Tách dòng và thiêt kê vector chuyển gen mang gen mã hoa nhân tô phiên mã gmdreb3 điêu khiển tinh chống chịu của cây đâu tương glycine max (l ) merrill

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM BÀNH THỊ MAI ANH TÁCH DÕNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ GmDREB3 ĐIỀU KHIỂN TÍNH CHỐNG CHỊU CỦA ĐẬU TƢƠNG [Glycine max (L.) Merrill] LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2011 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC TÁCH DÕNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN MÃ HĨA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ GmDREB3 ĐIỀU KHIỂN TÍNH CHỐNG CHỊU CỦA ĐẬU TƢƠNG [Glycine max (L.) Merrill] Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62.42.70 Học viên: Bành Thị Mai Anh Người hướng dẫn: PGS.TS Chu Hoàng Hà THÁI NGUYÊN - 2011 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chƣa có cơng bố cơng trình khác Mọi trích dẫn đều ghi rõ ng̀n gốc Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới PGS.TS Chu Hồng Hà tận tình hƣớng dẫn, bảo tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn TS Lê Văn Sơn , TS Phạm Bích Ngọc, Ths Lê Thu Ngọc tồn thể cán phịng Cơng nghệ Tế bào thực vật , Viện Cơng nghệ Sinh học tận tình giúp đỡ cho tơi q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin cảm ơn thầy cô khoa Sinh-KTNN khoa Sau đại học, trƣờng Đại học Sƣ phạm – Đại học Thái Nguyên Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán Bộ môn Di truyền & Sinh học đại giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt q trình học tập nghiên cứu đề tài Tơi xin cảm ơn gia đình bạn bè ln động viên, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập thực thành công luận văn Thái Nguyên, ngày 29 tháng năm 2011 Học viên BÀNH THỊ MAI ANH MỤC LỤC Trang Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục i Danh mục chƣ̃ viết tắt iv Danh mục bảng vi Danh mục hình vii MỞ ĐẦU…………………………………………………………………………… I Đặt vấn đề II Mục tiêu nghiên cứu……………………………………………………… III Nợi dung nghiên cƣ́u………………………………………………………… Chƣơng TỞNG QUAN TÀI LIỆU…………………………………………… 1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY ĐẬU TƢƠNG…………………………………… 1.1.1 Nguồn gốc phân loại đậu tƣơng………………………………………… 1.1.2 Đặc điểm sinh học đậu tƣơng………………… 1.1.3 Giá trị kinh tế đậu tƣơng 1.1.4 Tình hình sản xuất đậu tƣơng giới Việt Nam 1.2 HẠN VÀ TÁC ĐỘNG CỦA HẠN ĐẾN CÂY ĐẬU TƢƠNG……… 1.3 CÁC NHĨM GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN………………… 11 1.3.1 Các nhóm gen liên quan đến tính chịu hạn…………………………… 11 1.3.2 Các nhân tố phiên mã điều khiển gen liên quan đến tính chịu hạn……… 12 i 1.3.3 Promoter rd29A…………………………………………………………… 15 1.4 NHÂN TỐ ĐIỀU KHIỂN PHIÊN MÃ DREB…………………………… 18 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U 24 2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ 24 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.2.1 Phƣơng pháp sinh học phân tử 25 2.2.1.1 Phương pháp tách chiết, tinh DNA RNA………………………… 25 2.2.1.2 Phương pháp tổng hợp cDNA……………………………………………… 26 2.2.1.3 Phản ứng PCR …………………………………… 27 2.2.1.4 Phương pháp tách dòng gen……………………………………………… 27 2.2.1.5 Thiết kế cấu trúc