accatgcacc tcatcctccg agactttact 17T 661 tcgtttatgg agaagaccgt gagggccgtt cgctatttga aaaagaccag gagtttcagt 17T 721 gcctga 17T 66 Nguyễn Thy Ngọc Luận văn tốt nghiệp Phụ lục 3: Kết so sánh trình tự nucleotid gen IL-6 phân lập từ gà Việt Nam với trình tự gen IL-6 cơng bố Ngân hàng Gen Quốc tế ký hiệu HM179640.1 >gb|M179640.1| Gallus gallus interleukin-6 (IL6) mRNA, complete cds Length=762 GEN ID: 395337 IL6 | interleukin (interferon, beta 2) [Gallus gallus] (10 or fewer PubMed links) Score = 915 bits (1014), Expect = 0.0 Identities = 561/589 (95%), Gaps = 6/589 (1%) Strand=Plus/Plus Query Sbjct 155 Query 61 Sbjct 215 Query 121 Sbjct 275 Query 181 Sbjct 335 Query 241 Sbjct 395 Query 301 Sbjct 455 Query 361 Sbjct 515 Query 421 Sbjct 574 Query 480 Sbjct 634 Query 540 Sbjct 691 CCGCTGCCCGCCGCCGCGGACTCGTCCGGAGAGGTTGGGCTGGAGGAGGAGGCGGGGGCG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCGCTGCCCGCCGCCGCGGACTCGTCCGGAGAGGTTGGGCTGGAGGAGGAGGCGGGGGCG 60 214 CGGCGGGCGCTGCTCGACTGCGAGCCGCTGGCCCGGGTGCTGCGCGACCGCGCCGTCCAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGGCGGGCGCTGCTCGACTGCGAGCCGCTGGCCCGGGTGCTGCGCGACCGCGCCGTCCAG 120 CTGCAGGACGAGATGTGCAAGAAGGTCACCGTGTGCGAGAACAGCATGGAGATGCTCGTC |||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTGCAGGACGAGATGTGCAAGAAGTTCACCGTGTGCGAGAACAGCATGGAGATGCTCGTC 180 CGGAACAACCTCAACCTGCCCAAGGTGACGGATGAGGACGGCTGCCTGCTCGCCGGCTTC |||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||| CGGAACAACCTCAACCTGCCCAAGGTGACGGAGGAGGACGGCTGCCTGCTCGCCGGCTTC 240 GACGAGGAGAAATGCCTGACGAAGCTCTCCAGCGGCCTGTTCGCCTTTCAGACCTACCTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GACGAGGAGAAATGCCTGACGAAGCTCTCCAGCGGCCTGTTCGCCTTTCAGACCTACCTG 300 GAATTCATTCAAGAGACTTTCGATAGCGAAAAGCAGAACGTCAAGTCTCTGTGCTACACC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||| | GAATTCATTCAAGAGACTTTCGATAGCGAAAAGCAGAACGTCGAGTCTCTGTGCTACAGC 360 ACAAACCACCTGGCGGCCACGATCCGGCAGATGGTGATAAGTCCTGATTCTTTTGGTCAT ||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||| ||| || | ||||||| ACAAAGCACCTGGCGGCCACGATCCGGCAGATGGTGATAAATCCCGA-TGAAGTGGTCAT 420 CCCAGACTCGGCCGCCCAGAAATCCCTCCTCGCCAATCTGAAGTCAGAT-ATGACTGGAT ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| | |||||||| CCCAGACTCGGCCGCCCAGAAATCCCTCCTCGCCAATCTGAAGTCAGATAAGGACTGGAT 479 AGAGAAAATCCCCATGGACCTCCCCCCTCCGAGACTTTACTTCGCTATATCTGAGAAGAT |||||||||| ||||| |||| | ||||||||||||||||||| | ||| ||||||| AGAGAAAATCACCATGCACCT-CATCCTCCGAGACTTTACTTCG-TTTAT-GGAGAAGAC CGTGAGGGCCGTTCGCTATTTGAAATAGACGGGAGAGTTTCAGTGCCTG ||||||||||||||||||||||||| |||| | ||||||||||||||| CGTGAGGGCCGTTCGCTATTTGAAAAAGACCAG-GAGTTTCAGTGCCTG 67 588 738 274 334 394 454 514 573 633 539 690 