Nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gene kháng nguyên độc tố bền nhiệt stb của e coli trong tế bào vi khuẩn e coli bl21 (de3) và tối ứu các điều kiện biểu hiện

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Các số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Các thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Thành Phố Huế, tháng năm 2016 Tác giả luận văn Lê Minh Tuấn ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Trường Đại Học Nông Lâm Huế, Phịng đào tạo sau đại học, Khoa Chăn ni thú y thầy giáo nhiệt tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức khoa học kỹ thuật cho lớp cao học khóa 20A chuyên ngành thú y trường Đại học Nông Lâm Huế Tôi xin chân thành cảm ơn đặc biệt đến PGS TS Đinh Thị Bích Lân tận tình hướng dẫn để tơi hồn thành đề tài Tôi xin cảm ơn Chi cục Chăn nuôi Thú y Thừa Thiên Huế, cán Phịng thí nghiệm Miễn dịch học vắc xin - Viện Công nghệ sinh học, Đại học Huế, Trạm Chẩn đoán xét nghiệm điều trị bệnh động vật giúp đỡ tạo điều kiện cho suốt thời gian thực đề tài Đề tài hồn thành hỗ trợ kinh phí từ đề tài cấp Bộ PGS TS Đinh Thị Bích Lân làm chủ nhiệm (Mã số: B2016- DHH-25) Tôi xin chân thành cảm ơn bạn đồng nghiệp gần xa giúp đỡ động viên suốt thời gian thực tập Thành phố Huế, tháng năm 2016 Lê Minh Tuấn iii TÓM TẮT E Coli nhóm vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy lợn Chúng có khả sản sinh hai loại độc tố đường ruột : độc tố không bền nhiệt (LT) độc tố bền nhiệt (ST) Độc tố ST có hai loại STa STb Tuy nhiên chế gây tiêu chảy STb chưa rõ Nghiên cứu tạo dòng biểu gene độc tố có độc tố STb E coli gây bệnh tiêu chảy lợn để làm nguyên liệu chế tạo vắc xin, kháng thể, chế phẩm sinh học dùng phòng, trị bệnh tiêu chảy lợn có ý nghĩa mang tính cấp thiết, giảm thiệt hại kinh tế ngành chăn ni lợn nói chung gia súc nói riêng Trong nghiên cứu này, gene estB mã hoá cho kháng nguyên STb phân lập phản ứng PCR, tạo dịng biểu thành cơng gene estB vào hai vector pGEM-T easy pET200/D-TOPO biến nạp vào hai tế bào vật chủ E coli TOP10 E coli BL21 (DE3) Trên đĩa petri, khuẩn lạc xanh trắng xuất riêng rẽ việc lựa chọn khuẩn lạc trắng để tách plasmid loại bỏ phần lớn trường hợp không mong muốn tất khuẩn lạc trắng mang vector plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gene estB Để khẳng định cách chắn hơn, chúng tơi cần chọn lọc khuẩn lạc dương tính (khuẩn lạc màu trắng) để kiểm tra diện gene estB kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu cặp mồi M13 Sản phẩm gắn ủ 4°C qua đêm Sản phẩm sau biến nạp vào tế bào khả biến E.coli chủng TOP10 phương pháp sốc nhiệt 42°C 60 giây Sau biến nạp, nhờ trợ giúp máy tổng hợp tế bào vi khuẩn, plasmid tái tổ hợp tạo với số lượng lớn Dịch tế bào được nuôi cấy cách dàn môi trường LB (1% tryptone; 0,5% dịch chiết nấm men; 1% NaCl; 1,5% agar, pH 7,0) có thạch, có bổ sung kháng sinh 100 µg/mL ampicillin, 100 mM IPTG 20 mg/mL X-Gal Trong môi trường chọn lọc này, khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp có màu trắng khuẩn lạc mang vector pGEM®-T Easy khơng mang gene estB có màu xanh Tế bào E coli BL21 tái tổ hợp sinh trưởng tốt môi trường TB với tỷ lệ tiếp giống 2% (giống hoạt hóa sau ni), lắc 220 vịng/phút Gene estB biểu tốt tế bào E coli BL21 môi trường YJ, IPTG (0,8 mM), thời gian 10 giờ, thời điểm cảm ứng OD600 = 0,6, nhiệt độ 30-37°C iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .i LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT iii MỤC LỤC iv DANH MỤC VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ viii MỞ ĐẦU 1 TÍNH CẤP THIẾT MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỂN 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn .3 Chương TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU .4 1.1 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn E coli gây lợn 1.1.1 Nghiên cứu nước 1.1.2 Tình hình nghiên cứu nước ngồi MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH VẬT HỌC CỦA VI KHUẨN E COLI 1.2.1 Đặc điểm vi khuẩn E coli .10 1.2.2.Phân loại .10 1.2.3 Đặc điểm hình thái vi khuẩn E coli 11 1.2.4 Đặc tính ni cấy vi khuẩn E coli 11 1.2.5 Đặc tính sinh hóa vi khuẩn E coli 12 1.2.6 Sức đề kháng vi khuẩn E coli 13 1.2.7.Cấu trúc kháng nguyên vi khuẩn E coli 13 1.2.8 Khả sản sinh độc tố đường ruột 17 Chương MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 v 2.1 MỤC TIÊU CỤ THỂ 20 2.2 PHẠM VI, ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .20 2.2.1 Địa điểm nghiên cứu 20 2.2.2 Đối tượng nghiên cứu 20 2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.3.1 Nội dung nghiên cứu 20 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu .21 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP E COLI TỪ PHÂN LỢN 34 3.2 KẾT QUẢ PHÂN LẬP GENE estB .34 3.3 KẾT QUẢ TẠO DÒNG GENE .36 3.4 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN 39 3.5 NUÔI CẤY VI KHUẨN 41 3.6 ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ LÊN SINH TRƯỞNG CỦA TẾ BÀO E COLI TÁI TỔ HỢP .41 3.6.1 Thành phần môi trường .41 3.6.2 Tỷ lệ tiếp giống 42 