Tách dòng và biểu hiện gen mã hoá tyrosinase từ aspergillus oryzae tp01

bộ giáo dục đào tạo trường đại học bách khoa hµ néi - luận văn thạc sĩ khoa học Tách dòng biểu gen mà hóa Tyrosinase từ aspergillus oryzae tp01 ngành : công nghệ sinh học mà số:23.04.3898 Nguyễn thị hoa Người hướng dẫn khoa học: GS.TS đặng thị thu VIệN CNSH&CNTP- đh BáCH KHOA HN Hà Nội 11/ 2008 MỤC LỤC MỤC LỤC BẢNG VIẾT TẮT .3 DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG MỞ ĐẦU .6 Phần I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ENZYM TYROSINASE (EC 1.14.18.1) 1.1.1 NGUỒN THU TYROSINASE .7 1.1.2.1 Cấu tạo không gian khối lượng phân tử tyrosinase .9 1.1.2.2 Tính chất Tyrosinase .12 1.1.3 CƠ CHẾ XÚC TÁC CỦA TYROSINASE 15 1.1.4 VAI TRÒ VÀ ỨNG DỤNG CỦA TYROSINASE 18 1.1.4.1 Vai trò tyrosinase 18 1.1.4.2 Ứng dụng tyrosinase 19 1.1.4.2.1 Trong ngành công nghiệp thực phẩm 19 1.1.4.2.2 Trong y học dược phẩm 20 1.1.4.2.3 Trong lĩnh vực hóa mỹ phẩm 20 1.1.4.2.4 Trong lĩnh vực xử lý môi trường 21 1.1.5 TYROSINASE TÁI TỔ HỢP .21 1.2 VECTOR VÀ TẾ BÀO CHỦ 25 1.2.1 Khái niệm vector 25 1.2.2 Vector tách dòng pCR2.1 .25 1.2.3 Hệ vector biểu Pichia pastoris 27 1.2.4 Tế bào chủ 30 1.2.4.1 Hệ thống tế bào chủ biểu gen 30 1.2.4.2 Tế bào chủ Pichia pastoris 32 Phần II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 35 2.1 Vật liệu .35 2.1.1 Chủng vi sinh vật plasmid 35 2.1.2 Hóa chất 35 2.1.3 Trang thiết bị .35 2.2 Phương pháp .36 2.2.1 Phương pháp tách chiết ARN tổng số 36 2.2.2 Phương pháp định lượng AND/ARN quang phổ kế 36 2.2.3 Phương pháp phiên mã ngược tạo cADN 37 2.2.4 Phương pháp khuếch đại gen kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction) .38 2.2.5 Phương pháp điện di gel agarose 39 2.2.6 Phương pháp biến nạp 40 2.2.7 Phương pháp tách chiết ADN plasmid từ vi khuẩn E.coli .42 2.2.8 Phản ứng cắt ADN enzym giới hạn (Restriction enzym – RE) 43 2.2.9 Phương pháp giải trình tự gen máy giải trình tự gen tự động ABI 3100 .44 2.2.10 Phương pháp biến nạp vào Pichia pastoris - X33 45 Phần III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47 3.1 Tách ARN tổng số phương pháp Trizol .47 3.2 Tổng hợp cDNA khuếch đại gen phản ứng Nested PCR 47 3.3 Kết tách dịng gen mã hố tyrosinase 49 3.3.1 Kết gắn vào vector pCR 2.1 biến nạp 49 3.3.2 Tách ADN plasmid .50 3.3.3 Kiểm tra AND plasmid mang gen enzym giới hạn 51 3.3.4 Kết giải trình tự gen máy giải trình tự gen tự động ABI 3100 52 3.4 Biểu gen mã hoá tyrosinase Pichia pastoris X33 61 3.4.1 Thiết kế vector biểu tyrosinase Pichia pastoris X33 61 3.4.2 Biến nạp pPICZαA-TYR vào E.coli Top 10F’ 63 3.4.3 Biến nạp pPICZαA-TYR vào Pichia pastoris X33 65 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO .69 BẢNG VIẾT TẮT ADN Deoxyribonucleic axit Amp Ampicilliin AOX Alcohol oxidase ARN Axit ribonucleic cDNA Complementary DNA DEPC Diethylpyrocarbonate DHAS Dihydroxyacetone synthase dNTP Deoxyribonucleic triphosphate DTT Dithiothreitol (C4H10O2S2 W = 154,25) EDTA Ethylenediaminetetraacetic EtBr Ethidium bromide FLD Formaldehyde dehydrogenase FMLD Formate dehydrogenase kDa Kilo Datol LB Lauria- bertani medium MD Minimal dextrose medium OD Optical density PCR Polymerase chain reaction RE Restriction enzyme RT Reverse transcription SCED Sorbitol citrat natri EDTA DTT SDS Sodium dodecyl sulphate TE Tris - EDTA TYR Tyrosinase YPD Yeast pepton dextrose YPDSZ Yeast