pBI101:: rd29A :: DREB3……………………………… 29 2.2.2 Phƣơng pháp tái sinh chuyển gen thông qua Agrobacterium 30 2.2.2.1 Phương pháp chuyển gen vào đậu tương thông qua Agrobacterium 30 2.2.2.2 Phương pháp chuyển gen vào thuốc thông qua Agrobacterium 32 2.2.3 Phƣơng pháp phân tí ch chuyển gen 33 2.2.3.1 Phương pháp PCR 33 2.2.3.2 Phương pháp gây hạn nhân tạo 33 2.2.4 Phƣơng pháp tính tốn xử lý số liệu 33 2.2.5 Phƣơng pháp xƣ̉ lý trì nh tƣ̣ gen và amino acid 33 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN………………………………… 34 3.1 KẾT QUẢ TÁCH DÕNG GEN DREB3…………………………………… 34 ii 3.1.1 Kết quả nhân gen DREB3 tƣ̀ RNA tổng số giống đậu tƣơng Nâu Cao Bằng 34 3.1.2 Kết quả ghép nới đoạn gen DREB3 vào vector tách dịng ………………… 35 3.1.3 Phân tí ch và xếp nhóm protein DREB3 dƣ̣a vào vùng bảo thủ AP2………… 39 3.2 KẾT QUẢ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN DREB3 ……………… 42 3.2.1 Thiết kế vector ……………………………………………………………… 42 3.2.2.Biến nạp cấu trúc vector pBI 101::rd29A::DREB3 vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens………………………………………… 3.3 KẾT QUẢ CHUYỂN GEN DREB3 VÀO CÂY THUỐC LÁ THÔNG QUA AGROBACTERIUM……………………………………………………… 3.3.1 Kết quả chuyển cấu trúc vector pBI ::rd29A::DREB3 vào giống thuốc K326………………………………………………………………………………… 47 48 48 3.3.2 Kết quả phân tí ch và đánh giá các dòng thuốc lá thu đƣợc……………… 50 3.4 KẾT QUẢ CHUYỂN PROMOTER RD29A TRONG CÂY ĐẬU TƢƠNG…………………………………………………………………………… 52 3.4.1 Kết chuyển cấu trúc promoter rd29A vào đậu tƣơng…………………… 52 3.4.2 Kết phân tích đậu tƣơng chuyển gen bằng kỹ thuật PCR…… 55 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ………………………………………………… 56 DANH MỤC CÔNG TRÌ NH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN………………… 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………… 58 PHỤ LỤC………………………………………………………………………… iii DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT ABA Abscisic acid ABR ABA/stress responsive ABRE ABA responsive element AP2/EREBP APETALA2/Ethylene Response Elements Binding Proteins AP2/ERF APETALA2/ethylen response factor AS Acetosyringone A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens BAP 6-benzyladenine bar gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin acetyl transferase bp Base pair bZIP Basic leucine zipper cDNA Sợi DNA bổ sung (Complementary DNA) CCM Cocultivation medium – môi trƣờng đồng nuôi cấy Cs Cộng sƣ̣ DNA Deoxyribonucleic acid dNTP deoxynucleoside triphosphate DRE/CRT Dehydration responsive element/C repeat DREB Dehydration responsive element binding EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid E coli Escherichia coli GA3 Gibberellic acid GM Germination medium – môi trƣờng nảy mầm hạt iv Gus β –Glucuronidase gene (Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase) IBA Indole-3-butyric acid IPTG Isopropylthio-beta-D-galactoside Kb kilo base LB Luria Bertani LEA Late embryogenesis abundant MAP kinase Mitogen-activated protein kinases MES 2-[N-morpholino] ethanesulfonic acid MS Môi trƣờng muối theo Murashige Skoog (1962) NSL Nuclear localization signal OD Optical density rd29A Responsive Dehydration PCR Polymerase Chain Reaction – phản