Nghiên cứu tạo dòng vi khuẩn photobacterium damselae nhược độc bằng phương pháp sử dụng tia uv nhằm phục vụ chế tạo vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng trên một số loại cá nuôi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH -& - KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KỸ SƢ NI TRỒNG THỦY SẢN Đề tài : NGHIÊN CỨU TẠO DÕNG VI KHUẨN Photobacterium damselae NHƢỢC ĐỘC BẰNG PHƢƠNG PHÁP SỬ DỤNG TIA UV NHẰM PHỤC VỤ CHẾ TẠO VẮC-XIN PHÒNG BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG TRÊN MỘT SỐ LOẠI CÁ NUÔI Người thực hiện: NguyễnTrọng Hiếu Người hướng dẫn: Th.S Lê Minh Hải PGS TS Phạm Thị Tâm Vinh, 5/2016 i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực tập thực đề tài tốt nghiệp này, nỗ lực thân nhận đƣợc giúp đỡ nhiệt tình từ thầy giáo khoa Nơng Lâm Ngƣ, trƣờng Đại Học Vinh, ngƣời tận tình dìu dắt tơi suốt thời gian ngồi ghế nhà trƣờng Đặc biệt xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy giáo Lê Minh Hải, ngƣời hƣớng dẫn, bảo giúp đỡ hoàn thành tốt luận văn Xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, anh chị bạn khoa Công Nghệ Sinh Học, Viện Đại học Mở - Hà Nội, đặc biệt cô giáo Phạm Thị Tâm hỗ trợ tạo điều kiện trang thiết bị, sở vật chất để tơi hoàn thành đề tài sở thực tập Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình ngƣời bạn động viên giúp đỡ tơi suốt q trình học nhƣ sống Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn ! Sinh viên Nguyễn Trọng Hiếu ii MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 Chƣơng 1.TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan vi khuẩn Photobacterium damselae .3 1.1.1 Phân loại 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá 1.1.4 Đặc điểm gây bệnh vi khuẩn Photobacterium damselae 1.1.5.Dịch tễ học 1.1.6.Phòng trị bệnh .9 1.2 Lịch sử phát bệnh vi khuẩn Photobacterium damselae 10 1.2.1 Lịch sử phát bệnh giới 10 1.2.2 Lịch sử phát bệnh Việt Nam .11 1.3 Tổng quan tạo chủng vi khuẩn nhƣợc độc 11 1.3.1 Tình hình nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn nhƣợc độc .11 1.3.2 Các phƣơng pháp làm giảm độc lực vi khuẩn 14 1.3.3 Các tác nhân tạo chủng nhƣợc độc .16 1.4 Đặc điểm hệ miễn dịch cá xƣơng 22 1.4.1 Miễn dịch đặc hiệu 22 1.4.2 Miễn dịch tự nhiên 22 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu .24 2.2 Vật liệu nghiên cứu 24 2.2.2.Hóa chất 24 2.2.3 Môi trƣờng dung dich nuôi cấy 24 2.2.4 Thiết bị 26 2.3 Nội dung nghiên cứu 27 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 27 iii 2.4.1 Phƣơng pháp vi sinh 29 2.4.2 Phƣơng pháp gây đột biến tia cực tím 29 2.4.3 Phƣơng pháp gây nhiễm động vật thí nghiệm 30 2.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu 32 2.6 Thời gian địa điểm nghiên cứu 32 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Kết tạo dòng vi khuẩn Photobacterium damselae nhƣợc độc tia UV .33 3.2 Kết đánh giá mức độ giảm độc lực dòng vi khuẩn Photobacterium damselae nhƣợc độc đột biến 36 3.2.1 Kết thử khả dung huyết 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1.A Hình thái vi khuẩn P damselae Hình 1.1.B Hình thái khuẩn lạc mơi trƣờng thạch máu Hình 1.2 Tác động tia tử ngoại tạo dimer thymine 17 Hình 1.3 Tác động tia UV làm cho DNA có chỗ phình cấu trúc 18 Hình 1.4: Cấu trúc RNA polymerase (RNAP) .20 Hình 1.5 Vùng kháng Rif tiểu đơn vị β RNAP [13] 21 Hình 1.6 Đột biến kháng Rif vùng I gen rpoB 21 Hình 2.1 Sơ đồ khối nghiên cứu 28 Hình 2.2 Minh họa thí nghiệm chiếu tia UV 30 Hình 2.3.Sơ đồ bố trí thí nghiệm gây nhiễm cá 31 Hình 3.2 Số khuẩn lạc sống sót sau chiếu UV 36 Hình 3.3 