pepton dextrose sorbitol zeocin DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 1.10 Tên hình Phản ứng chuyển hóa xúc tác tyrosinase Cấu trúc xoắn ốc α Tyrosinase Cấu tạo trung tâm hoạt động Tyrosinase Phản ứng tạo Hemocyamin từ Deoxy-tyrosinase Tyrosinase xúc tác chuyển hoá hai dạng mono di-phenol Cơ chế xúc tác tyrosinase với tham gia phân tử O2 Phản ứng oxy hóa pirocatechol tác dụng catecholase Quá trình tổng hợp melanin tế bào động vật Vị trí bảo thủ CuA CuB tyrosinase lồi nấm khác So sánh trình tự axit amin gen mel O A.oryzae với Trang 10 10 12 12 16 18 18 19 24 1.11 1.12 2.1 2.2 2.3 2.4 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 Neurospora crassa Sơ đồ vector pCR 2.1 (Invitrogen) Sơ đồ vector pPICZα Sơ đồ tổng hợp cDNA sợi đơn Chu trình nhiệt phản ứng PCR Phản ứng gắn ADN vào vector tách dòng pCR 2.1 Gắn pPICZ αA mang gen vào Pichia pastoris ARN tổng số từ Aspergillus oryzae TP01 Sản phẩm PCR agarose 1% Khuẩn lạc E.coli Top10F mang vector tách dòng Điện di đồ tách ADN plasmid tách dòng Kiểm tra ADN plasmid mang gen TYR EcoR I Sơ đồ qui trình hồn chỉnh gen TYR-VN Điện di đồ gel agarose 1% Sản phẩm PCR với mồi biểu gel agarose 1% Sơ đồ vector biểu gen TYR Pichia pastoris Khuẩn lạc Ecoli Top10F’ mang vector biểu 27 30 39 40 42 46 48 50 51 52 53 59 61 63 64 65 3.11 3.12 3.13 Điện di đồ AND plasmid biểu vào E.coli Top 10F’ Sản phẩm cắt pPICZαA-TYR Sản phẩm cắt mở vòng 65 66 67 25 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Tính chất tyrosinase số loại nấm 15 1.2 Số axit amin mã hố tyrosinase lồi khác 23 1.3 Trình tự axit amin gen melO 24 1.4 Thành phần vị trí vector tách dịng pCR2.1 28 1.5 Thành phần vector pPICZα 30 1.6 Các loại tế bào chủ chủ yếu 31 3.1 Trình tự mồi TYR5 49 3.2 Trình tự mồi TYR3 49 3.3 Trình tự gen TYR5 54 3.4 Trình tự gen TYR3 55 3.5 Vị trí enzym cắt giới hạn TYR5 56 3.6 Vị trí enzym cắt giới hạn TYR3 57 3.7 Trình tự đoạn gen TYR mã hóa cho tyrosinse từ A.oryzae TP01 60 3.8 Các enzym cắt giới hạn không cắt gen TYR 62 3.9 Mồi biểu cho TYR 63 MỞ ĐẦU Tyrosinase enzym nhiều nhà khoa học giới quan tâm nghiên cứu từ nhiều năm qua Tyrosinase ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực ngành thực phẩm: tạo màu sắc, hương vị chất lượng cho chè đen, café, ca cao , ngành y dược: ngăn ngừa xâm nhiễm vi khuẩn, điều trị bệnh Parkinson, bệnh tạng, lang ben , sản xuất kem làm trắng da đặc biệt khả phát hiên hợp chất thuộc họ polyphenol xử lý môi trường Với mục tiêu tạo lượng lớn tyrosinase thời gian ngắn, để ứng dụng vào mục đích mong muốn, chúng tơi tiến hành tạo tyrosinase tái tổ hợp Để tạo tyrosinse tái tổ hợp việc chọn tế bào chủ để biểu vấn đề quan trọng Tyrosinas từ Aspergillus oryzae TP01 (chủng gốc) có hoạt tính tyrosinase nội bào, phải phá vỡ màng tế bào gây khó khăn thu nhận làm tăng giá thành chế phẩm enzym Do chọn tế bào chủ chủng nấm men Pichia pastoris với vector biểu pPICZαA có tín hiệu αfactor yếu tố tạo protein ngoại bào, thuận lợi cho q trình thu nhận enzyme Nội dung nhằm giải vấn đề thực luận văn: - Tách chiết ARN tổng số từ Aspergillus oryzae TP01 - Tách dịng giải trình tự đoạn gen mã hóa cho tyrosinse từ Aspergillus oryzae TP01 - Tạo vector biểu cho tyrosinase nấm men Pichia pastoris - Biểu tyrosinase Pichia pastoris X33 Phần I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ENZYM TYROSINASE (EC 1.14.18.1) Tyrosinase enzym hai