ứng chuỗi polymerase RM Rooting medium – môi trƣờng rễ RNA Ribonucleic acid SDS Sodium dodecylsulfat SIM Shoot induction medium – môi trƣờng tạo đa chồi SEM Shoot elongation medium – môi trƣờng kéo dài chồi TBE Tris - Boric acid – EDTA TAE Tris - Acetate – EDTA TE Tris – EDTA v/p vòng/phút X-gal 5-brom- 4-chloro-3-indolyl-b-D-galactosidase v DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Tình hình sản xuất đậu tƣơng Việt Nam từ năm 2003 đến 2010… Bảng 2.1 Thành phần dung dịch đệm tách chiết…………………………… 25 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR…………………………………… 27 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng……………… 27 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng colony – PCR……………………………… 28 Bảng 2.5 Thành phần hoá chất tách plasmid………………………………… 29 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme BamHI, SacI 29 Bảng 2.7 Môi trƣờng nuôi cấy đậu tƣơng…………………………………… 31 Bảng 2.8 Môi trƣờng nuôi cấy thuốc lá……………………………………… 32 Bảng 3.1 Sƣ̣ sai khác về trì nh tƣ̣ nucleotide và amino acid của trình tự gen DREB3 thu đƣợc với gen GmDREB3 mã số DQ055133……………………… 38 Bảng 3.2 Tỷ lệ sống sót của mảnh thuốc biến nạp qua giai đoạn chọn lọc 48 Bảng 3.3 Tỷ lệ sống sót mô đậu tƣơng qua giai đoạn chọn lọc 53 vi mẫu phân tí ch của thƣ̣c vật đã qua nhân giốn g hƣ̃u tí nh , tƣ́c là qua các thế hệ T 1, T2… dƣới dạng hạt rồi thì hoàn toàn loại trƣ̀ khả này (ii) Gen chuyển tồn tại tƣ̣ tế bào chất, biến qua sinh sản hữu tính (iii) Gen chuyển không hoạt động , tƣ́c không đƣợc biểu thành protein có chức sinh học [1] 21 13 57 62 ĐC A Sau 10 ngày gây hạn ĐC 57 62 B Sau 15 ngày gây hạn 57 21 13 62 ĐC 52 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn C Sau tưới nước phục hồi 10 ngày Hình 3.17 Kết quả gây hạn nhân tạo các dòng thuốc lá chuyển gen Chúng tiến hành xử lý hạn dòng thuốc chuyển gen dƣơng tính với PCR nhằm đánh giá bƣớc đầu sƣ̣ hoạt động của gen chuyển dƣới sƣ̣ điều khiển của promoter rd29A, có làm tăng cƣờng hoạt động của gen DREB3 th́c lá chủn gen tƣ̀ đó có tăng cƣờng khả chịu hạn hay không Ở giai đoạn gây hạn 10 ngày, hầu hết các dòng chuyển gen lá còn xanh , đối chứng héo Kết quả nhận thấy khả chịu hạn chuyển gen đƣợc tăng cƣờng nhiều so với đối chƣ́ng Trong đó dòng có khả chịu hạn tốt Tuy nhiên, dịng thuốc chuyển gen thì mƣ́c đợ chị u hạn cũng khác nh au, nên mƣ́c độ héo giai đoạn cũ ng khác Điều này là có thể vị trí gen đƣợc chuyển vào các vị trí khác tế bào nên có dòng đƣợc tăng cƣờng hoạt động , một sớ dòng bị ƣ́c chế hoạt đợng Ngồi ra, một nguyên nhân nƣ̃a cũng có thể dẫn tớ i hiện tƣợng các dòng chuyển gen có khả chị u hạn khác dịng có copy gen hoạt động mạnh dịng có nhiều copy , số lƣợng copy nhiều bị ức chế hoạt động Sau tiến hành tƣới nƣớc trở lại 10 ngày, hầu hết các dòng thuốc lá đều tƣơi trở lại, đối chƣ́ng thì cũng có khả phục hời nhiên rất ́u 3.4 KẾT QUẢ CHUYỂN PROMOTER RD29A TRONG CÂY ĐẬU TƢƠNG 3.4.1 Kết chuyển cấu trúc promoter rd29A vào đậu tƣơng Trƣớc tiến hành chuyển cấu trúc vector chuyển gen đƣợc thiết kế vào đậu tƣơng, tiến hành chuyển cấu trúc vector pBI 101::rd29A::gus vào đậu tƣơng để kiểm tra hoat động của promoter