Khả dung huyết chủng T4.3 Dịng 38 Hình 3.4 Cá trƣớc sau gây nhiễm chủng đột biến 41 Hình 3.6.Cá thí nghiệm sau 15 ngày đánh giá kháng thể bảo hộ .43 v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Môi trƣờng TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Salts) .25 Bảng 2.2 Môi trƣờng thạch máu 25 Bảng 2.3.Môi trƣờng Brain Heart Infusion ( BHI) Broth 26 Bảng 2.4 Các thiết bị dùng nghiên cứu 26 Bảng 3.1 Số khuẩn lạc sống sót sau xử lý UV 34 Bảng 3.2 Kết phản ứng thử khả dung huyết .37 Bảng 3.3 Kết gây nhiễm cá sau 15 ngày tiêm 39 Bảng 3.4 Kết đánh giá khả sinh kháng thể bảo hộ 42 vi MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Hiện nay, đối tƣợng ni mơ hình ni thủy sản Việt Nam phong phú.Trong đó, mơ hình ni cá lồng ngày khẳng định đƣợc vị trí Đây mơ hình đƣợc áp dụng cho nhiều lồi cá có giá trị kinh tế cao Các loại cá biển nhƣ: Cá Mú (Epinephelus spp), cá Giò (Rachycentron canadum), cá Chẽm (Lates calcarifer), cá Hồng (Lutjanus spp)… có giá trị kinh tế cao hàm lƣợng dinh dƣỡng giàu axit béo không no nên đƣợc thị trƣờng nƣớc ƣa chuộng Tuy nhiên, nghề ni cá biển phát triển ngƣời ni gặp khơng khó khăn có dịch bệnh xảy cá Một số nghiên cứu tác nhân gây bệnh chủ yếu cá biển nuôi lồng thƣờng virus, nấm vi khuẩn, nguy hiểm vi khuẩn Photobacterium damselae gây bệnh tụ huyết trùng do.Vi khuẩn cơng gây bệnh cá biển nuôi tất giai đoạn phát triển cá từ giai đoạn ấu trùng, cá giống đến cá ni thƣơng phẩm Khi bị bệnh, cá có biểu dạng mãn tính cấp tính Biểu bệnh tụ huyết trùng bao gồm: gây loét da, xuất nốt kem trắng u hạt màu trắng số quan nội tạng, gây hoại tử nội tạng, hoại tử tập trung thận lách, gây nhiễm trùng hoại tử rộng rãi (Evelyn năm 1996; Romalde 2002; Barnes cộng sự, 2005) Dấu hiệu lâm sàng bệnh bao gồm: cá ăn, da tối màu, mang hoại tử Cá bệnh chết sau - 10 ngày với tỷ lệ chết cao từ 80 - 100% gây thiệt hại kinh tế lớn số nƣớc nhƣ: Nhật, Mỹ, Pháp, Tây Ban Nha, Hy Lạp, Thổ Nhỹ Kỳ,Bỉ…Ở Việt Nam, bệnh phân bố hầu hết vùng nuôi nƣớc Thực tế nuôi trồng thủy sản, ngƣời dân thƣờng sử dụng nhiều hóa chất kháng sinh để khống chế vi khuẩn này, song việc sử dụng kháng sinh gây tƣợng nhờn thuốc khơng mang lại hiệu cao Vi khuẩn có khả tạo màng bảo vệ trƣớc thuốc diệt khuẩn kháng sinh Chính thế, dịch bệnh thƣờng bùng phát trở lại nhanh sau thuốc hết tác dụng Mặt khác, dƣ lƣợng kháng sinh sản phẩm từ cá biển gây ảnh hƣởng xấu đến chất lƣợng thịt cá sức khỏe ngƣời Phƣơng pháp phòng bệnh hiệu sử dụng vắc-xin Việc nghiên cứu loại vắc-xin phòng bệnh tƣơng đối cần thiết Một bƣớc quan trọng để nghiên cứu vắc-xin phải tạo đƣợc chủng vi khuẩn nhƣợc độc, làm sở ban đầu hƣớng đến việc sản xuất vắc-xin bệnh tụ huyết trùng cá biển Xuất phát từ lý luận tình hình thực tiễn trên, chúng tơi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tạo dòng vi khuẩn Photobacterium damselae nhược độc phương pháp sử dụng tia UV nhằm phục vụ chế tạo vắc-xin phòng bệnh tụ huyết trùng số loại cá nuôi ” làm sở ban đầu hƣớng đến việc sản xuất vắcxin bệnh tụ huyết trùng cá biển Mục tiêu đề tài 2.2.1 Mục tiêu chung Tạo đƣợc chủng vi khuẩn Photobacterium damselae nhƣợc độc có khả tạo kháng thể bảo hộ cá 2.2.2 Mục tiêu cụ thể  Tạo đƣợc dòng vi khuẩn Photobacterium damselae nhƣợc độc kỹ thuật đột biến sử dụng tia UV  Đánh giá đặc tính chủng đột biến: - Đánh giá lại khả dung huyết - Đánh giá lại mức độ gây bệnh qua lây nhiễm cá  Đánh giá khả tạo kháng thể bảo hộ cho cá sử dụng vi khuẩn nhƣợc độc Chƣơng 1.TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan vi khuẩn Photobacterium damselae 1.1.1 Phân