chức (bifunctional enzym), xúc tác phản ứng hydroxyl hóa monophenol tyrosine, p-cresol axít p-coumaric thành odiphenol (thể họat tính cresolase monophenolase) oxi hóa o-diphenol thành dopaquinone (thể hoạt tính catacholase diphenolase ) Hình 1.1 Phản ứng chuyển hóa xúc tác tyrosinase 1.1.1 NGUỒN THU TYROSINASE Tyrosinase tìm thấy phổ biến tự nhiên, tất quan, mô thực vật, động vật vi sinh vật: vi khuẩn nấm mốc Đây nguồn thu enzym vô phong phú ∗ Tyrosinase từ thực vật Tyrosinase có hầu hết giới thực vật, nguyên nhân hình thành vết thâm rau bị dập nát Tyrosinase có cà chua khoai tây, có nhiều đậu, rau pina, táo, hoa atiso, lê, dâu, khoai lang, chè, thuốc lá, vỏ nho, đặc biệt nấm Nấm tự nhiên có nhiều chủng loại, chứa nhiều tyrosinase, đặc biệt nấm mỡ Agaricus bispora với hoạt lực cao [12] Một số lồi thực vật có hoạt tính tyrosinase : • Nấm mỡ : Agaricus bispora • Nấm sò : Pleurotus spp • Nấm kim châm Flammulia velutipes : • Nấm thể : Amanita muscaria • Cây thuốc lá: Nicotiana tabacum ∗ Tyrosinase từ động vật Tyrosinase tất tế bào động vật có chức hình thành sắc tố melanin xúc tác chuyển hóa L-tyrosine thành L-Dopa từ L-Dopa chuyển thành dopaquinon cuối tạo melanin Sắc tố định màu lông động vật màu tóc, màu mắt hay màu da người Tuy nhiên, nguồn thu không khả thi việc thu nhận khó khăn mà hiệu kinh tế lại không cao Các yếu tố rủi ro nguồn gốc, bệnh tật…vẫn mối quan tâm lớn nhà khoa học nhà sản xuất Nhưng có số nghiên cứu tách tinh chế tyrosinase động vật thân mềm chuột bạch, đặc biệt nghiên cứu tyrosinase từ chuột bạch, phục vụ cho y học chủ yếu lĩnh vực thần kinh học, điều trị bệnh Parkinson người [31] ∗ Tyrosinase từ vi sinh vật Vi sinh vật có khả sinh tổng hợp lượng lớn tyrosinase thời gian ngắn với điều kiện nuôi cấy đơn giản, rẻ tiền Do nguồn thu có triển vọng Các vi sinh vật nghiên cứu để tách thu tyrosinase gồm: vi khuẩn Rhizobium meliloti, Thermomicrobium roseum, Các loại xạ khuẩn Streptomyces glaucescens , Streptomyces lavendulae đặc biệt loại nấm mốc Aspergillus oryzae, Neurospora crassa, Tùy thuộc vào loài vi sinh vật (nấm mốc, vi khuẩn), điều kiện nuôi cấy, thành phần dinh dưỡng mơi trường, tyrosinase thu có hoạt lực tính chất tyrosinase khác 1.1.2 CẤU TẠO VÀ TÍNH CHẤT CỦA TYROSINASE 1.1.2.1 Cấu tạo không gian khối lượng phân tử tyrosinase Tyrosinase (còn gọi monophenol, o-diphenol oxygen oxidoreductase (EC.1.14.18.1)) protein kim loại (metal protein) đồng loại III Tyrosinase lồi khác có khối lượng phân tử khác nhau: tyrosinase Aspergillus oryzae có khối lượng phân tử 180kDa, chia làm tiểu phần, tiểu phần có khối lượng 67kDa; tyrosinase Agaricus bisporus có khối lượng phân tử 110130kDa, chia làm tiểu phần, hai tiểu phần có khối lượng 43kDa, hai tiểu phần có khối lượng 13kDa; Illex agentius: 140kDa, Ruditapes philippinarum: 80kDa, người: 66kDa, Streptomyces:30kDa, táo: 66kDa, khoai tây: 67kDa, cà chua: 6671kDa [7] Cấu trúc bậc tyrosinase chưa hoàn thiện Tuy nhiên cấu trúc tinh thể xây dựng dựa protein ORF378 ( ORF: open reading frame, gen orf có 378 nucleotid, đặt ngược chiều với gen tyrosinase tyrC gen tổng hợp melanin từ Streptomyces castaneoglobisrus HUT6202) Tyrosinase có cấu trúc xoắn ốc α gồm α2, α3,α6,α7, cịn có vào cấu trúc gấp nếp tờ giấy β [51] Màu xanh dương: ORF Màu đỏ: tyrosinase Hình 1.2 Cấu trúc xoắn ốc α tyrosinase Màu xanh: ion Cu 60 Trên thực tế thí nghiệm, pCR2.1- TYR5 