Nguyễn Thy Ngọc Luận văn tốt nghiệp Phụ lục 4: Kết so sánh trình tự axit amin IL-6 phân lập từ gà Việt Nam với trình tự axit amin IL-6 công bố Ngân hàng Gen Quốc tế ký hiệu BAF57911.1 >dbj|BAF57911.1| interleukin-6 [Gallus gallus] Length=194 GEN ID: 395337 IL6 | interleukin (interferon, beta 2) [Gallus gallus] (10 or fewer PubMed links) Score = 295 bits (756), Expect = 6e-81, Method: Compositional matrix adjust Identities = 150/188 (80%), Positives = 159/188 (85%), Gaps = 1/188 (1%) Query Sbjct Query 61 Sbjct 61 Query 121 Sbjct 121 Query 181 Sbjct 180 PLPAAADSSGEVGLEEEAGARRALLDCEPLARVLRDRAVQLQDEMCKKVTVCENSMEMLV PLPAAADSSGEVGLEEEAGARRALLDCEPLARVLRDRAVQLQDEMCKK TVCENSMEMLV PLPAAADSSGEVGLEEEAGARRALLDCEPLARVLRDRAVQLQDEMCKKFTVCENSMEMLV 60 RNNLNLPKVTDEDGCLLAGFDEEKCLTKLSSGLFAFQTYLEFIQETFDSEKQNVKSLCYT RNNLNLPKVT+EDGCLLAGFDEEKCLTKLSSGLFAFQTYLEFIQETFDSEKQNV+SLCY+ RNNLNLPKVTEEDGCLLAGFDEEKCLTKLSSGLFAFQTYLEFIQETFDSEKQNVESLCYS 120 TNHLAATIRQMVISPDSFGHPRLGRPEIPPRQSEVRYDWIEKIPMDLPPPRLYFAISEKI T HLAATIRQMVI+PD P + + DWIEKI M L R + ++ EK TKHLAATIRQMVINPDEVVIPDSAAQKSLLANLKSDKDWIEKITMHL-ILRDFTSLMEKT 180 VRAVRYLK VRAVRYLK 188 VRAVRYLK 187 68 60 120 179 Nguyễn Thy Ngọc Luận văn tốt nghiệp Phụ lục 5: Sử dụng chương trình Optimum Gen Codon Optimization Analysis (Gen Script) để tìm kiếm mã khơng phù hợp chuyển đổi sang mã E.coli 69 Nguyễn Thy Ngọc Luận văn tốt nghiệp Phụ lục 6: Sơ đồ cấu trúc vị trí cắt giới hạn vector pGS-21a 70 Nguyễn Thy Ngọc Phụ lục 6: Luận văn tốt nghiệp Sử dụng chương trình Neb cutter V2.0 để kiểm tra điểm cắt RE gen chIL-6 Các RE không cắt điểm gen chIL-6 (trích lược) No Enzym AatII Acc65I Specificity G ACGT C T T T T T T G GTAC C T 20 BamHI T T T T T G GATC C T 80 HindIII T T T T T A AGCT T T 84 KpnI 91 NcoI 113 SacI T T T T T G GTAC C T T T T T T C CATG G T T T T T T G AGCT C T 134 XhoI 135 ZraI T T T T T C TCGA G T T T T T T GAC GTC T 71 T T T Nguyễn Thy Ngọc Luận văn tốt nghiệp Phụ lục 7: Sử dụng phần mềm Tm Calculation để tính tốn Tm Forward Primer Reverse Primer 72 ... gen chIL- 6 để biểu tế bào vi khuẩn E. coli - Thiết kế mồi để gắn gen chIL- 6 vào vector biểu pGS-21a - Biểu vector pGS-21a -chIL- 6 tế bào E. coli - Khảo sát số điều kiện cảm ứng biểu gen chIL- 6 E. coli. .. lập Vi? ??t Nam với trình tự cơng bố Tối ưu hóa trình tự gen chIL- 6 để biểu host E. coli Gắn trình tự gen chIL- 6 tối ưu hóa vào vector biểu pGS-21a Biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli BL21 DE3 Biểu. .. chủ Nếu gen động vật biểu hệ thống tế bào động vật, gen côn trùng biểu tế bào trùng, vi? ??c biểu gen thực thuận lợi Nếu biểu gen động vật hệ thống tế bào vi khuẩn E coli, hay tế bào trùng, cần phải