loại Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma proteobacteria Bộ: Vibrionales Họ: Vibrionaceae Chi: Photobacterium Loài: Photobacterium damselae Tình hình phân loại Photobacterium damselae hệ thống đƣợc thay đổi nhiều lần Ban đầu chủng đƣợc phân lập nhƣ Vibrio damselae đƣợc công nhận tác nhân gây bệnh hội có khả gây bệnh cá động vật có vũ McDonell Colwell (1985) phân loại lại nhƣ thành viên chi Listonella dựa việc nghiên cứu mối quan hệ phát sinh lồi cách phân tích chuỗi 5S rRNA Sau đó, Smith et al (1991) dựa đặc điểm kiểu hình chuyển lồi đến chi Photobacterium Trong nghiên cứu Gauthier et al (1995) tác nhân gây bệnh tụ huyết trùng số loài cá, chứng minh xác định chủng vi khuẩn thành viên Photobacterium damselae phƣơng pháp phân tích trình tự 16S rDNA DNA [30] 1.1.2 Đặc điểm hình thái Vi khuẩn Photobacterium damselae trực khuẩn, gram âm, kích thƣớc khoảng 0.5 – 0.8 µm x 0.7 – 2.6 µm, lƣỡng cực Khơng có roi khơng di động (Austin et al, 1997) [19] A B Hình 1.1.A Hình thái vi khuẩn P damselae Hình 1.1.B Hình thái khuẩn lạc môi trƣờng thạch máu 1.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hố Điều kiện ni cấy: Vi khuẩn P damselae phát triển tốt mơi trƣờng có nồng độ NaCl từ 0,5% - 4% Phát triển tốt nồng độ NaCl từ 1,0% - 2,5% Không phát triển mơi trƣờng có nồng độ NaCl 0%, 8%, 10%, 12% phát triển thiếu Na+ Nhiệt độ nuôi cấy từ 15ºC – 32,5ºC Môi trƣờng nuôi cấy cấp tốt môi trƣờng BHI Agar, TCBS, Marine Agar môi trƣờng thạch máu (2% máu cừu) không bổ sung thêm muối Khuẩn lạc mơi trƣờng thạch máu có màu xám, đục, đƣờng kính khoảng 1mm, viền trơn, gây dung huyết β quan sát đƣợc rõ ràng sau 48h 28ºC (Austin et al, 1997 Fouz et al, 1997) [19] Vi khuẩn P damselae bắt màu Gram âm, nhuộm lƣỡng cực, nhuộm thƣờng thấy vi khuẩn bắt màu sẫm hai đầu, nhạt tƣợng nguyên sinh chất bị dung giải hai đầu vi khuẩn Là vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí tùy tiện Phản ứng tích cực với Metyl đỏ (1%NaCl), Arginene (1%NaCl), khử Nitrat thành Nitrit Sinh acid nhƣng khơng sinh khí gas từ loại đƣờng glucose, mannose, maltose, fructose, galactose Sinh khí từ D-glucose, lipase, esculin Dƣơng tính với oxidase, catalase, methyl red Âm tính với indol, nitrate, citrate, H2S (Austin et al,1997 Fouz et al, 1997) [19] Hình 3.1.Biểu đồ thể sống sót khuẩn lạc sau thời gian chiếu Qua đời chiếu tia UV quan sát đĩa nuôi cấy vi khuẩn sau chiếu UV nhận thấy : - Ở mật độ vi khuẩn ban đầu 250CFU/đĩa cƣờng độ ánh sáng UV nhƣ nhau, khác thời gian chiếu đời mật độ vi khuẩn sống sót điều kiện chiếu tia tử ngoại có khác nhau, sau phút chiếu UV, mật độ vi khuẩn sống sót 26 CFU/đĩa nhƣng sau đời chiếu thứ mật độ vi khuẩn sống sót đạt tới 132 CFU/đĩa, gia tăng chống chịu tia UV Qua đời chiếu UV mật độ vi khuẩn sống sót giảm đáng kể nhƣng khuẩn lạc mọc đƣợc khả chống chịu tia UV Đến đời khơng cịn khuẩn lạc mọc đƣợc - Hình thái khuẩn lạc có phần thay đổi so với đĩa đối chứng chủng gốc T4.3 ,cụ thể khuẩn lạc chủng gốc T4,3 có màu xanh,trịn có nhầy nhƣng sau chiếu tia UV thời gian thấy số khuẩn lạc mọc lên có màu xanh nhạt ,có trạng thái khơ hơn,ít nhầy có kích thƣớc (D = 0,5 – 1,8mm) nhỏ so với khuẩn lạc chủng gốc T4.3(D=1,5-2mm) 35 15 phút 35 phút Khuẩn lạc sống sót sau chiếu tia UV Khuẩn lạc sống sót sau chiếu tia UV 15 phút 35 phút Hình 3.2 Số khuẩn lạc sống sót sau chiếu UV 3.2 Kết đánh giá mức độ giảm độc lực dòng vi khuẩn Photobacterium damselae nhƣợc độc đột biến Từ dòng vi khuẩn thu đƣợc sau chiếu tia UV đƣợc tiếp tục đánh giá mức độ giảm độc lực môi trƣờng thạch máu cá 3.2.1 Kết thử khả dung huyết