pCR2.1-TYR3 cắt văng gen EcoR I, tiến hành gel kit QIAGEN, thu lại gen TYR5 TYR3 Hai gen TYR5 TYR3 thực phản ứng cắt với PflMI Ppu10I sử dụng enzym ligase để nối M M 1584bp 947bp A B Hình 3.7 Điện di đồ gel agarose 1% A Thôi gel thu TYR5 TYR3 Đường chạy M: Thang ADN chuẩn cắt Hind III EcoR I Đường chạy 1: ADN TYR5 Đường chạy 2: ADN TYR3 B Nối gen TYR5 TYR3 tạo TYR hoàn chỉnh Đường chạy M: Thang ADN chuẩn cắt Hind III EcoR I Đường chạy 1: ADN TYR Kết ảnh điện di cho thấy đoạn gen TYR5 TYR3 thu lại tinh sạch, sản phẩm nối có kích thước phù hợp với tính tốn lý thuyết (1620bp) 61 3.4 Biểu gen mã hoá tyrosinase Pichia pastoris X33 3.4.1 Thiết kế vector biểu tyrosinase Pichia pastoris X33 • Phân tích lựa chọn enzym cắt giới hạn Việc chọn vector biểu khâu quan trọng, đảm bảo mục đính hạn chế cơng đoạn sau lên men pPICZαA (Invitrogen) có kích thước 3,6kb, mang yếu tố α-factor, giúp protein tiết ngồi mơi trường, dễ thu nhận protein sau lên men Ngoài ra, pPICZαA thiết kế có sẵn polyhistidin, dễ dàng cho việc tinh protein sau Đoạn gen TYR phân tích tìm vị trí cắt khơng cắt enzym giới hạn phần mềm PCGENE Bảng 3.8 Các enzym cắt giới hạn không cắt gen TYR AatII Acc65I AclI AflII AgeI AhaIII AlwNI ApaI AscI AsuII AvrII BamHI BcgI BsaBI BsgI BsmFI BsmI Bsp120I BspHI BspM90I BspMII XmaIII XmnI BsrBI BssHII BstEII BstXI ClaI DraIII DrdI Eam1105I Ecl136II Eco47III Eco56I Eco57I EcoRI EcoRV EspI Esp3I FseI HgaI HgiJII HindIII HpaI KpnI MfeI MluI MslI NaeI NcoI NdeI NheI NotI NruI PacI PmaCI PmeI PshAI PstI PvuI PvuII RsrII SacI SacII SapI SauI ScaI SexAI SgfI SgrAI SnaBI SpeI SphI SplI SrfI Sse8387I SspI StuI SwaI Tth111I VspI XbaI XhoI Qua chọn EcoR I Xba I hai enzym cắt giới hạn khơng có vị trí cắt gen có vị trí cắt MCS vector pPICZαA 62 • Thiết kế mồi biểu TYR Pichia pastoris Trên kết chọn enzym cắt giới hạn, thiết kế mồi biểu cho gen TYR treo hai vị trí cắt EcoR I đầu 5’ Xba I đầu 3’, phù hợp đảm bảo cho việc thiết kế vector biểu Các thao tác thực phần mềm PCGENE Bảng 3.9 Mồi biểu cho TYR Tên mồi Trình tự Tm (oC) EcoR I TYRECOR 68 5’ GGAATTCATGGCCTCAGTCGAACCCATC 3’ Xba I TYRXBA 58 5’ CTCTAGACTATCTCATAGTTCCCACGGTAA 3’ Tiến hành PCR gen TYR với cặp mồi biểu Kết điện di gel agarose 1% sau: M Đường chạy M: Thang ADN chuẩn cắt 1584b Hind III EcoR I Đường chạy 1: Sản phẩm PCR mồi biểu Hình 3.8 Sản phẩm PCR với mồi biểu gel agarose 1% Trên điện di gel agarose, sản phẩm PCR với mồi biểu có băng so với ADN chuẩn có kích thước mong muốn Kết cho thấy việc thiết kế mồi biểu 63 thành công Sản phẩm PCR sử dụng để cài vào vector pPICZαA, thiết kế vector biểu pPICZαA-TYR, biểu Pichia pastoris Gen TYR vector pPICZαA đồng thời cắt enzym EcoR I Xba I, thực phản ứng ligation EcoR I Xba I Hình 3.9 Sơ đồ vector biểu gen TYR Pichia pastoris Vector biểu biến nạp vào E.coli Top 10F’ chọn lọc môi trường LB đặc có nồng độ Zeocin 25μg/ml 3.4.2 Biến nạp pPICZαA-TYR vào E.coli Top 10F’ Vector biểu biến nạp vào E.coli Top10F’ phương pháp sốc nhiêt Các khuẩn lạc chọn lọc môi trường LB đặc với nồng độ Zeocin 25μg/ml, khuẩn lạc mang gen sống sót Các khuẩn lạc ni mơi trường LB lỏng (Zeocin 25μg/ml) tách ADN plasmid 64 Hình 3.10 Khuẩn lạc Ecoli Top10F’ mang vector biểu 10 11 12 Hình 3.11 Điện di đồ AND plasmid biểu vào E.coli Top 10F’ Qua kết điện di, 12 khuẩn lạc chọn ngẫu nhiên đem nuôi tách ADN plasmid có khuẩn lạc (4,6,7,8,9,11,12) đường