3.6.3 Tốc độ lắc 43 3.7 ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ LÊN BIỂU HIỆN CỦA TẾ BÀO E COLI TÁI TỔ HỢP .44 3.7.1 Thời gian cảm ứng .44 3.7.2 Nồng độ chất cảm ứng 45 3.7.3 Thành phần môi trường biểu .46 3.7.4 Mật độ tế bào trước bổ sung chất cảm ưng 47 3.7.5 Ảnh hưởng nhiệt độ cảm ứng .48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .49 KẾT LUẬN .49 KIẾN NGHỊ .49 TÀI LIỆU THAM KHẢO .50 vi DANH MỤC VIẾT TẮT Amp ADN YJ LB SOB SOC TB SDS PC NC PCR OD IPTG v/v kDa E coli DNA RNA bp cDNA E coli kDa PCR SDS - PAGE EPEC ETEC EIEC EHEC EAEC Ampicillin Acid deoxyribonucleic Yang Jijian Luria Bertani Super Optimal Broth Super Optimal Broth with catabolic repressor Terrific broth Sodium Dodecyl Positive Control (đối chứng dương tính) Negative Control (đối chứng âm tính)Sulfate Polymerase Chain Rection Optical Density Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside volume per volume (thể tích/thể tích) Kilodalton Escherichia coli Deoxyribo Nucleic Acid Ribonucleic Acid base pair complement Deoxyribo Nucleic Acid Escherichia coli kilodalton Polymerase Chain Reaction Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis enteropathogenic E coli enterotoxigenic E coli enteroinvasive E coli enterohaemorrhagic E coli enteroaggregative E coli vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các chủng E coli gây bệnh lợn (Fairbrother, 1994) .8 Bảng 2.1 Thành phần hóa chất cho q trình chuẩn bị gel polyacrylamide 15% 32 viii DANH MỤC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ Hình 2.1 Quy trình phân lập vi khuẩn E.coli 23 Hình 2.2 Sơ đồ thí nghiệm khả sinh trưởng E coli tái tổ hợp 29 Hình 2.3 Sơ đồ thí nghiệm tối ưu biểu gene kháng nguyên độc tố tái tổ hợp STb.30 Hình 3.1 Ảnh phân lập E coli môi trường MacConkey .34 Hình 3.2 Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gene estB gel agarose 2% .35 Hình 3.3 Kết biến nạp môi trường chọn lọc 36 Hình 3.4 Ảnh điện di sản phẩm plasmid từ dịng dương tính kết PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gene estB từ khuôn mẫu DNA plasmid tái tổ hợp thu gel agarose 2% 37 Hình 3.5 Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mồi M13 gel agarose 2% 38 Hình 3.8 Kết biến nạp môi trường chọn lọc 40 Hình 3.9 Ảnh điện di thăm dò khả biểu kháng nguyên tái tổ hợp STb khả liên kết đuôi 6xHis với phối tử Ni2+ gel SDS – PAGE 15% .40 Hình 3.10 Đường cong sinh trưởng chủng E coli BL21 (DE3) mang gene estB mã hóa tạo kháng nguyên STb 41 Hình 3.11 Ảnh hưởng thành phần môi trường lên sinh trưởng chủng E coli BL21 (DE3) tái tổ hợp 42 Hình 2.12 Ảnh hưởng tỷ lệ tiếp giống lên sinh trưởng chủng E coli BL21 (DE3) tái tổ hợp .43 Hình 3.13 Ảnh hưởng tốc độ lắc lên sinh trưởng chủng E coli BL21 (DE3) tái tổ hợp .43 Hình 3.14 Ảnh điện di thăm dị thời gian cảm ứng biểu kháng nguyên tái tổ hợp STb gel 15% 44 Hình 3.16 Ảnh điện di thăm dị thành phần mơi trường tối ưu biểu gene kháng nguyên tái tổ hợp STb gel 15% 46 Hình 3.17 Ảnh điện di thăm dò thời điểm bổ sung chất cảm ứng tối ưu biểu gene kháng nguyên tái tổ hợp STb gel 15% 47 MỞ ĐẦU TÍNH CẤP THIẾT Chăn ni gia súc, gia cầm từ lâu đóng góp vị trí vơ quan trọng đời sống lồi người nói chung đời sống người Việt Nam nói riêng Ổ Việt Nam chăn ni gia súc, gia cầm nguồn cung cấp thực phẩm chủ yếu phục vụ nhu cầu người dân, hàng năm cung cấp khoảng 30% giá trị sản suất ngành nông nghiệp Tuy nhiên, chăn nuôi lợn theo hướng công nghiệp nhiều vấn đề nan giải mà lên tình hình dịch bệnh sử dụng thuốc điều trị bệnh sở chăn nuôi Trong đó, bệnh tiêu chảy E.coli gây phổ biến gây thiệt hại kinh tế đáng kể Tiêu chảy lợn nhiều nguyên nhân, nguyên nhân vi khuẩn đường ruột E coli gây Dựa vào khả gây tiêu chảy, vi khuẩn E.coli chia thành loại gồm: E coli gây bệnh đường ruột (enteropathogenic E coli-EPEC), E.coli sinh độc tố ruột (enterotoxigenic E coli-ETEC), E coli xâm nhập ruột (enteroinvasive E.coliEIEC), E.coli gây xuất huyết ruột (enterohaemorrhagic E.coli-EHEC) E.coli bám dính đường ruột (enteroaggregative E coli-EAEC) (Kim cs, 2007) Độc tố đường ruột yếu tố độc lực quan trọng vi khuẩn E coli gây bệnh tiêu chảy lợn Độc tố đường ruột làm thay đổi nước, chất điện giải ruột non dẫn tới tiêu chảy Có loại độc tố đường ruột vi khuẩn thuộc nhóm ETEC xác định độc tố không chịu nhiệt (LT) độc tố chịu nhiệt (ST) Bên cạnh đấy, vi khuẩn thuộc nhóm EAEC sản sinh độc tố chịu nhiệt EAST1 (Enteroaggregative heat-stable enterotoxin 1) xem nguyên nhân gây tiêu chảy gia súc (Phùng khắc Cam cs, 2003) Độc tố chịu nhiệt (độc tố ST) đoạn peptide có trọng lượng phân tử nhỏ, sản sinh chủng vi khuẩn thuộc nhóm ETEC Độc tố chịu nhiệt độ 1000C 15 phút Độc tố ST chia thành nhóm STa STb, khác cấu trúc chế hoạt động (Sack, 1975; Sherman cs, 1983) Độc tố STb chuỗi polypeptide sản sinh chủ yếu chủng vi khuẩn ETEC phân lập từ lợn (Nataro cs, 1998) Độc tố STb gồm có 48 axít amin, có axít amin Cystein tạo thành cầu nối disulfide Cys10 – Cys48 Cys21 – Cys36 Các cầu nối có vai trị giúp cho STb bền vững chu chất (Fujii cs, 1991) Gene mã hóa cho độc tố ST