rd29A tỉ lệ chuyển gen đậu tƣơng DT84 Mỗi một cấu trúc vector và promoter sƣ̉ dụng thiết kế vector chuyển gen đều ản h hƣởng đến tỉ lệ chuyển gen Một số nghiên cƣ́u đã chỉ rằ ng sƣ̉ dụng promoter và vector không phù hợp thì gây sƣ̣ biểu hiện gen điều kiện bì nh thƣờng và gây ảnh hƣởng đến sinh trƣởng và phát triển của chuyển gen , thƣờng làm biến đổi kiểu hì nh gây lùn và làm chậ m quá trì nh sinh trƣởng Vì vậy, cần lƣ̣a chọn các cấu trúc vector 53 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn promoter điều khiển gen phù hợp để hạn chế tối đa ảnh hƣởng đến chuyển gen điều kiện bì nh thƣờng Giống đậu tƣơng tiến hành nghiên cƣ́u là giống DT84 đƣợc chuyển gen thơng qua chủng vi kh̉n A tumefaciens có chứa vector pBI101::rd29A::gus theo quy trì nh đã đƣợc tối ƣu hóa theo tác giả Nguyễn Thị Thúy Hƣờng [9] Nguyễn Thu Hiền [5] Kết quả thu đƣợc chúng trì nh bày bảng 3.3 Bảng 3.3 Tỷ lệ sống sót mô đậu tƣơng qua giai đoạn chọn lọc Lơ thí Sớ mẫu Sớ mẫu nghiệm biến nạp tạo đa chồi Số chồi Số chồi kéo dài rễ Số Số sống dƣơng tính giá thể với PCR 190 120 11 - 250 172 30 22 - 290 142 40 27 10 287 175 57 30 13 - 295 201 20 19 298 108 17 16 11 - 300 189 38 23 17 270 200 33 14 15 Tổng 2180 1370 246 158 82 Số lƣợng mẫu biến nạp 2180 đó có 1370 mẫu tạo đa chồi, chiếm tỉ lệ 62,84 % Tƣ̀ các cụm chồi này thu đƣợc 246 chồi kéo dà i ở các giai đoạn khác ; giai đoạn SIM 0, SIMkana100, hay SEM ; chiếm tỉ lệ 11,28 % Các chồi mọc cao đến kích thƣớc định khảng 5-7cm thì đƣợc c chuyển sang mơi trƣờng rễ có chứa kháng sinh cefotaxim 250mg/l Trong môi trƣờng rễ RM , chồi rễ 158 chiếm tỉ lệ 7,25 % Chất lƣợng rễ ở các chời là khác , có số chồi không rễ Chọn lọc chồi rễ tạo hoàn chỉ nh , tiến hành cho trấu : cát, giá thể trấu : cát có 82 54 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn sống sót Sau đó tiếp tục cho đất trồng Các giai đoạn phát triển cụ thể đƣợc trình bày hình 3.18 Mơi trƣờng SIMo Mơi trƣờng SIMo sau tuần Môi trƣờng SIMkana100 Môi trƣờng SEM Môi trƣờng rễ RM Giá thể trấu : cát 55 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Giá thể TN1 Hình 3.18 Các giai đoạn trình chuyển gen đậu tƣơng 3.4.2 Kết quả phân tích đậu tƣơng chuyển gen bằng kỹ thuật PCR Khi đƣợc trồng đất trại thực nghiệm đã cƣ́ng cáp , sau một tháng chúng tiến hành thu mẫu lá tách DNA tổng số để kiểm tra ban đầu kết quả chuyển gen Kết tách chiết DNA mỗi dòng đậu tƣơng thu đƣợc một băng lớn không bị đƣ́t gãy , phù hợp để tiếp tục phân tí ch Tƣ̀ lƣợng DNA tổng số , tiến hành phản ƣ́ng PCR với cặp mồi đặc hiệu của rd29A F/R, sau đó tiến hành phân tí ch kiểm tra vớ i cặp mồi nhân plasmid Agrobacterium nhằm kiểm tra xem mẫu phân tí ch liệu có còn bị nhiễm Agrobacterium hay không (-) M (+) 16’ 16 57’ 57 64’ 64 81’ 81 1500 bp 1000 bp ~1300 bp Hình 3.19 Kết điện di sản phẩm PCR với hai cặp mồi đặc hiệu của promoter rd29A cặp mồi nhân gen virC (-) sản phẩm PCR DNA tổng số của đậu tương đối chứng không chuyển gen; M: thang DNA chuẩn kb; (+) sản phẩm PCR plasmid pBI ::rd29A; (16’, 57’, 64’, 81’): sản phẩm PCR DNA tổng số dòng đậu tương thu với cặp mồi n hân gen virC ; 56 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn (16, 57, 64, 81): sản phẩm PCR DNA tổn g số các dòng đậu tương thu được với cặp mồi đặc hiệu của promoter rd29A Kết quả tiến hành PCR DNA tởng sớ các dòng đậu tƣơng thu đƣợc dịng dƣơng tính, cụ thể dòng 16, 57, 64, 81 Khi tiến hành PCR với cặp mồi của Agrobacterium khơng thu đƣợc kết Nhƣ vậy , khẳng định dịng đậu tƣơng thu đƣợc dƣơng tí nh với PCR là các dòng chuyển gen thành công và không phải nhiễm Agrobacterium KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Đã tách dòng đƣợc gen DREB3 giống 100% với gen GmDREB3 mã số DQ055133.1, kích thƣớc 819 bp, mã hóa cho 273 amino acid tƣ̀ RNA tổng số ở đậu ĐC tƣơng xƣ̉ lý hạn 1.2 Kết quả phân tí ch trì nh tƣ̣ amino acid suy diễn protein DREB3 cho thấy chƣ́a vùng bảo thủ AP gồm 60 amino acid, tƣ̀ vị trí amino acid số 137 đến số 197 Phân tích vùng AP protein DREB3 với protein của các gen khác thuộc họ lớn AP 2/ERF cho kết quả: gen DREB3 thu đƣợc thuộc nhóm A6 họ gen DREB 1.3 Từ cấu trúc pBI101::rd29A::gus t hiết kế thành công vetor chuyển gen pBI::rd29A::DREB3 Trong đó , promoter cảm ứng hạn gen rd29A điều khiển hoạt động của gen DREB3 1.4 Đã biến nạp thành công vector chuyển gen mang gen DREB3 vào thuốc lá, chọn lọc 40 dịng th́c lá thu đƣợc đem phân tí ch , thu đƣợc 21 dòng dƣơng tính với PCR Kết quả x lý hạn đã chƣ́ng minh đƣợc dịng th́c lá chủn gen có khả chịu hạn cao so với đối chƣ́ng không chuyển gen 1.5 Để kiểm tra hoạt độ ng promoter rd29A, tiến hành biến nạp cấu trúc vector pBI ::rd29A::gus vào đậu tƣơng bƣớc đầu thu đƣợc dòng (16, 57,64, 81) dƣơng tí nh với phản ứng PCR bằng cặp mồi nhân đoạn promoter rd29A Đề nghị 57 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.1 Tiếp tục x lý stress môi trƣờng (nhƣ là stress lạnh , mặn…) đậu tƣơng thuốc chuyển gen Phân tí ch một s ố tiêu liên quan đến tính chống chịu với stress môi trƣờng nhƣ: hàm lƣợng proline, độ dài của rễ… 2.2 Tiếp tục theo dõi các dòng thuốc lá và đậu tƣơng chuyển gen ở các thế hệ tiếp theo xem gen đƣợc chuyển có trì sƣ̣ ổn đị nh hay không 2.3 Tiến hành biến nạp vector chuyển gen pBI ::rd29A::DREB3 vào đậu tƣơng Đánh giá kiểm tra các đậu tƣơng chuyển gen so sánh với đối chƣ́ng điều kiện xử lý stress mơi trƣờng DANH MỤC CƠNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Bành Thị Mai Anh, Lê Thu Ngọc, Phạm Bích Ngọc, Chu Hồng Hà (2011), “ Tách dịng gen mã hóa nhân tố phiên mã GmDREB3 đậu tƣơng đánh giá hoạt động cấu trúc gen rd29A::DREB3 thuốc chuyển gen”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học 58 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO A TIẾNG VIỆT Lê Trần Bì nh (2008), Phát triển trồng chuyển gen thực vật , Nxb Khoa học tƣ̣ nhiên và Công nghệ Nguyễn Tiến Dũng (2010), “Nghiên cƣ́u biến nạp gen vào đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merrill) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”, Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Văn Điển (2007), Giáo trình đậu tương, Nxb Nông Nghiệp Trần Thị Thanh Hảo (2009), “Nghiên cƣ́u tạo t huốc lá chuyển gen kháng sâu vip3A”, Luận văn thạc sĩ Nông nghiệp Nguyễn Thu Hiền , Chu Hoàng Mậu , Chu Hoàng Hà , Lê Văn Sơn (2010), “Nghiên cƣ́u