chạy chậm đường chạy khuẩn lạc khác (1,2,3,5,10) Theo nguyên tắc điện di khuẩn lạc có đường chạy chậm khuẩn lạc mang gen Tuy nhiên để kiểm tra 65 xác khuẩn lạc có mang gen mong muốn hay không, cần kiểm tra phản ứng cắt enzym giới hạn EcoR I Xba I M Đường chạy 1: Sản phẩm PCR Đường chạy M: Thang ADN chuẩn cắt 1584bp Hind III EcoR I Đường chạy 2: Sản phẩm cắt pPICZαA-TYR Hình 3.12 Sản phẩm cắt pPICZαA-TYR Qua ảnh điện di gel agarose thấy plasmid chọn lựa mang gen mong muốn, sản phẩm cắt cắt hồn tồn Tiến hành giải trình tự pPICZαA-TYR với mồi 5’ AOX1 3’ AOX1 Kết trình tự cho thấy việc thiết kế vector biểu pPICZαA-TYR thành công 3.4.3 Biến nạp pPICZαA-TYR vào Pichia pastoris X33 P.pastoris X33 tế bào chủ nấm men có nhiều ưu điểm việc nghiên cứu chủng tái tổ hợp • Cắt mở vòng vector biểu Sac I Vector pPICZαA pPICZαA-TYR cắt mở vòng enzym cắt giới hạn Sac I, phản ứng tiến hành 370C, qua đêm Sản phẩm cắt kiểm tra với lượng nhỏ điện di gel agarose tủa lại ethanol ADN hòa 10μl nước khử ion kiểm tra lại điện di gel agarose 66 Đường chạy 1: pPICZαA Đường chạy 2: pPICZαA mở vòng Đường chạy 3: pPICZαA-TYR Đường chạy 4: pPICZαA-TYR mở vòng Hình 3.13 Sản phẩm cắt mở vịng Qua ảnh điện di thấy giếng (sản phẩm cắt) xuất băng nhất, chạy chậm so với băng giếng 1và (vector gốc), phù hợp với lý thuyết ADN dạng siêu xoắn chuyển động nhanh dạng thẳng điện di Điều có nghĩa vector mở vịng • Biến nạp vào Pichia pastoris phương pháp xung điện Vector biến nạp vào Pichia pastoris X33 phương pháp xung điện, theo kit hãng Invitrogen Chủng Pichia pastoris X33 nuôi cấy môi trường YPD, chuẩn tế bào khả biến biến nạp Các khuẩn lạc chọn lọc môi trường YPDSZ đặc (nồng độ Zeocin 100μg/ml) sau 2-3 ngày Kết biến nạp xuất khuẩn lạc với vector pPICZαA khuẩn lạc với vector pPICZαA-TYR Điều cho thấy q trình biến nạp kém, so ngun nhân chủng yếu vector không vào tế bào chủ nên bị loại chất 67 chọn lọc Zeocin Các khuẩn lạc mọc ít, chúng tơi tiến hành ni môi trường biểu BMGY ( Buffered glycerol complex medium) BMMY (Buffered methanol complex medium) để biểu hoạt tính tyrosinase Chủng ni 30oC, lắc 200 vịng/phút Tuy nhiên, sau thời gian ni qua đêm kiểm tra khuẩn lạc không phát triển Để kiểm tra tiến hành nuôi khuẩn lạc nói trên mơi trường YPD YPDSZ Sau thời gian nuôi qua đêm, khuẩn lac nuôi cấy môi trường YPD phát triển mạnh khuẩn lạc nuôi cấy môi trường YPDSZ Hiện kiểm tra lại phương pháp kĩ thuật thực Vì thời gian có hạn nên luận văn chưa thể hoàn thiện, tạm dừng khâu biến nạp vào tế bào chủ 68 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Tách dịng thành cơng đoạn gen TYR (1620bp) mã hóa tyrsosinase từ Aspergillus oryzae TP01 Thiết kế thành công vector biểu pPICZαA-TYR (5,2kb) mang gen TYR mã hóa tyrosinse từ Aspergillus oryzae TP01 KIẾN NGHỊ Tiếp tục biến nạp vector biểu vào Pichia pastoris X33, tạo chủng tái tổ hợp mang gen mã hóa tyrosinase Hồn thiện tối ưu hóa môi trường nuôi cấy cho chủng tái tổ hợp mang gen mã hóa tyrosinase Xác định đặc tính tyrosinase tái tổ hợp Nghiên cứu ứng dụng tyrosinase tái tổ hợp 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998, Sinh học phân tử, NXB GD HN Khuất Hữu Thanh, 2003, Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen, NXB KHKH HN Lê Đình Lương, 2001, Nguyên lý kỹ thuật di truyền, NXB KHKT HN Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nơng Văn Hải, Trương Nam Hải, Lê