estA estB Gene estA tìm thấy chủ yếu plasmid mang nhiều gene mã hóa yếu tố độc lực khác chủng ETEC yếu tố xâm nhiễm, kháng kháng sinh, sản sinh colicin (Nataro cs, 1998) Tương tự, gene estB tìm thấy plasmid mang nhiều yếu tố độc lực khác độc tố LT, STa, kháng kháng sinh, yếu tố xâm nhiễm (Harnett cs, 1985) Độc tố ST tổng hợp tế bào chất tiền polypeptide Đoạn tiền peptide mang tín hiệu vận chuyển bị phân cắt chuỗi polypeptide vận chuyển từ tế bào chất đến periplasm thông qua hệ thống vận chuyển SecA Trong periplasm, cầu nối disulfide độc tố hình thành trước độc tố giải phóng khỏi tế bào vi khuẩn qua hệ thống TolC tác động protein DsbA (periplasmic oxidoreductase protein) (Dubreuil cs, 1997 2006a) Áp dụng công nghệ DNA công nghệ protein tái tổ hợp để sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp tạo sản phẩm có khả chống lại đồng thời nhiều chủng E.coli gây bệnh tiêu chảy lợn sau cai sữa Đây lợi phương pháp tiếp cận có áp dụng cơng nghệ cao so với phương pháp tách chiết kháng nguyên truyền thống Nước ta quốc gia có kinh tế dựa chủ yếu lĩnh vực nơng nghiệp, chăn ni phận quan trọng Chăn nuôi lợn theo quy mô công nghiệp bắt đầu phát triển mang lại hiệu kinh tế lớn Tuy nhiên, giống quốc gia khác giới, tình hình dịch bệnh tiêu chảy thường xảy đàn lợn con, gây tổn thất không nhỏ cho người chăn nuôi Vì vậy, vấn đề liên quan đến bệnh chủng E coli gây bệnh, yếu tố kháng nguyên gây độc tố nghiên cứu như: Tìm hiểu vai trị E coli bệnh phân trắng lợn vắc xin dự phòng, xác định yếu tố độc lực kỹ thuật PCR, nghiên cứu phân lập xác định độc tố đường ruột chủng E coli gây bệnh tiêu chảy cho lợn con, nghiên cứu khả gây bệnh chủng E coli lợn ngày tuổi thiếu sữa năm tỉnh miền Bắc Việt Nam Xuất phát từ yếu tố trên, với nhu cầu ngày lớn ngành chăn nuôi, tiến hành nghiên cứu đề tài " Nghiên cứu tạo dòng biểu gene kháng nguyên độc tố bền nhiệt STb E coli tế bào vi khuẩn E coli BL21 (DE3) tối ưu điều kiện biểu hiện" MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI Nghiên cứu phân lập gene estB , tạo dịng, biểu khảo sát điều kiện thích hợp để sản xuất số lượng lớn kháng nguyên tái tổ hợp STb, làm sở cho việc sản xuất ứng dụng việc phòng trị bệnh E coli gây lợn bị bệnh tiêu chảy 44 Số liệu hình 3.13 cho thấy mật độ tế bào tăng dần theo tốc độ lắc đạt cực đại tốc độ 200 vòng/phút, giá trị OD600 đo 2,806 sau nuôi cấy chủng E coli mang gene mã hóa kháng nguyên độc tố STb Tuy nhiên, mật độ tế bào bắt đầu giảm dù tốc độ lắc tiếp tục tăng (từ 220 vịng/phút đến 250 vịng/phút) Điều tốc độ lắc nhanh làm môi trường nuôi cấy bị tạo bọt nhiều, ảnh hưởng đến hô hấp tế bào Tốc độ lắc 200 vòng/phút nhiều tác giả sử dụng nhân giống E coli để sản xuất protein tái tổ hợp sản xuất interleukin-2 người (Kim cs, 2000); aconitase nấm men (Gupta cs, 2009) hay protease B subtilis (Loc cs, 2011) 3.7 ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ LÊN BIỂU HIỆN CỦA TẾ BÀO E COLI TÁI TỔ HỢP 3.7.1 Thời gian cảm ứng Sau bổ sung IPTG vào môi trường, protein quan tâm bắt đầu tổng hợp thời gian cảm ứng quan trọng sản xuất protein tái tổ hợp Trong nghiên cứu chúng tôi, thời gian cảm ứng thích hợp cho biểu khảo sát cách phân tích mẫu sau giờ, thời gian khảo sát từ đến 14 giờ, nồng độ IPTG 1,0 mM, lắc 200 vòng/phút 37°C Kết thể hình 3.14 cho thấy nồng độ kháng nguyên độc tố tái tổ hợp bắt đầu tổng hợp sau cảm ứng tăng dần 10 giờ, sau nều tăng thời gian nồng độ kháng nguyên độc tố không tổng hợp thêm có khơng đáng kể Do vậy, kết cảm ứng 10 chọn cho thí nghiệm nghiên cứu biểu sau kDa 25 15 STb 10 M NC1 NC2 10 12 14 Hình 3.14 Ảnh điện di thăm dò thời gian cảm ứng biểu gene kháng nguyên tái tổ hợp STb gel 15% M: khối lượng thang chuẩn protein (10-170 kDa, Bio-Base) NC1: tế bào E coli không mang vector tái tổ hợp NC2: Tế bào E coli tái tổ hợp không bổ sung chất cảm ứng IPTG sinh trưởng 37oC 2, 4, 6, 8, 10, 12 14: thời gian cảm ứng IPTG 45 Hệ thống vector pET200/D-TOPO tế bào E coli BL21(DE3) Nathan cs (2006) dùng để biểu gene peptinase M23B Burkholderia pseudomallei, tác giả sử dụng nồng độ chất cảm ứng IPTG mM 30ºC thu protein có khối lượng phân tử 36 kDa Khảo sát cho thấy, biểu gene mạnh sau cảm ứng (Li cs, 2007) Năm 2013, Lộc cs thành cơng tạo dịng biểu gene mã hóa kháng nguyên bám dính F107-C, K88-1NT sử dụng hệ thống vector biểu pET200/D-TOPO tế bào E coli BL21 Kết phân tích cho thấy protein F107C có khối lượng 22 kDa, biểu mạnh sau 14 cảm ứng 37°C với nồng độ IPTG 0,75 mM protein K88-1NT có khối lượng 31 kDa, biểu mạnh sau cảm ứng 37°C với nồng độ IPTG 0,5 mM (Jones cs, 1972) 3.7.2 Nồng độ chất cảm ứng Đối với biểu vector mang promoter T7, nồng độ IPTG phải tối ưu ảnh hưởng lớn đến biểu protein tái tổ hợp làm giảm sinh trưởng tế bào Chúng nghiên cứu ảnh hưởng IPTG nồng độ khác lên sản xuất kháng nguyên độc tố tái tổ hợp STb Nồng độ IPTG từ 0,2 mM đến 1,4 mM sử dụng để cảm ứng lên biểu gene estB So sánh độ đậm băng SDS-PAGE cho thấy nồng độ IPTG 0,8 mM thích hợp cho biểu cao gene estB (Hình 3.15) kDa 25 15 10 STb M NC1 NC2 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 