Độc tố dung huyết (haemolysis) yếu tố gây bệnh chủ yếu vi khuẩn P.damselae vật chủ Độc tố haemolysin bám lên màng tế bào hồng cầu, gây thủng màng giải phóng haemoglobin Kết tạo tƣợng dung huyết hoàn toàn (β-haemolysis) Đánh giá khả gây dung huyết chủng đột biến nhằm mục đích xem xét mức độ giảm độc lực độc tố này.Kết đƣợc thu đƣợc Bảng 3.2, Hình 3.3 36 Bảng 3.2 Kết phản ứng thử khả dung huyết Chủng Nguồn gốc Khả dung huyết Phân lập từ gan ruột cá bệnh β Dòng Sau phút chiếu UV β Dòng Sau 10 phút chiếu UV β Dòng Sau 15 phút chiếu UV β Dòng Sau 20 phút chiếu UV β Dòng Sau 25 phút chiếu UV γ Dòng Sau 30 phút chiếu UV γ Dòng Sau 35 phút chiếu UV γ Dòng Sau 40 phút chiếu UV γ Chủng tự nhiên T4.3 γ không dung huyết β: dung huyết β Sau tiến hành thử phản ứng mơi trƣờng thạch máu chúng tơi nhận thấy, có dịng khơng có tƣợng dung huyết thạch máu cừu là: : Dòng 5(UV 25 phút) Dòng 6(UV 30 phút),Dịng 7(UV 35 phút),Dịng 8(UV 40 phút), Có dịng gây dung huyết β : Dòng 1(UV phút) ,Dòng 2(UV 10 phút),Dòng (UV 15 phút),Dòng 4(UV 20 phút) Kết cho thấy dòng vi khuẩn khơng gây dung huyết (hay cịn gọi dung huyết γ) có xu hƣớng giảm độc lực so với chủng gốc T4.3 phân lập đƣợc từ trƣớc.Vì gây dung huyết yếu tố khả gây độc P.damselae theo Cutter D L., Kreger A S 1990 37 DịngT4.3 Hình 3.3 Khả dung huyết chủng T4.3 Dòng 3.2.2 Kết gây nhiễm cá Trên đối tƣợng động vật mẫn cảm, chúng tơi sử dụng cá Rơ phi có kích thƣớc 5cm để gây nhiễm dòng vi khuẩn gây đột biến ,1 dòng tự nhiên T4.3, Liều tiêm cho cá 0,5ml canh khuẩn chứa 105CFU/ml lô đối chứng tiêm nƣớc cất với liều tiêm 0,5ml/con Cá thí nghiệm đƣợc ni điều kiện cho giống tự nhiên, thời gian theo dõi 15 ngày Kết tiến hành gây nhiễm thực nghiệm có kết cụ thể Bảng 3.3 Hình 3.4 38 Bảng 3.3 Kết gây nhiễm cá sau 15 ngày tiêm Liều gây nhiểm Số cá thí (CFU/m nghiệm l) 0,5ml 30 nƣớc cất STT Dòng vi khuẩn Khơng có T4.3 đối chứng 105 Dịng 105 Số cá sống sót Tỷ lệ chết (%) Thời gian chết Biểu 28 6,6 24h Bơi lội nhanh nhẹn bình thƣờng 30 100 - Lở loét toàn than 24 đến - Nội tạng hoại tử có u hạt 216 h màu trắng xuất 30 83,3 24 đến - Xuất huyết toàn thân, nội tạng 264 h - Hoại tử gan thận Dòng 105 30 80 Dòng 105 30 93,3 Dòng 105 30 100 Dòng 105 30 24 20 Dòng 105 30 27 10 Dòng 105 30 25 16,7 10 Dòng 105 30 28 6,6 39 - Da tối màu, xuất huyết da, lở loét vị trí tiêm, nội tạng bắt đầu hoại tử - Cá chết sau 24 giờ, bị stress tiêm 24 h - Xuất lở loét toàn thân đến - Nội tạng hoại tử,xuất 144 hạt màu trắng - Cá bơi không định hƣớng, da 48 đến tối màu,lở loét vị trí tiêm, nội 360 h tạng có u hạt màu trắng, sƣng to - Cá bơi lội nhanh nhẹn - Khơng có tƣợng xuất 48 h huyết - Bắt mồi bình thƣờng - Tồn thân bên ngồi bình thƣờng - Khơng xuất hoại tử gan 36 h thận - Cá chết sau 24 giờ, bị stress tiêm - Cá bơi lội nhanh nhẹn - Khơng có tƣợng xuất 24h huyết - Bắt mồi bình thƣờng - Khơng có tƣợng lở lt - Khơng xuất điểm hoại 24 h tử gan thận - Cá chết sau 24 giờ, bị stress tiêm 24 h đến 200 h Kết thúc 15 ngày theo dõi sau tiêm thấy : Lô đối chứng tiêm với 0,5ml nƣớc cất/con cho tỉ lệ sống cá thí nghiệm lên đến 93,4% sau 24h tiêm.Chứng tỏ tiêm vào cá với liều 0,5ml dung dịch ảnh hƣởng khơng đáng kể đến hoạt động sống cá Dòng chủng tự nhiên T4.3 gây chết hồn tồn 100% cá thí nghiệm sau 3-10 ngày gây nhiễm,các dịng 1,2,3,có tỉ lệ chết cao dấu hiệu bệnh tích: cá bơi khơng định hƣớng, da tối màu, lở loét vị trí tiêm, nội tạng xuất u hạt màu trắng, sƣng to,gan thận bị hoại tử Kết tƣơng ứng với thí nghiệm đánh giá khả gây bệnh chủng vi khuẩn T4.3 Nguyễn Thị Trang (2015) Các lơ cá có gây nhiễm với