Quang Huấn, 2003, Áp dụng kỹ thuật phân tử nghiên cứu tài nguyên sinh vật Việt Nam, NXB KHKT HN, 112-170 TÀI LIỆU TIẾNG ANH Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, 2004, Current protocols in molecular biology, Wiley, New York Biochemistry Laboratory I, 2005, Effect of Cationic metals on mushroom Tyrosinase activity, Biochemistry laboratory I Celia W.G Van Gelder, William H.Flurkey and Harry J.Wicherst, 1997, Sequence and structural features of plant and fungal Tyrosinse, Phv!ochmGtr, Vol 45 No 7, pp 1309- 1323 Chiruvolu V, Cregg JM, Meagher MM, 1997, Recombinant protein production in an alcohol oxidase-defective strain of Pichia pastoris in fed-batch fermentations, Enzym Microb Technol 21, 77-283 Chomczynski P, Sacchi N, 1987, Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocynate-phenol-cloroform extraction, Anal Biochem 162, 156-159, RNA 43 10 Chunhua Shi, Ya Dai, Bingle Xia, Xiaolong Xu, Yongshu Xie and Qingliang Liu, 2001, The purification and spectral properties of polyphenol oxidase I from Nicotiana tabacum, Plant Molecular Biology reporter 19, 381-381 11 Easyselect Pichia expression kit, version G, A manual of methods for expression of recombinant protein using pPICZ and pPICZα in Pichia pastoris, Invitrgene 70 12 Emmilia Seinheimo, Deirdre NiEidhin, Charlotte Steffensen, Jacob Nielsen, Anne Lomascolo, Sonia Halaouli, Eric Record, David O’Beirne, Johanna Buchert, Kristiina Kruus, 2007 Comparison of the characteristics of fungal and plant tyrosinases, Journal of Biotechnology 130, 471–480 13 Erhan Astarci, 2003, Production and biochemical characterization of Polyphenol oxidase from Thermomyces Lanuginosus, A thesis submitted to the Granduate scholl of natural and applied sciens of the Middle East Technical University 14 Gelin Wang , Aberrahmane Aazaz, Zhenrong Peng, Ping Shen, 2000, Cloning and overexpression of a tyrosinase gene mel from Pseudomonas maltophila, FEMS Microbiology Letters 185, 23-27 15 George A Somkuti, Daniel It Y Solaiman and Dannim H Steinberg, 1993, Cloning of a Tyrosinase gene in Streptococcus Thermophilus, Biotechnology letter Vol15 No.8, pp.773-778 16 Gilberto Hintermann, Magdalena Zatchej, and Ralf Hiitter, 1985, Cloning and expression of the genetically unstable tyrosinase structural gene from Streptomyces glaucescens, Mol Gen Genet 200, 422-432 17 H Ishida, K Matsumura, Y Hata, A Kawato, K Suginami, Y Abe, S Imayasu, E Ichishima, 2001, Establishment of a hyper-protein production system in submerged Aspergillus oryzae culture under tyrosinase-encoding gene (melO) promoter control, Appl Microbiol Biotechnol 57, 131–137 18 H J Wichers, K Recourt, M Hendriks, C E M Ebbelaar, G Biancone, F A Hoeberichts, H Mooibroek, C Soler-Rivas, 2003, Cloning, expression and characterisation of two tyrosinase cDNAs from Agaricus bisporus, Appl Microbiol Biotechnol 61, 336–341 19 Harald Clausa, Heinz Decker, 2006, Bacterial tyrosinases, Systematic and Applied Microbiology 29, 3–14 20 Hinggins DR, Crgg JM, 1998, Pichia Protocol, Humana Press, Totowa 71 21 Hiroshi Obata, Hiroshi Ishida, Yoji Hata, Akitsugo Kawto, Yasuchia Abe, Takeshi Akao, Osamu Akita and Eiji Ichishima, 2004, Cloning of a novel Tyrosinase-encoding gene (mel B) from Aspergillus oryzae and its overexpression in solid-state culture (Rice Koji), Journal of Bioscience and bioengineering, vol 97, No6, 