mM Hình 3.15 Ảnh điện di thăm dị nồng độ chất cảm ứng IPTG lên biểu kháng nguyên tái tổ hợp STb gel 15% M: khối lượng thang chuẩn protein (10-170 kDa, Bio-Base) NC1: tế bào E coli không mang vector tái tổ hợp NC2: Tế bào E coli tái tổ hợp không bổ sung chất cảm ứng IPTG sinh trưởng 37oC 0,2; 0,4; 0,6, 0,8; 1,0; 1,2; 1,4: nồng độ chất cảm ứng IPTG Flick cs (2004) biểu thành cơng gene mã hóa protein màng PfEMP1của Plasmodium falciparum nằm plasmid tái tổ hợp pGEX4T-1 tế 46 bào E coli BL21-CodonPlus-RIL Các tác giả tiến hành biểu 37ºC nồng độ chất cảm ứng IPTG chọn 0,1 mM Nghiên cứu thay đổi thời điểm cảm ứng liên quan đến mật độ tế bào cải thiện khả biểu protein tái tổ hợp (Goedel cs, 1991) 3.7.3 Thành phần môi trường biểu Các loại môi trường tổng hợp thường sử dụng nuôi cấy sinh khối nuôi cấy sản xuất protein tái tổ hợp Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cho thấy mơi trường thích hợp cho nhân giống sinh khối khơng thích hợp cho sản xuất protein tái tổ hợp (Lee cs, 2000) Vì thế, chúng tơi thăm dị số mơi trường để sản xuất kháng nguyên độc tố tái tổ hợp STb Kết trình bày hình 3.16 cho thấy môi trường nghiên cứu, môi trường YJ thích hợp cho sản xuất protein kháng nguyên STb, mơi trường M9ZB cải tiến môi trường HSG cho hiệu biểu protein kháng nguyên STb tương đương Môi trường LB SOC không phù hợp cho việc sản xuất kháng nguyên quy mơ phịng thí nghiệm hàm lượng protein thấp nhất, thể hình ảnh điện di (Hình 3.16) Kết tương tự với kết nghiên cứu Lee cs (2000), nhóm tác giả cho thấy mơi trường LB thích hợp cho nhân giống vi sinh vật, việc sản xuất protein tái tổ hợp Proteus vulgaris K80 E coli BL21 môi trường M9ZB cải tiến cho hiệu cao (Lee cs, 2000) Ngược lại, nghiên cứu Shen cs (2007) cho thấy cecropin X biểu mạnh môi trường LB so với môi trường TB, SOB SOC (Shen cs, 2007) kDa 25 15 10 STb M NC M9ZB HSG YJ LB SOB Hình 3.16 Ảnh điện di thăm dị thành phần mơi trường tối ưu biểu gene kháng nguyên tái tổ hợp STb gel 15% M: khối lượng thang chuẩn protein (10-170 kDa, Bio-Base) NC: tế bào E coli tái tổ hợp không bổ sung chất cảm ứng IPTG M9ZB; HSG; LB; YJ; TB: môi trường biểu có chứa thành phần khác 47 3.7.4 Mật độ tế bào trước bổ sung chất cảm ưng kDa 25 15 STb 10 M NC1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 2,0 3,0 Hình 3.17 Ảnh điện di thăm dò thời điểm bổ sung chất cảm ứng tối ưu biểu gene kháng nguyên tái tổ hợp STb gel 15% M: khối lượng thang chuẩn protein (10170 kDa, Bio-Base) NC1: tế bào E coli không mang vector tái tổ hợp 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 2,0 3,0: mật độ tế bào khác trước bổ sung chất cảm ứng Nhiều nghiên cứu cho thấy mật độ tế bào trước cảm ứng đóng vai trị quan trọng sản xuất protein tái tổ hợp Vì vậy, tối ưu mật độ tế bào trước bổ sung chất cảm ứng cần thiết để biểu mạnh protein tái tổ hợp (Byun cs, 2007) Trong nghiên cứu này, khảo sát ảnh hưởng mật độ tế bào lên trình sản xuất kháng nguyên độc tố tái tổ hợp STb với OD600 từ 0,2 - 3,0 Kết trình bày hình 3.17 cho thấy loại kháng nguyên độc tố STb tái tổ hợp bắt đầu tổng hợp mạnh mật độ tế bào đạt OD600 từ 0,2 - 0,6, cao OD600= 0,6, sau gần khơng tổng hợp tổng hợp Một số nghiên cứu Matsumoto cs (2002), Liu cs (2009) cho thấy mật độ tế bào đạt OD600 0,5 thời điểm thích hợp để bổ sung IPTG, cảm ứng biểu lyase từ B subtilis IFO3134 (Liu cs, 2009) hay aminopeptidase N lợn tế bào E coli BL21 (DE3) (Liu cs, 2009), gần tương tự với kết thu nghiên cứu Đối với biểu loại protein tái tổ hợp khác E coli BL21 (DE3), thời điểm thích hợp để cảm ứng khác Enzyme glutathione reductase Brassica rapa subsp pekinensis protease Porphyromonas gingivalis biểu mạnh mật độ tế bào đạt OD600=0,6 (Kim cs, 2009; Margetts cs, 2000) Nguyễn Hoàng Lộc cs (2011) tối ưu mật độ tế bào (OD600= 0,5 - 6,0) cảm ứng biểu protease B subtilis cho thấy enzyme thể hoạt tính mạnh mật độ cao OD600= 2,0 (Loc cs, 2011) Juhasz cs (2003), Kigawa cs (2004) cho thời điểm thích hợp để cảm ứng biểu endoglucanase chịu nhiệt từ Clostridium thermocellum OD600 từ 0,8-1 (Juhasz cs, 2003), hay protein nội bào 48 tế bào E coli BL21 CP OD600=3 sau 3-4 nuôi (Kigawa cs, 2004) Xu cs (2006) nghiên cứu biểu protein hBD4 người nhận thấy protein tái tổ hợp sản xuất mạnh mật độ tế bào có giá trị cao, OD600=15 (Xu cs, 2006) 3.7.5 Ảnh hưởng nhiệt độ cảm ứng Nhiệt độ nuôi cấy yếu tố ảnh hưởng lớn đến phát triển biểu protein tái tổ hợp vi sinh vật Hầu hết cơng trình nghiên cứu rút kết luận nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng E coli dao động từ 37oC-39oC (Ahn cs, 2007; Donovan cs, 1996; Miksch cs, 2008) Tuy nhiên, nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng vi sinh vật chưa nhiệt độ tốt cho sinh tổng hợp enzyme (Nguyễn Trọng Cẩn cs, 1998; Shin cs, 1997) Vì vậy, tiến hành khảo sát nhiệt độ cảm ứng IPTG thích hợp sau ni tăng sinh E coli 37oC đến mật độ tế bào đạt giá trị định Kết nghiên cứu cho thấy nhiệt độ thích hợp để sản xuất protein kháng nguyên STb dao động từ 30-37oC, cho nồng độ kháng nguyên tương đương qua nhiều