khả tái sinh và biến nạp gen qua nách lá mầm của giống đậu tƣơng (glycine max L.) DT84 DT 12 bằng Agrobacterium”, Tạp chí Công nghệ Sinh học , Hội nghị khoa học miền Trung -Tây nguyên Nguyễn Hiệp Hòa (2010), “Nghiên cƣ́u gen DREB mã hóa protein liên quan đến q trình phiên mã nhóm gen chịu hạn câ y đậu tƣơng [Glycine max (L.) Merrill]”, Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Thị Cúc Hòa (2010), “Tạo dòng đậu tƣơng biến đổi gen kháng sâu và chị u hạn”, Báo cáo tổng kết đề tài khoa học bộ Nông nghiệp và phát triển nông thơn 59 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Phạm Xuân Hội (2011), Phân lập và thiết kế các vector mang gen điều khiển tí nh chịu hạn phục vụ công tác tạo giống chuyển gen , Báo cáo tổng kết đề tài khoa học bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn Nguyễn Thị Thúy Hƣờ ng (2011), “Phân lập , tạo đột biến điểm gen P5CS liên quan đến tí nh chị u hạn và thƣ̉ nghiệm chuyển vào đậu tƣơng Việt Nam” , Luận án tiến sĩ sinh học 10 Trần Thị Phƣơng Liên (2010), Protein và tí nh chống chị u, Nxb Khoa họ c tƣ̣ nhiên Công nghệ 11 Nguyễn Đƣ́c Thành (2008), Chuyển gen ở thực vật , Nxb Khoa học tƣ̣ nhiên và Công nghệ 12 Quyền Đì nh Thi , Nông Văn Hải (2008), Những kỹ thuật PCR và ứng dụng phân tí ch DNA, tập II, Nxb Khoa học tƣ̣ nhiên và Công nghệ 13 Nguyễn Hải Tuất, Ngô Kim Khôi (1996), Xử lý thống kê kết nghiên cứu thực nghiệm nông lâm ngư nghiệp máy vi tính, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội B TIẾNG ANH 14 Chen M, Wang Q-Y (2007), “GmDREB2, a soybean DRE-binding transcription factor cofferred dought and hingh-salt tolerance in transgenic plants”, Biochemical and Biophysical Research Communications 253, 299-305 15 Chen M, Xu Z, Xia L (2009), “Cold-induced modulation and functional analyses of the DRE-binding transcripton factor gene, GmDREB3, in soybean (Glycine max L.)”, Journal of Experimental Botany 60(1), 121-135 16 Dorothea B, Ramanjulu S (2005), “Dought and salt tolerance in palnts”, Critical Reviews in Plant Sciences, 23-58 17 Enrico M, Kimmen S, Sarah H (2004), “From Endonucleases to Transcription Factors: Evolution of the AP2 DNA Binding Domain in Plants”, The Plant Cell 16, 2265–2277 18 Gao S, Xu H (2005), “Improvement of wheat dought and salt tolerance by expression of a stress-inducible transcription factor GmDREB of soybean (Glycine max)”, Chinese Science Bulletin 50 (23) 60 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 19 Huang B (2006), Plant-environment interactions, Third edition, Spinger, 15-40 20 Amudha J, Balasubramani G (2011), “Recent molecular advances to combat abiotic stress tolerance in crop plants”, Biotechnology and Molecular Biology Review 6(2), 31-58 21 Kazuo N, Zabta K-S (2000), “Organization and expression of two Arabidopsis DREB2 gene encoding DRE-binding proteins involved in dehydration- and high-salinityresponsive gene expression”, Plant Molecular Biology 42, 657-665 22 Kazuo Y-S, Kazuo S (1994), “A novel cis-acting element in an Arabidopsis gene is involved in responsiveness to dought, low-temperature, or high-salt stress, The Plant Cell 6, 251-264 23 Manavalan L-P, Guttikonda