400-405 22 Huber.M and lerch.K, 1998, Identification of two histidines as copper ligands in Streptomyces glaucescens tyrosinase Biochemistry 27, 5610-5615 23 Ikram-ul-Haq, Sikander Ali, 2006, Mutation of Aslergillus oryzae for improved prduction of 3-4 Dihydroxy phenyl-L Alanine (L-Dopa_ from LTyrosinse Biotechonoly research centre, Department of Botany Goverment College University Lahore, Pakistan 24 K S Abhijith & P V Sujith Kumar & M A Kumar & M S Thakur, 2007, Immobilised tyrosinase-based biosensor for the detection of tea polyphenols, Anal Bioanal Chem 389,2227–2234 25 Katrin Streffer, 2002, Highly sensitive measurements of substrates and inhibitor on the basis of tyrosinase sensors and recycling systems Mathematisch Naturwissenschftlichten Fakultat der Universitat Postdam 26 Ken -ichi Nihei and Isao Kubo, 2003, Identification of Oxidation Product of Arbutin in Mushroom Tyrosinase Assay System, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 13, 2409–2412 27 Kouhei Nagai, Masato Yano, Koichi Morimoto, Hiroshi Miyamoto, 2007, Tyrosinase localization in mollusc shells, Comparative Biochemistry and Physiology, Part B 146, 207–214 28 Kwang-Hoon Kong, Nin-PyoHong, Sang-Sook Choi, Yong-Tare Kim and Sung-Hye Cho, 2000, Purification and characterization of a highly stable tyrosinase from Thermonicrobium roseum, Biotechnol Apple biochem 31, 113-118 72 29 Lukas, A.Mueller, Ursula Hinzs and Jean-Pierre Zryd, 1996, Characterization of a Tyrosinase from amanita muscaria involved in Betalain biosynthsis, Phytochemistry, vol 42, 1511-1515 30 Mahmud Tareq Hassan Khan, M Iqbal Choudhary, Atta-ur-Rahman, Reyhan P Mamedova, Manzura A Agzamova, Mukhlis N Sultankhodzhaev and Mahamed I Isaev, 2006, Tyrosinase inhibition studies of cycloartane and cucurbitane glycosides and their structure–activity relationships , Bioorganic & Medicinal Chemistry 14, 6085–6088 31 Maki Goto, Kazuko C Sato-Matsumura, Daisuke Sawamura, Koichi Yokota, Hideki Nakamura, Hiroshi Shimizu, 2004, Tyrosinase gene analysis in Japanese patients with oculocutaneous albinism, Journal of Dermatological Science 35, 215—220 32 MarloesSchurink , Willem J.H van Berkel, Harry J Wichers , Carmen G Boeriu , 2007, Novel peptides with tyrosinase inhibitory activity, peptides 28, 485-495 33 Natividad Cabrera-Valladares, Alfredo Mart´ınez, Silvia Pi˜nero, Victor H Lagunas-Mu˜noz, Raunel Tinoco, Ram´on de Anda, Rafael V´azquezDuhalt, Francisco Bol´ıvar, Guillermo Gosset, 2006, Expression of the melA gene from Rhizobium etli CFN42 in Escherichia coli and characterization of the encoded tyrosinase, Enzyme and Microbial Technology 38, 772–779 34 Nelson Durán , Maria A Rosa , Alessandro D’Annibale, Liliana Gianfreda, 2002, Applications of laccases and tyrosinases (phenoloxidases) immobilized on different supports: a review, Enzyme and Microbial Technology 31, 907–931 35 Patricia Yumi Kohashi, Takanori Kumagai, Yasuyuki Matoba, Aiko Yamamoto, Masafumi Maruyama, and Masanori Sugiyama, 2004, An efficient method for the overexpression and purification of active 73 tyrosinase from Streptomyces castaneoglobisporusq, Protein Expression and Purification 34, 202–207 36 prof.Dr.Ir.L.Speddlman, 2005, Molecular analysis and improvement of protein production by Aspergillus oryzae grown on solid substates and submerged fermentation, Universiteit van nottingham UK 