lần lặp lại thí nghiệm (Hình 3.18) Do đó, chúng tơi sử dụng mức nhiệt độ cho nghiên cứu kDa 25 15 10 STb M 16°C 20°C 25°C 30°C 35°C 37°C Hình 3.18 Ảnh hưởng nhiệt độ cảm ứng lên sản xuất kháng nguyên STb M: khối lượng thang chuẩn protein (10-170 kDa, Bio-Base) 16°C- 37°C: nhiệt độ cảm ứng 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Chúng phân lập gene estB từ E coli có phân thu từ lợn bị tiêu chảy Gene estB có kích thước 216 bp tương đồng đến 100% với trình tự công bố ngân hàng gene (mã số Genbank AY028790) Trình tự nucleotide mã hóa tạo thành chuỗi peptide hoàn chỉnh liên tục, tương đồng 100% với chuỗi amino acid công bố ngân hàng gene với mã số WP_015056453 Chúng tạo dịng biểu thành cơng gene estB vào hai vector pGEMT easy pET200/D-TOPO biến nạp vào hai tế bào vật chủ E coli TOP10 E coli BL21 (DE3) Chúng biểu thành cơng protein tái tổ hợp có kích thước với kích thước thấp so với tính tốn theo lý thuyết (khoảng kDa), nồng độ biểu cao Tế bào E coli BL21 tái tổ hợp có pha thích nghi kéo dài từ 0-2 giờ, pha sinh trưởng kéo dài từ 2-12 giờ, pha cân kéo dài từ 12-16 pha chết Tế bào E coli BL21 tái tổ hợp sinh trưởng tốt môi trường YJ với tỷ lệ tiếp giống 2% (giống hoạt hóa sau ni), lắc 220 vịng/phút Gene estB biểu tốt tế bào E coli BL21 môi trường YJ, IPTG (0,8 mM), thời gian 10 giờ, thời điểm cảm ứng OD600 = 0,6, nhiệt độ 30-37°C KIẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu tối ưu quy trình sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp STb hệ lên men quy mô pilot - Nghiên cứu thăm dò khả ứng dụng kháng nguyên nghiên cứu sản xuất kháng thể kháng độc tố STb làm nguyên liệu cho sản xuất kháng thể sử dụng phòng điều trị bệnh tiêu chảy E coli gây lợn 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Vũ Triệu An Homberg J.C (1998), Miễn dịch học, NXB Y học, Hà Nội Phùng Đắc Cam (2003) Bệnh tiêu chảy Nxb Y học, Hà Nội Nguyễn Trọng Cẩn (CB), Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Hương Giang, Trần Thị Luyến (1998), Công nghệ enzyme, Nxb Nông nghiệp, TP Hồ Chí Minh Lê Minh Chí (1995), Bệnh tiêu chảy gia súc, Bộ nông nghiệp công nghiệp thực phẩm, Hà Nội Hồ Đình Chức (1978), Giáo trình bệnh truyền nhiễm gia súc, Nhà xuất nơng nghiệp, tr 356-359 Đỗ Trọng Cứ Nguyễn Quang Tuyên (2002), Sử dụng chế phẩm EM phòng bệnh tiêu chảy lợn trước sau cai sữa Hội chăn nuôi Việt Nam, số 12, tr 28 Đào Trọng Đạt, Phan Thanh Phượng Lê Ngọc Mỹ (1995), Bệnh đường tiêu hố lợn, NXB Nơng nghiệp, Hà Nội Đào Trọng Đạt, Phan Thanh Phượng, Lê Ngọc Mỹ, Huỳnh Văn Kháng (1996), Bệnh lợn nái lợn con, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr 44 – 81 Đoàn Thị Kim Dung (2004), Sự biến động số vi khuẩn hiếu khí đường ruột, vai trị E coli hội chứng tiêu chảy lợn con, phác đồ điều trị, Luận án tiến sĩ nông nghiệp Hà Nội 10 Đoàn Thị Kim Dung Lê Thị Tài (1997), Tác dụng Becberin dung dịch điện giải điều trị hội chứng tiêu chảy lợn theo mẹ, Tạp chí Nơng Nghiệp Cơng nghiệp thực phẩm, số 8, tr 367 – 368 11 Trần Thị Hạnh, Đặng Xuân Bình (2002), Chế tạo, thử nghiệm số chế phẩm sinh học phòng trị bệnh tiêu chảy phân trắng lợn E coli Cl Perfringens, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, 1: tr 19 – 28 12 Nguyễn Bá Hiên (2001), Một số vi khuẩn đường ruột thường gặp biến động chúng gia súc khoẻ mạnh bị tiêu chảy nuôi vùng ngoại thành Hà Nội Điều trị thử nghiệm, Luận án tiến sĩ nông nghiệp, trường ĐH nông nghiệp I Hà Nội 13 Phạm Khắc Hiếu Bùi Thị Tho (1999), Một số kết nghiên cứu tính kháng kháng thuốc vi khuẩn gây bệnh thú y, Kết nghiên cứu KHKT khoa Chăn nuôi thú y NXB Nông nghiệp tr 134 – 138 51 14 Vũ Đình Hưng cộng (1996), Sử dụng globulin chiết tách từ máu gia súc để phịng bệnh phân trắng lợn con, Tạp chí Nơng nghiệp cộng nghiệp thực phẩm, số 12 tr 498 15 Lý Thị Liên Khai (2001), Phân lập, xác định độc tố ruột chủng E coli gây tiêu chảy cho heo con, Khoa học kỹ thuật thú y, 2: tr 13 –18 16 Nguyễn Văn Kình (1996), Tạp chí nông nghiệp công nghiệp thực phẩm, 1: tr 42 17 Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ, Hà Thị Minh Thi (2007), Giáo trình Sinh học phân tử, Nxb Đại học Huế 18 Niconxki V.V (1971), Cơ sở miễn dịch học gia súc, Người dịch: Phạm Quân NXB Nông thôn, Hà Nội 19 Nguyễn Thị Nội (1986), Tìm hiểu vai trò Escherichia coli bệnh phân trắng lợn vaccine dự phịng, Luận án Phó tiến sĩ Nơng nghiệp, Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam 20 Nguyễn Thị Nội, Nguyễn Ngọc Nhiên, Cù Hữu Phú, Nguyễn Thị Sở Trần Thị Thu Hà (1993), Nghiên cứu vaccin đa giá Salsco phòng bệnh ỉa chảy lợn con, Kết nghiên cứu khoa học kỹ thuật thú y tr 54-58 21 Nguyễn Thị Nội, Nguyễn Thị Sở, Cù Hữu Phú Trương Văn Dung (1984), Vacxin E coli phòng bệnh cho lợn con, Kết nghiên cứu Khoa học Kỹ thuật thú y 1979-1984 tr 98-103 22 Pekhop A.P (1983), Di truyền học vi khuẩn (Người dịch Kiều Hữu Ảnh Đỗ Mạnh Hưng; Người hiệu đính: Lê Đình Lương), NXB Khoa học kỹ thuật (275 trang) 23 Cù Hữu Phú, Nguyễn Ngọc Nhiên, Vũ Bình Minh vaì Đỗ Ngọc Thuý (2000), Kết phân lập vi khuẩn E coli Salmonella lợn mắc bệnh tiêu