dòng 5, dòng 6,dòng 7, dòng 8, cho số lƣợng cá sống sót cao hơn, từ 80% - 93,4% sau 24-48 lây nhiễm cá có tƣợng ăn hoạt động Tuy vậy, sau 48 cá hoạt động lại bình thƣờng Kết sau gây nhiễm cá cho ta thấy tiêm dòng vi khuẩn 5,6,7,8 vào cá tỉ lệ cá sống sót sau tiêm lớn tiêm chủng gốc T4.3 dòng 1,2,3,4.Vậy thấy dịng 5,dịng 6,dịng 7,dịng có xu hƣớng giảm độc lực so với chủng gốc T4.3 dòng lại Cá khỏe mạnh (tiêm nƣớc cất) Cá có dấu hiệu bệnh lý tiêm chủng gốc T4.3( gan thận bị hoại tử) 40 Cá sau tiêm vk dột biến Dịng Lơ cá sống sót sau tiêm Dịng Hình 3.4 Cá trƣớc sau gây nhiễm chủng đột biến Nhƣ vậy, từ kết thu đƣợc thí nghiệm gây đột biến đánh giá mức độ giảm độc lực, chúng tơi xác định đƣợc dịng vi khuẩn nhƣợc độc, dịng: dịng 5, dòng 6,dòng 7, dòng 3.3 Đánh giá khả tạo kháng thể bảo hộ cho cá chủng vi khuẩn Photobacterium damselae nhƣợc độc đột biến Một chủng vi khuẩn nhƣợc độc đạt tiêu chuẩn sản xuất vắc-xin đạt hai tiêu chí: an toàn động vật mẫn cảm có khả sinh kháng thể bảo hộ Từ kết xác định đƣợc dòng vi khuẩn nhƣợc độc, tiếp tục đánh giá khả tạo kháng thể bảo hộ dòng vi khuẩn đột biến, bao gồm: dòng 5, dòng 6, dòng 7, dòng Cá Rô phi đƣợc sử dụng cho nghiên cứu có kích thƣớc 5cm, mạnh khỏe, đƣợc kiểm tra khơng nhiễm bệnh hoại tử gan thận phản ứng PCR Liều gây miễn dịch cho cá 105 CFU/ml, sau gây miễn dịch sở, cá đƣợc thử thách chủng tự nhiên T4.3 với liều công cƣờng độc 107CFU/ml Kết đƣợc thể Bảng 3.4 Hình 3.5 Hình 3.6 41 Bảng 3.4 Kết đánh giá khả sinh kháng thể bảo hộ Gây nhiễm Dòng Dòng Dòng Dòng Số Số cá cá Tỉ lệ ban sống sống sót đầu sót (%) (con) (con) 30 30 30 18 20 6.6 % 60 % Trạng thái bệnh tích Trạng thái bơi Lờ đờ,chậm chạm Bơi lội nhanh nhẹn Trạng thái lấy thức ăn Bệnh tích cá Kém ăn - Xuất huyết toàn thân, nội tạng - Hoại tử gan thận Bình thƣờng - Khơng lở lt ngồi da - Không xuất hoại tử gan thận - Cá chết sau 24 giờ, bị stress tiêm 66,7 % Bơi lội bình thƣờng Bìnhng bình thƣờng Bình Thƣờng Kém ăn - Xuất huyết toàn thân, nội tạng - Hoại tử gan thận Dòng 30 21 70 % Bơi lội nhanh nhẹn Đối chứng (T 4.3) 30 3% Lờ đờ,chậm chạm Bình thƣờng - Bình thƣờng Hình 3.5.Biểu đồ thể tỉ lệ sống sau đánh giá kháng thể bảo hộ 42 Các lơ thí nghiệm đánh giá khả sinh kháng thể bảo hộ Các lơ thí nghiệm đánh Lơ cá đối chứng tiêm chủng gốc T4.3 giá khả sinh Hình kháng thể3.6.Cá bảo hộthí nghiệm sau 15 ngày đánh giá kháng thể bảo hộ Từ kết thấy sau 15 ngày đánh giá khả sinh kháng thể bảo hộ : dòng chủng gốc T4.3 gây chết tù 93,3% đến 97% cá thí nghiệm Cịn dịng: dòng 6, dòng 7, dòng cho tỉ lệ cá sống cao từ 60% đến 70% Kết phù hợp với thí nghiệm đánh giá khả sinh tạo kháng thể bảo hộ cá Vũ Thị Thanh Hƣơng (2011) nghiên cứu tạo dòng vi khuẩn E.ictaluri nhƣợc độc phục vụ chế tạo vắc xin phòng bệnh gan thận mủ Nhƣ với tỉ lệ sống nhƣ lựa chọn dịng vi khuẩn để làm sở cho việc sản xuất vắc – xin : dòng 6,dòng dòng 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ chủng Photobacterium damselae tự nhiên T4.3 đƣợc phân lập từ gan ruột cá mú, cá giò, cá chẽm, cá hồng mắc bệnh tụ huyết trùng thu số khu vực nuôi cá lồng vùng biển quanh đảo Cát Bà - Hải Phòng; vùng biển Đồng Châu - Thái Bình; vùng biển Hải Thịnh- Nam Định tiến hành sử dụng tác nhân tia UV để tạo chủng nhƣợc độc tạo đƣợc dòng đột biến kiểm tra khả giảm độc lực cá dòng gồm : Dòng (5 phút), Dòng (10 phút), Dòng (15 phút), Dòng (20 phút), Dòng (25 phút), Dòng (30 phút), Dòng (35 phút), Dòng (40 phút) Sau tiến hành đánh giá mức độ giảm độc lực dòng vi khuẩn qua đột biến thạch máu cá,chúng thu đƣợc kết nhƣ sau : có dịng vi khuẩn nhƣợc độc