37 Prof.GW.Canters, 2005, Structure and mechanism of the Type-3 copper protein tyrosinase Armand Wilbrandt Jannes Wichert Tepper 38 Ralph Rapley, 2000, The nucleic acid protocols handbook, Humana Press, Totowa 39 Robert E Farrell, Jr, 2005, RNA methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and Characterization, Academic Press 40 S Halaouli, M Asther, J.C Sigoillot, M Hamdi and A Lomascolo, 2005, Fungal tyrosinases: new prospects in molecular characteristics, bioengineering and biotechnological, applications, Journal of Applied Microbiology ISSN 1364-5072 41 Sears IB, O’Connor J, Rossanese OW, Glick BS, 1998, A versatile set of vectors for constitutive and regulated gene expression in Pichia pastoris, yeast 14, 783-790 42 Sergey Shleeva,b, Jan Tkaca,c, Andreas Christensona, Tautgirdas Ruzgasa, Alexander I Yaropolovb, James W Whittakerd, Lo Gortona, 2005, Direct electron transfer between copper-containing proteins and electrodes, Biosensors and Bioelectronics 20, 2517–2554 43 Sue Macauley-Patrick, Mariana LF, Brian MN, Linda MH, 2005, Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system Yeast 22, 249-270 44 Sukanta Mandal, Rabindranath Mukherjee , 2006, A new tyrosinase model with 1,3-bis[(2-dimethylaminoethyl)iminomethyl]benzene: copper(I) and phenoxo/hydroxo-bridged complexesInorganica Chimica Acta 359, 4019–4026 Binuclear dicopper(II) Tóm tắt chu trình nhiệt : 74 45 SuperScriptTM first-stand synthesis system for RT-PCR, version E, 2003, Invitrogen 46 TA cloning ® kit, version V, 2004, Invitrogen 47 Tetchuchi Naraka, Hidemitsu Uchisawa, Haruhide Mori, Hajime Matsue, Seiya Chiba and Atsuo Kimura, 2003, Purification, characterization and molecular cloning of tyrosinase from the cephalopod mollusk, illex argentinus, Eur.J.Biovhem 270, 4026-4038 48 Toshikatsu Hirahara, Sueharu Horinouchi, Teruhiko Beppu,1993,Cloning, nucleotide sequence, and overexpression in Escherichia coil of the ptyrosinase gene from an obligately symbiotic thermophile Symbiobacterium thermophilum, Appl Microbiol Biotechnol 39, 341-346 49 Werner E.G Muăller, Sanja Perovic, Heinz C Schroăder, Hans J Breter, 2004, Oxygen as a morphogenic factor in sponges: expression of a tyrosinase gene in the sponge Suberites domuncula, Micron 35, 87–88 50 Yasunori Fujita, Yousuke Uraga, Eiji Ichisima, 1995, Molecular cloning and nucleotide sequence of the protyrosinase gene, melO, from Aspergillus oryzae and expression of the gene in yeast cells, Biochimica et Biophysica Acta 1261, 151-154 51 Yasuyuki Matoba, takanori Kumagai, Aiko Yamamoto, Hironari Yoshitsu, and asanori Sugiyama, 2006, Crystallographic evidence that the dinuclear copper center of tyrosinase is flexible during catalysis, The journal of biological chemistry, Vol 281, No 13, 8981-8990 ... Aspergillus oryzae TP01 - Tách dịng giải trình tự đoạn gen mã hóa cho tyrosinse từ Aspergillus oryzae TP01 - Tạo vector biểu cho tyrosinase nấm men Pichia pastoris - Biểu tyrosinase Pichia pastoris... dụng để tiến hành tách dòng gen 3.3 Kết tách dòng gen mã hoá tyrosinase 3.3.1 Kết gắn vào vector pCR 2.1 biến nạp Trong trình thiết kế mồi tổng hợp TYR5 TYR3, hai đầu đoạn gen gắn đuôi polyA,... 51 3.3.4 Kết giải trình tự gen máy giải trình tự gen tự động ABI 3100 52 3.4 Biểu gen mã hoá tyrosinase Pichia pastoris X33 61 3.4.1 Thiết kế vector biểu tyrosinase Pichia pastoris X33