chảy, xác định số đặc tính sinh hoá chủng vi khuẩn phân lập biện pháp phòng trị, Kết nghiên cứu khoa học kỹ thuật thú y 1996-2000, NXB Nông nghiệp, Hà Nội tr 171-176 24 Tơ Thị Phượng (2006), Nghiên cứu tình hình hội chứng tiêu chảy lợn ngoại hướng nạc Thanh Hóa biện pháp phịng trị, Luận văn Thạc sĩ nông nghiệp, Hà Nội 25 Phạm Hồng Sơn, Phan Văn Chinh, Nguyễn Thị Thanh Phạm Quang Trung (2002), Giáo trình vi sinh vật học thú y, NXB Nông nghiệp, Hà Nội tr 7-27 26 Lê Văn Tạo (1996), Cấu trúc Fimbriae, kháng nguyên bám dính K88 vi khuẩn E coli vai trị q trình gây bệnh phân trắng lợn con, Tạp chí Nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm, số năm 1996, Hà Nội 1996 tr 62-63 52 27 Lê Văn Tạo, Khương Ngọc Bích, Nguyễn Thị Vui, Đồn Băng Tâm (1990), Xác định yếu tố gây bệnh di truyền Plasmid vi khuẩn E Coli để chọn giống sản xuất vaccine phịng bệnh phân trắng lợn con, Cơng trình nghiên cứu khoa học kỹ thuật 1990 – 1991 tr 71 – 81 28 Lê Văn Tạo, Khương Ngọc Bích, Nguyễn Thị Vui, Đoàn Băng Tâm (1993), Nghiên cứu chế tạo vaccine E coli cho uống phòng bệnh ỉa chảy phân trắng lợn con, Tạp chí khoa học cơng nghệ quản lý kinh tế tr 324 – 326 29 Lê Văn Tạo, Khương Ngọc Bích, Nguyễn Thị Vui, Đồn Băng Tâm (1991), Khả bám dính sản sinh kháng nguyên K88 số giống E coli phân lập từ lợn bị bệnh phân trắng, Cơng trình nghiên cứu khoa học kỹ thuật 19901991 tr 82-88 30 Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên Trần Thị Thu Hương (1997) Vi sinh vật học thú y NXB Nông nghiệp, Hà Nội Tr 81-85 31 Bùi Thị Tho Phạm Khắc Hiếu (1995), Tình hình kháng thuốc E coli (phân lập từ lợn phân trắng) thời gian qua, Khoa học kỹ thuật thú y tập II, 1: tr 92-93 32 Bùi Thị Tho Phạm Khắc Hiếu (1996), Kiểm tra số yếu tố ảnh hưởng đến tính mẫn cảm tính kháng thuốc E coli phân lập từ bệnh lợn phân trắng, Khoa học kỹ thuật thú y tập III, 4: tr 57-62 33 Đỗ Ngọc Thúy, Darren Trott, Cù Hữu Phú, Nguyễn Xuân Uyên, Âu Xuân Tuấn, Văn Thị Hường Vũ Ngọc Quý (2005), Ứng dụng PCR để xác định yếu tố độc lực E coli gây bệnh tiêu chảy lợn số tỉnh miền Bắc Việt Nam, Khoa học kỹ thuật thú y, số tr 13-17 34 Phan Thị Phương Trang, Nguyễn Lê Tuấn Anh (2013), Dịng hóa biểu protein LTB Escherichia coli Bacillus subtilis, Tạp chí phát triển khoa học cơng nghệ, 16(1): tr 13-22 35 Hồng Văn Tuấn, Lê Văn Tạo Trần Thị Hạnh (1998), Kết điều tra tình hình bệnh tiêu chảy lợn trại lợn giống hướng nạc, Khoa học kỹ thuật thú y, V: tr 61 – 64 36 Tạ Thị Vịnh Đặng Thị Hòe (2002), Một số kết sử dụng chế phẩm sinh học để phòng trị bệnh tiêu chảy lợn con, Khoa học kỹ thuật thú y IX: tr 54-56 53 Tài liệu tiếng Anh 37 Acres, S D (1985), Enterotoxigenic Escherichia coli infections in newborn calves: a review, J Dairy Sci 68, pp 229 – 256 38 Ahn W.S., Ahn J.Y., Jung C.H., Wang K.Y., Kim E.E., Kim J., Im H., Kim J.O., Yu M.H., Lee C (2007), Optimization of expression conditions for soluble protein by using a robotic system of multi-culture vessels, Journal of Microbiology and Biotechnology, 7(11), pp 1868-1874 39 Arriaga, Y.L., Harville, B.A., & Dreyfus, L.A (1995), Contribution of individual disulfide bonds to biological action of Escherichia coli heat – stable enterotoxin B infect Immun., 63, pp 4715 – 4720 40 Byun S.G., Kim M.D., Lee W.H., Lee K.J., Han N.S., Seo J.H (2007), Production of GDP-L-fucose, L-fucose donor for fucosyloligosaccharide synthesis in recombinant Escherichia coli, Applied Microbiology and Biotechnology, 74, pp 768-775 41 Carter G.R., Chengappa M.M & Rober T.S (1995), Essentials of veterinary microbiology, Williams and Wikkins, Rose tree corporate Center Building 1400 North providence Rd, Suite 5025 Media PA 19063-2043 42 Donovan R.S., Robinson C.W., Glick B.R (1996), Review: Optimizing inducer and culture conditions for expression of foreign proteins under the control of the lac promoter, Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 16, pp 145-154 43 Dreyfus, L.A (1993), Calcium influx mediated by the Escherichia coli heat – stable enterotoxin B (STB), Proc Natl Acad Sci USA 90, pp 3202 – 3206 44 Dubreuil J.D (1997), Escherichia coli STb enterotoxin, Microbiology, 143, pp 1783-1795 45 Dubreuil J.D (2006a), Escherichia coli, Vibrio, and Yersinia species heat-stable enterotoxins, In: The comprehensive sourcebook of bacterial protein toxins (3rd edition) Edited by Alouf, J.E and Popoff, M.R Elservier, pp 798-829 46 Evan D.G., Evans D.J & Gorbach S.L (1973), Production of vascular permeability factor by enterotoxigenic Escherichia coli isolated from man Infect Immun., V-8: pp 725-730 47 Fairbrother J.M (1992), Enteric colibacillosis “In” A.D Leman, Straw B.E., Mengeling W.L., Dallareet S & Taylor D.J Diseases of swine, IOWA State University Press, Ames pp 489 54 48 Fairbrother J.M., Bestchinger H.U., Nielsen O.N & Pohlenz J.F (1992), Escherichia coli infectious Diseases of swine, Seventh Edition Wolfe publishing Ltd – Australian, pp 489-497 49 Fu Z., Hamid S.B.A., Razak C.N.A., Basri M., Salleh A.B., Rahman R.N.Z.A (2003), Secretory expression in Escherichia