S-K (2009), “Physiological and molecular approaches to improve dought resistance in soybean”, Plant Cell Physiology 50, 1260-1276 24 Li X-P, Tian A-G, Luo G-Z (2005), “Soybean DRE-binding transcription factors that are responsive to abiotic stresses”, Theoretical and Applied Genetics, 1355–1362 25 Liu Q, Mie K, Yoh S (1998), “Two transcription factors, DREB1 and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in dought- and low-temperature –responsive gene expression, respectively, in Arabidopsis”, The Plant Cell 10, 1391-1406 26 Liu Q, Zhao N, Shinozaki K-Y (2000), “Regulatory role of DREB transcription factors in plant dought, salt and cold tolerance”, Chinese Science Bulletin 45 (11) 27 Mohammad S-I, Wang M-H (2009), “Expression of dehydration responsive element-binding protein-3 (DREB3) under different abiotic stresses in tomato”, http://bmbreports.org 28 Liu N, Zhong N-Q, Wang G-L (2007), “Cloning and functional characterization of PpDBF1 gene encoding a DRE-binding transcription factor from Physcomitrella patens”, Planta 226, 827-838 29 Phan T L-S, Keiichi M (2010), “Functional genomics of soybean for improvement of productivity in adverse conditions”, Function Integration Genomics, 10, 447–462 61 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 30 Phang T-H, Li M-W (2010), “Molecular responsive to osmotic stresses in soybean”, Soybean – Molecular Aspects of Breeding, chapter 10, 216-239 31 Pooja Bhatnagar-Mathur, V.Vadez, Kiran K.Sharma (2008), “Transgenic approaches for abiotic stress tolerance in plants: retrospect and prospects”, Plant Cell Report, 411- 424 32 Pradeep K-A, Agarwal P, Reddy M-K (2006), “Role of DREB transcription factors in abiotic and biotic stress tolerance in plants”, Plant Cell Report, 1263–1274 33 Stolf-Moreira R, Medri M-E, Neumaier N (2010); “Cloning and quantitative expression analysis of drought-induced genes in soybean”, Genetics and Molecular Research 9, 858-867 34 Syed S-H, Mahmood A-K, Muhammad A (2011), “Transcription factors as tool to engineer enhanced dought stress tolerance in plants”, Wileyonlinelibrary.com 35 Yoh S, Kyonnoshin M (2006), “Functional analysis of an Arabidopsis transcription factor, DREB2A, involved in dought-responsive gene expression”, The Plant Cell 18, 1292-1309 36 Yoshihiro N, Kazuo N (2003), “ Interaction between two cis -acting elements , ABRE và DRE , in ABA-dependent expression of Arabidopsis rd29A gene in responsive to dehydration and high-salinity stresses”, The Plant Journal 34, 137-148 37 Wang J-W, Yang F-P, Chen X-Q (2006), “Induced Expression of DREB Transcriptional Factor and Study on Its Physiological Effects of Drought Tolerance in Transgenic Wheat”, Acta Genetic Sinica, 33 (5), 468-476 38 Zhang M, Liu W, Bi Y-P (2009), “Dehydration-responsive element-binding (DREB) transcription factor in plants and its role during abiotic stresses”, Hereditas, 236-244 39 Zhang G, Chen M, Li L, “Overexpression of the soybean GmERF3 gene, an AP2/ERF type transcription factor for increased tolerances to salt, drought, and diseases in transgenic tobacco”, Journal of Experimental Botany 60 (13), 3781–3796 