dòng 5,dòng 6,dòng 7,dòng dòng khơng có tƣợng giảm độc lực dịng 1,dịng 2,dòng 3,dòng Các dòng vi khuẩn nhƣợc độc đƣợc tiếp tục đánh giá khả sinh kháng thể bảo hộ cá thu đƣợc dịng có khả sinh kháng thể bảo hộ từ 60 % -70 % : dòng 6, dòng dịng sử dụng dịng vi khuẩn làm sở cho việc sản xuất vắc –xin phòng bệnh tụ huyết trùng cá biển ni KIẾN NGHỊ Do thời gian có hạn nên chúng tơi hồn thành đề tài với nội dung Cần có nhiều thời gian nghiên cứu mức độ sinh phân tử để kiểm tra có mặt gen độc tố có dịng vi khuẩn nhƣợc độc đƣợc tạo nhằm đánh giá cách xác chủng vi khuẩn nhƣợc độc để phục vụ chế tạo vắc – xin phòng bệnh tụ huyết trùng cho cá biển Tiếp tục đánh giá dòng vi khuẩn đột biến lựa chọn dịng có vi khuẩn an tồn nhất, tạo đáp ứng miễn dịch bền vững để nghiên chế tạo vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận cho cá biển Có thể sửng dụng phƣơng pháp khác để gây đột biến vi khuẩn nhằm tạo chủng vi khuẩn nhƣợc độc có chất lƣợng cao nhằm làm sở ản xuất vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng cá biển nuôi 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO A.Tài liệu nƣớc Trần Thị Kim Anh (2008) “Bài giảng kỹ thuật nuôi cá biển hải đặc sản” Khoa Nông Lâm Ngƣ, trƣờng Đại Học Vinh Bộ Thủy Sản (2006) Báo cáo đánh giá kết thực chƣơng trình phát triển ni trồng thủy sản giai đoạn 2000-2005 biện pháp thực đến năm 2010 168 trang Phạm Công Hoạt (2005), “Bài giảng vấn đề vi sinh vật” Bộ khoa học công nghệ Phạm Công Hoạt, Phạm Thị Tâm, Lê Văn Nhƣơng “Xác định số độc tố gây bệnh vi khuẩn Aeromonas hydrophila phân lập đƣợc từ cá chép bị bệnh xuất huyết đốm đỏ khu vực Đồng Bắc Bộ” Tạp chí nơng nghiệp PTNT, số (163) năm 2011 Marketing nông nghiệp, ngành Thủy sản Tổng quan ngành thuỷ sản Việt Nam, 14/6/2013 Vũ Thị Thanh Hƣơng, Bùi Thị Thanh Tịnh Nguyễn Quốc Bình (2011), Tạo chủng Edwardsilla ictaluri nhƣợc độc cách chọn môi trƣờng kháng sinh Rifampicin nhằm ngăn ngừa bệnh gan thận mủ cá tra, Kỷ yếu Hội nghịcơng nghệ sinh học tồn quốc, Khu vực phía Nam lần II, tiểu ban 5: Cơng nghệ sinh học Thủy sản, tr.108 Ngô Trọng Lƣ, Thái Bá Hổ, Nguyễn Kim Độ (2004), Kỹ thuật nuôi cá lồng biển, NXB NN TP HCM Trang tin thị trƣờng xúc tiến thƣơng mại, chuyên trang thủy sản, tin xuất nhập phát ngày 06/01/2015: Xuất thuỷ sản năm 2015 đối mặt nhiều thách thức Trang thông tin điện tử – tổng cục thủy sản, Tổng quan nuôi trồng thủy sản giới giai đoạn 2000-2012, 16/10/2014 10 Trần Phƣớc Linh (2008),”Phƣơng pháp phân tích vi sinh vật”, Nhà xuất giáo dục 45 11 Phạm Thị Bích Ngọc (2011), Tìm hiểu quy trình phát Vibriotrong thủy hải sản đơng lạnh, Khóa luận tốt nghiệp, Trƣờng đại học kỹ thuật công nghệ TP HCM, tr15, 40-42 12 Bùi Quang Tề (1998), “Chẩn đoán phịng trị số bệnh truyền nhiễm cá ni lồng thuỷ đặc sản”, Các cơng trình nghiên cứu khoa học ngành thuỷ sản 1996-2000, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, trang 109-119 13 Khuất Hữu Thanh (2006), Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội, tr186-198 14 Lê Anh Tuấn (2004a), “Tình hình ni cá mú Việt Nam: trạng trở ngại mặt kỹ thuật”, Tạp chí Khoa học – Cơng nghệ Thủy sản, Số đặc biệt kỷ niệm 45 năm thành lập Trƣờng, Trƣờng ĐH Thủy sản, tr 174-179 15 Trung tâm Khuyến nông – Khuyến ngƣ Quốc gia (2003), Kỹ thuật nuôi trồng số đối tƣợng thủy sản biển, NXB Nông nghiệp a B Tài liệu nƣớc 16 Agarinos, Romalde, A and Toranzo, A.E (1997a) Viability of starved Pasteurella piscicida in seawater monitored by fl o w cytometry and the effects of antibiotics on its resusci- tation Letters in Applied Microbiology 24 , 122–126 17 Alvarez