coli and single-step purification of a heat-stable alkaline protease, Protein Expression and Purification, 28, pp 63-68 50 Fujii Y., Hayashi M., Hitotsubashi S., Fuke Y., Yamanaka H and Okamoto K (1991), Purification and characterization of Escherichia coli heat-stable enterotoxin II, J Bacteriol., 173, pp 5516-5522 51 Goedel D.V (1991), Gene expression technology, Acadimic Press, California 52 Gupta P., Ghosalkar A., Mishra S., Chaudhuri T.K (2009), Enhancement of over expression and chaperone assisted yield of folded recombinant aconitase in Escherichia coli in bioreactor cultures, Journal of Bioscience and Bioengineering, 107(2), pp 102-107 53 Gupta P., Sahai V., Bhatnagar R (2001), Enhanced expression of the recombinant lethal factor of Bacillus anthracis by fed-batch culture, Biochemical and Biophysical Research Communications, 285, pp 1025-1033 54 Gyles, C.L & Barnum, D.A (1969), A heat – labile enterotoxin from Strains of Escherichia coli enteropathogenic for pigs J Infect Dis., 120, pp 419 – 426 55 Harnett N M and Gyles C L (1985), Linkage of genes for heat-stable enterotoxin, drug resistance, K99 antigen, and colicin in bovine and porcine strains of enterotoxigenic Escherichia coli, Am J Vet Res., 46, pp 428-433 56 Hedrén M., Ballagi A., Mörtsell L., Rajkai G., Stenmark P., Sturesson C., Nordlund P (2006), GRETA, a new multifermenter system for structural genomics and process optimization, Acta Crystallographica, 62(D), pp 1227-1231 57 Hitotsubashi, S., Fujii, Y., Yamanaka, H., & Okamoto, K (1992), some Properties of purified Escherichia coli heat – stable enterotoxin II Infect Immun 60, pp 4468 – 4474 58 Holmes, R.K.,Twiddy, E.M., & Pickett, C.L (1986), Purification and characterization of type II heat – labile enterotoxin of Escherichia coli Infect Immun 53, pp 464 – 473 59 Jones G.W., Rutte J.M (1972), Role of the K88 antigen in the pathogenesis of neonatal diarrhea caused by Escherichia coli in piglets, Infection and Immunity, 6(6), pp 918-927 60 Juhasz T., Szekely E., Simandi B., Szengyel Z.S., Reczey K (2003), Recovery of 55 a recombinant thermostable endoglucanase from E coli using supercritical carbon dioxide cell disruption, Chemical and Biochemical Engineering Quarterly, 17(2), pp 131-134 61 Kigawa T., Yabuki T., Matsuda N., Matsuda T., Nakajima R., Tanaka A., Yokoyama S (2004), Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression, Journal of Structural and Functional Genomics, 5, pp 63-68 62 Kim D.K., Lee J., Saraswat V., Park Y.H (2000), Glucagon-induced selfassociation of recombinant proteins in Escherichia coli and affinity purification using a fragment of glucagon receptor, Biotechnology and Bioengineering, 69(4), pp 418-428 63 Kim I.S., Shin S.Y., Kim Y.S., Kim H.Y., Yoon H.S (2009), Expression of a glutathione reductase from Brassica rapa subsp pekinensis enhanced cellular redox homeostasis by modulating antioxidant proteins in Escherichia coli, Molecular and Cells, 28, pp 479-487 64 Kim T.G., Kim M.Y., Kim B.G., Kang T.J., Kim Y.S., Jang Y.S (2007), “Synthesis and assembly of E coli heat-labile enterotoxin B subunit in transgenic lettuce (Lactuca sativa L.)”, Protein Expression and Purification, 51, pp 22 - 27 65 Lee D.H., Kim M.D., Lee W.H., Kweon D.H., Seo J.H (2004), Consortium of fold-catalyzing proteins increases soluble expression of cyclohexanone monooxyase in recombinant Escherichia coli, Apply of Microbiology and Biotechnology, 63, pp 549-552 66 Lee H.W., Yoon S.J., Kim H.K., Park K.M., Oh T.K., Jung J.K (2000), Overexpression of an alkaline lipase gene from Proteus vulgaris K80 in Escherichia coli BL21/pKLE, Biotechnology Letters, 22, pp 1543-1547 67 Li J.G., Jiang Z.Q., Xu L.P., Sun F.F., Guo J.H (2007), Characterization of chitinase secreted by Bacillus cereus strain CH2 and evaluation of its efficacy against verticillium wilt of eggplant, International Organization for Biological Control, 10, pp 1007-1021 68 Liu B., Li G., Sui X., Yin J., Wang H.X.R (2009), Expression and functional analysis of porcine aminopeptidase N produced in prokaryotic expression system, Journal of Biotechnology, 10, pp 95-101 69 Loc N.H., Quang H.T., Lam B.T.H., Trang D.T.T (2011), The effects of culture conditions on neutral protease (NPRC10) in a recombinant Escherichia coli BL21 (DE3), Annals of Biological Research, 2(3), pp 474-485 56 70 Manderson D., Dempster R., Chisti Y (2006), A recombinant vaccine against hydatidosis: production of the antigen in Escherichia coli, Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 33, pp 173-182 71 Margetts M.B., Barr I.G., Webb E.A (2000), Overexpression, purification, and refolding of a Porphyromonas gingivalis cysteine protease from Escherichia coli, Protein Expression and Purification, 18, pp 262-268 72 Matsui T., Sato H., Yamamuro H., Misawa S., Shinzato N., Matsuda H., Takahashi T., Sato S (2007), High cell density cultivation of recombinant E coli for hirudin variant production, Journal of Biotechnology, 134, pp 88-92 73 Matsumoto T., Katsura