40 Zhou M-L, Ma J-T (2010), “Regulation of plant stress response by dehydration responsive element binding (DREB) transcription factors”, African Journal of Biotechnology 9, 9255-9279 62 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn C CÁC TRANG WEB 41 http://faostat.fao.org/ 42 www.gso.gov.vn/ 43 http://www.vietrade.gov.vn/ 44 http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/ 45 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/ 46 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 63 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn PHỤ LỤC Danh mục trình tự amino acid sử dụng nội dung so sánh: STT Tên Protein MÃ SỚ LOÀI Họ Nhóm GmDREB1 AAP47161 Glycine max DREB A5 GhDBP1 AAO43165 Gossypium hirsutum DREB A5 ABB36646 Glycine max DREB A5 GmDREB3 GmDREBc AAP83131 Glycine max DREB A2 GmDREBa AAT12423 Glycine max DREB A2 TaDREB1 AAL01124 DREB A2 OsDREB2A DREB A2 ZmDBF1 AAM80486 Zea Mays DREB A6 AAT39542 Gossypium hirsutum DREB A6 10 GhDBP2 GmDERBb AAQ57226 Glycine max DREB A6 11 HvCBF6 AAX23701 DREB A1 12 TaCBF6 AAX28964 DREB A1 13 OsDREB1A AAN02486 DREB A1 14 CsDREB1D BAD67595 DREB A1 15 AsCBF1 CAJ21276 DREB A1 16 BCBF1 AAK01088 DREB A1 17 AcCBF DREB A1 18 TaCBF1 DREB A1 19 OsDREB1C DREB A1 AAN02487 AAL35759 AAL37944 BAA90812 Triticum aestivum Oryza sativa Hordeum vulgare Triticum aestivum Oryza sativa Oryza sativa Japonica Avena sativa Hordeum vulgare Secale cereale Triticum aestivum Oryza sativa 20 HvCBF2 AAM13419 21 OsDREB1E AAX23722 22 CaCBF1B AAQ88400 23 Cb-CBF AAR26658 24 LeCBF1 AAK57551 25 BnCBF AAL38243 26 PaDREB1 BAD27123 27 OsDREB1D AAX23723 28 ZmDBF2 AAM80485 29 TINY2 AAX38232 30 ZmABI4 AAM95247 Arabidopsis thaliana Zea Mays 31 GmSGR ABS30430 Glycine max 32 ORCA2 CAB93940 33 ORCA3 ABW77571 34 AtERF AED95487 Catharanthus roseus Arabidopsis thaliana 35 AtERF AEE32574 Arabidopsis thaliana ERF 36 AtERF Arabidopsis thaliana ERF 37 AtERF AEE32574 AED95489 Arabidopsis thaliana ERF 38 TSI1 AAC14323 Nicotiana tabacum ERF 39 RAV2 BAA34251 Arabidopsis thaliana RAV 40 RAV2 ABY57635 Solanum lycopersicum RAV 41 RAV1 Arabidopsis thaliana RAV 42 RAV1 BAA34250 ABY57634 Solanum lycopersicum RAV 43 ANT AEE86834 Arabidopsis thaliana AP2 Hordeum vulgare Oryza sativa Capsicum annuum Capsella bursa-pastoris Solanum lycopersicum Brassica napus Prunus avium Oryza sativa Zea Mays Catharanthus roseus DREB A1 DREB A1 DREB A1 DREB A1 DREB A1 DREB A1 DREB A1 DREB A1 DREB A4 DREB A4 DREB A3 DREB A3 ERF ERF ERF 44 AP2 AAG32658 45 RAP 2.7 ACF74549 Picea abies Nicotiana tabacum AP2 AP2 ... DÕNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ GmDREB3 ĐIỀU KHIỂN TÍNH CHỐNG CHỊU CỦA ĐẬU TƢƠNG [Glycine max (L. ) Merrill] Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62.42.70... tiến hành đề tài: ? ?Tách dòng thiết kê? ? vector chuyển gen mang gen mã hóa nhân tô? ? phiên mã GmDREB3 điều khiển tí nh chống chị u của đậu tƣơng [Glycine Max (L. ) Merrill] ” II Mục tiêu... pháp tách dòng gen Tinh gắn đoạn gen/ promoter vào vector tách dịng pBT: Gen đƣợc làm (thơi gel) theo quy trình QIAquick Gel Extraction Kit (Bioneer); sau đó đƣợc gắn đoạn gen vào vector tách dòng