JR, Lamba S., Dyer KY, Apuzzio JJ 2006 An unusual case of urinary tract infection in a pregnant woman with Photobacterium damsela Infect Dis Obstet Gynecol 80682 :1–3 18 Asato J., Kanaya F 2004 Fatal infection of the hand due to Photobacterium damsela: a case report Clin Infect Dis, 100–101 19 Austin, B., Austin, D.A., Blanch, A.R., Cerdà, M., Grimont, F., Grimont, P.A.D., Jofre, J., Koblavi, S., Larsen, J.L., Pedersen, K., Tiainen, T., Verdonck, L and Swings, J (1997) A comparison of methods for the typing of fish-pathogenic Vibrio spp Systematic and Applied Microbiology 20, 89–101 20 A Labella, C Berbel, M Manchado, D Castro and J J Borrego (2011) Photobacterium damselae subsp Damselae, an emerging pathogen affecting new culture marine fish species in Southern Spain Archives of virology 142, 2345-2364 46 21 Benjamin R.L., Scott E.L., Douglas R.C., Kenneth D.C (2008), Isolation of Rifampicin resistant Flavobacterium psychrophilum strains and their potential as live attenuated vaccine candidates,Vaccine 26: 5582 – 5589 22 Clarridge, J.L & Zighelboim-Daum, S (1985) Isolation and characterization of two hemolytic phenotypes of Vibrio damsela associated with a fatal wound infection Journal of Clinical Microbiology 21: 302-306 23 Cutter D L., Kreger A S 1990 Cloning and expression of the damselysin gene from Vibrio damsela.Infect Immun 58:266–268 24 Elizabeth A.C., NataliyaK., Arkady M., Katsuhiko M., Satish N., Alex G., Seth A.D (2001), Structural mechanism for Rifampicin inhibition of bacterial RNA polymerase,Cell 104: 901 – 912 25 Fouz B., Barja J L., Amaro C., Rivas C., Toranzo A E 1993 Toxicity of the extracellular products of Vibrio damsela isolated from diseased fish Curr Microbiol 27:341–347 26 Fouz, B., Biosca, E.G and Amaro, C (1997) High af fi nity iron-uptake systems in Vibrio damsela: role in the acquisition of iron from transferrin Journal of Applied Microbiology 82 , 157–167 27 Fouz, B., Toranzo, A.E., Millan, M & Amaro, C (2000) Evidence that water transmits the disease caused by the fish pathogen Photobacterium damselae subsp damselae Journal of Applied Microbiology 88: 531-535 28 Fraser, S.L., Purcell, B.K., Delgado, B., Jr., Baker, A.E & Whelen, A.C (1997) Rapidly fatal infection due to Photobacterium (Vibrio) damsela Clinical Infectious Diseases 25: 935- 936 29 FriesenJ.D Archambault J (1993), Genetics of eukaryotic RNA polymerases I, II, and III Microbiology and Molecular Biology Reviews: 57(3):p 703-724 30 Gauthier, G., Lafay, B., Ruimy, R., Breittmayer, V., Nicolas, J.L., Gauthier, M & Christen, R (1995) Small-subunit rRNA sequences and whole DNA relatedness concur for the reassignment of Pasteurella piscicida (Snieszko et al.) Janssen and Surgalla to the genus Photobacterium as Photobacterium damsela 47 subsp piscicida comb nov International Journal of Systematic Bacteriology 45: 139-144 31 Hawke, J P., Plakas, S M., Minton, R V., McPhearson, R M., Snider, T G & Guarino, A M (1987) Fish pasteurellosis of cultured striped bass (Morone saxatilis) in coastal Alabama Aquaculture: Volume 65, Issues 3–4, 15 September 1987, Pages 193–204 32 Kim H R., Kim J W., Lee M K., Kim J G 2009 Septicemia progressing to fatal hepatic dysfunction in a cirrhotic patient after oral ingestion of Photobacterium damsela: a case report Infection 37:555–556 33 KumarK.P., Chatterji D (1992), Differential inhibition of abortive transcription initiation at different promoters catalysed by E.coli RNA polymerase – effect of Rifampicin on purine or pyramidine–initiated phosphodiester