D., Kondo A., Fukuda H (2002), Efficient secretory overexpression of Bacillus subtilis pectate lyase in Escherichia coli and singlestep purification, Biochemical Engineering Journal, 12, pp 175-179 74 Miksch G., Ryu S., Risse J.M (2008), Factors that influence the extracellular expression of streptavidin in Escherichia coli using a bacteriocinrelease protein, Application of gene molecular biotechnology, 10, pp 124-129 75 Nataro, J P & Kaper, J.B (1998), Diarrheagenic Escherichia coli Clin Microbiol Rev., 11, pp 142 – 201 76 Natvig D.O., Imlay K., Touati D., Hallewell R.A (1987), Human copper-zinc superoxide dismutase complements superoxide dismutase-deficient Escherichia coli mutants, Journal of Biological Chemistry, 262(30), pp 14697-14701 77 Qian Z.G., Xia X.X., Choi J.H., Lee S.Y (2008), Proteome-based identification of fusion partner for high-level extracellular production of recombinant proteins in Escherichia coli, Biotechnology and Bioengineering, 101(3), pp 587-601 78 Sack R.B (1975), Human diarrheal disease caused by Enterotoxigenic Escherichia coli, Annu Rev Microbiol., 29, pp 333–353 79 Savarino, S.J et al (1996), Enteroaggregative Escherichia coli heat – stable enterotoxin is not restricted to Enteroaggregative E coli, J Infect Dis 173, pp 1019-1022 80 Sears, C.L & Kaper, J.B (1996), Enteric bacterial toxins: mechanisms of action and linkage to intestinal secretion, Microbiol Rev 60, pp 167 – 215 81 Shen Y., Lao X.G., Chen Y., Zhang H.Z., Xu X.X (2007), High-level expression of cecropin X in Escherichia coli, International Journal of Molecular Sciences, 8, pp 478-491 82 Shen Y., Lao X.G., Chen Y., Zhang H.Z., Xu X.X (2007), High-level expression of cecropin X in Escherichia coli, International Journal of Molecular Sciences, 8, 57 pp 478-491 83 Sherman D.M., Acres S.D., Sadowski P.L., Springer J.A., Bray B., Raybould T.J., and Muscoplat C.C (1983), Protection of calves against fatal enteric colibacillosis by oral administered Escherichia coli K99-specific monoclonal antibody, Infect Immun., 42(2), pp 653-658 84 Shin C.S., Hong M.S., Bae C.S., Lee J (1997), Enhanced production of human mini-Proinsulin in fed-batch cultures at high cell density of Escherichia coli BL21(DE3) [pET-3aT2M2], Biotechnology Progress, 13, pp 249-257 85 Smith H.W & Halls S (1967), The transmissible nature of the genetic factor in E coli that controls hemolysin production, J.gen Microbiol pp 47: 153 86 Sokol A., Mikola I & Sovac (1981), Neonatal coli infecie ich laboratorina danostina a prevenica U OLV Kosice: pp 40-45 87 Takeda, Y., Honda, T., Sima, H., Tsuji, T., & Miwatani,T (1983), Analysis of antigenic determinants in cholera enterotoxin and heat – labile enterotoxins from human and porcine enterotoxingenic Escherichia coli Immun 41, pp 50 – 53 88 Vaandrager, A.B., van der, W.E., Hom, M.L., Luthjens, L.H., & de jonge, H.R (1994), Heat – Stable entertoxin receptor/guanylyl cyclase C is an oligomer consisting of functionally distinct subunits, Which are non – covalently linked in the intestine, J Bio Chem 269, pp 16409 – 16415 89 Vulfson E.N., Halling P.J., Holland H.L (2001), Enzymes in nonaqueous solvents: methods and protocols, Humana Press, Canada 90 Whipp, S C (1987), Protease degradation of Escherichia coli heat – Stable, mouse – negative, pig – positive enterotoxin, Infect Immun 55, pp 2057 – 2060 91 Xu J., Li W., Wu J., Zhang Y., Zhu Z., Liu J., Hu Z (2006), Stability of plasmid and expression of a recombinant gonadotropin-releasing hormone (GnRH) vaccine in Escherichia coli, Applied Microbiology and Biotechnology, 73, pp 780-788 92 Xu Z., Zhong Z., Huang L., Peng L., Wang F., Cen P (2006), High-level production of bioactive human beta-defensin-4 in Escherichia coli by soluble fusion expression, Applied Microbiology and Biotechnology, 72, pp 471-479 93 Yang J., Yang C., Jiang H., Qiao C (2008), Overexpression of methyl parathion hydrolase and its application in detoxification of organophosphates, Biodegradation, 19, pp 831-839 94 Yangc & Konisky J (1984), Colicin V treated Escherichia coli does not generate membrane potential, J Bacterial.158: pp 757-759 58 95 Zhou Y.X., Wei C., Ping L.Q., Shu M.Y., Zhi W.J., Zhi W.D (2005), Production and purification of anovel antibiotic peptide, adenoregulin, from a recombinant Escherichia coli, Journal of Biotechnology Letters, 27, pp 725-730 ... hành nghiên cứu đề tài " Nghiên cứu tạo dòng biểu gene kháng nguyên độc tố bền nhiệt STb E coli tế bào vi khuẩn E coli BL21 (DE3) tối ưu điều kiện biểu hiện" MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI Nghiên cứu phân... nghiên cứu 2.3.1.1 Nghiên cứu phân lập gene estB phản ứng PCR 2.3.1.2 Nghiên cứu tạo dòng gene estB vào vector tạo dòng biến nạp vào tế bào vật chủ E. coli TOP10 2.3.1.3 Nghiên cứu tạo dòng vào vector... sinh độc tố ruột (enterotoxigenic E coli- ETEC), E coli xâm nhập ruột (enteroinvasive E. coliEIEC), E. coli gây xuất huyết ruột (enterohaemorrhagic E. coli- EHEC) E. coli bám dính đường ruột (enteroaggregative