synthesis, Federation of European biochemical societiesletter306 (1): 46 -50 34 Labella A., et al 2010 Toxicity of Photobacterium damselae subsp damselae strains isolated from new cultured marine fish Dis Aquat Org 92:31–40 35 Morris J G., Jr., et al 1982 Illness caused by Vibrio damsela and Vibrio hollisae Lancet i:1294–1297 36 Nicky B Buller (author), Department of Agriculture and Food, Western Australia Bacteria and Fungi from Fish and other Aquatic Animals: A Practical Identification Manual, 2nd Edition 37 Osorio C R., Romalde J L., Barja J L., Toranzo A E 2000 Presence of phospholipase D (dly) gene coding for damselysin production is not a pre-requisite for pathogenicity in Photobacterium damselae subsp damselae Microb Pathog 28:119–126 38 Pasqualina Laganas, Gabriella Caruso, Eleonora Minutoli, Renata Zaccone, Santi Delia Susceptibility to antibiotics of Vibrio spp and Photobacterium damsela ssp Piscicida strains isolated from Italian aquaculture farms The new microbiologica 34, 1/2011, 53-63 39 P.R Rajan , J.H.-Y Lin , M.-S Ho and H.-L Yang 1,2 Simple and rapid detection of Photobacterium damselae ssp piscicida by a PCR technique and 48 plating method Journal of Applied Microbiology 2003, 95, 1375–1380 With Institute of BioAgricultural Sciences, Academia Sinica, Nankang, Taipei, Taiwan and Institute of Biotechnology, National Cheng Kung University, Tainan, Taiwan 40 Rajan P.R1 , J.H.-Y Lin1 , M.-S Ho1 and H.-L Yang1,2 Simple and rapid detection of Photobacterium damselae ssp piscicida by a PCR technique and plating method Journal of Applied Microbiology 2003, 95, 1375–1380 With 1Institute of BioAgricultural Sciences, Academia Sinica, Nankang, Taipei, Taiwan and 2Institute of Biotechnology, National Cheng Kung University, Tainan, Taiwan 41 Robohm RA (1983) Pasteurella piscicida In: Anderson DP, Dorsonand M, Dubourget P (eds) Antigens of fish pathogens Collection Foundation Marcel Merieux, Lyon, France, pp 161–175 42 S.Botella, M.-J.Pujalte, M.-C.Maciasn, J Hernandez and E Garay (2002) Amplified fragment length polymorphism (AFLP) and biochemical typing of Photobacterium damselae subsp Damselae Journal of Applied Microbiology, Volume 93, Issue 4, 681–688 43 Thyssen, A., Van Eygen, S., Hauben, L., Goris, J., Swings, J and Ollevier, F The applica- tion of AFLP for taxonomic and epidemiological studies of Photobacterium damselae subsp piscicida International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 50 , 1013–1019 44 Yamane K., et al 2004 Two cases of fatal necrotizing fasciitis caused by Photobacterium damsela in Japan J Clin Microbiol 42:1370–1372 Tài liệu internet 45 http://en.wikipedia.org/wiki/Photobacterium_damselae_subsp._piscicida 46 http://www.slideshare.net/thuysantruongphat/chi-tit-v-bnh-ca-c-bin 47 www.intechopen.com/download/pdf/24078 48 www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24093021 http://vi.wikipedia.org/wiki/T%E1%BB%AD_ngo%E1%BA%A1i 49 ... Photobacterium damselae nhược độc phương pháp sử dụng tia UV nhằm phục vụ chế tạo vắc- xin phòng bệnh tụ huyết trùng số loại cá nuôi ” làm sở ban đầu hƣớng đến vi? ??c sản xuất vắcxin bệnh tụ huyết trùng cá. .. gen độc tố có dòng vi khuẩn nhƣợc độc đƣợc tạo nhằm đánh giá cách xác chủng vi khuẩn nhƣợc độc để phục vụ chế tạo vắc – xin phòng bệnh tụ huyết trùng cho cá biển Tiếp tục đánh giá dòng vi khuẩn. .. thịt cá sức khỏe ngƣời Phƣơng pháp phòng bệnh hiệu sử dụng vắc- xin Vi? ??c nghiên cứu loại vắc- xin phòng bệnh tƣơng đối cần thiết Một bƣớc quan trọng để nghiên cứu vắc- xin phải tạo đƣợc chủng vi khuẩn