Nghiên cứu tạo dòng vi khuẩn vibrio parahaemolyticus nhược độc phục vụ chế tạo vắc xin phòng bệnh hoại tử thận trên một số loại cá biển

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH -& - NGUYỄN HỒNG HẢI NGHIÊN CỨU TẠO DỊNG VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus NHƢỢC ĐỘC PHỤC VỤ CHẾ TẠO VẮC-XIN PHÒNG BỆNH HOẠI TỬ GAN THẬN TRÊN MỘT SỐ LOẠI CÁ BIỂN NI KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KỸ SƢ NI TRỒNG THỦY SẢN Vinh - 5/2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH -& - NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG VI KHUẨN Vibrio Parahaemolyticus NHƢỢC ĐỘC PHỤC VỤ CHẾ TẠO VẮC-XIN PHÒNG BỆNH HOẠI TỬ GAN THẬN TRÊN MỘT SỐ LOẠI CÁ BIỂN NI KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KỸ SƢ NI TRỒNG THỦY SẢN Người thực hiện: Nguyễn Hồng Hải Người hướng dẫn: Th.S Lê Minh Hải PGS.TS Phạm Thị Tâm Vinh – 5/2016 LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, cán thuộc Khoa Nông Lâm Ngư – Trường Đai học Vinh tạo điều kiện thuận lợi cho em thực tập hồn thành đề tài Em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới ThS Lê Minh Hải Giảng viên Khoa Nông Lâm Ngư – Trường Đại học Vinh, người trực tiếp tận tình hướng dẫn dìu dắt em suốt trình em thực tập hoàn thành đề tài Xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, anh chị bạn khoa Công Nghệ Sinh Học, Viện Đại học Mở - Hà Nội, đặc biệt cô giáo Phạm Thị Tâm hỗ trợ tạo điều kiện trang thiết bị, sở vật chất để tơi hồn thành đề tài sở thực tập Em quên gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, anh chị khóa trước, bạn bè ln bên em, tận tình giúp đỡ, cổ vũ động viên suốt thời gian em thực tập hồn thiện đề tài Trong q trình thực tập khơng tránh khỏi sai sót, kính mong thầy giáo, anh chị bạn đóng góp ý kiến để em tiếp thu hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Nghệ An, ngày tháng năm 2016 Sinh viên Nguyễn Hoàng Hải i MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1.Lý chọn đề tài Mục tiêu nghiên cứu CHƢƠNG TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 1.1.1 Phân loại 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá 1.1.4 Độc tố Vibrioparahaemolyticus 1.2 Tổng quan bệnh hoại tử gan thận cá biển Vibrio parahaemolyticus gây 1.2.1.Cơ chế gây bệnh vi khuẩn V prahaemolyticus 1.2.2.Triệu chứng gây bệnh vi khuẩn V prahaemolyticus 1.3 Tình hình nghiên cứu bênh vi khuẩn V Prahaemolyticus gây giới Việt Nam 1.3.1 Trên giới 1.3.2 Tình hình nƣớc 10 1.4 Tổng quan tạo chủng vi khuẩn nhƣợc độc 11 1.4.1 Tình hình nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn nhƣợc độc 11 1.4.1.1 Tình hình nghiên cứu giới 11 1.4.1.2 Tình hình nghiên cứu nƣớc 12 1.4.2 Các phƣơng pháp làm giảm độc lực vi khuẩn 13 1.4.3 Các tác nhân tạo chủng nhƣợc độc 15 1.4.3.1 Tác nhân vật lý 15 1.4.3.2 Tác nhân hóa học 17 1.5 Đặc điểm hệ miễn dịch cá xƣơng 20 1.5.1 Miễn dịch đặc hiệu 20 1.5.2 Miễn dịch tự nhiên 21 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 22 2.1.2 Vật liệu nghiên cứu 22 2.1.2.1 Chủng vi khuẩn 22 ii 2.1.2.2 Hóa chất 22 2.1.2.3 Môi trƣờng dung dich nuôi cấy 22 2.1.2.4 Thiết bị 22 2.2 Nội dung nghiên cứu 23 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 24 2.3.1 Phƣơng pháp vi sinh 25 2.3.2 Phƣơng pháp tạo chủng nhƣợc độc kỹ thuật gây đột biến thực nghiệm 26 2.3.2.1 Phƣơng pháp gây đột biến kháng sinh rifampicinError! Bookmark not defined 2.3.3 Phƣơng pháp sinh học phân tử 27 2.3.3.1 Phƣơng pháp tách DNA tổng số 27 2.3.3.2 Khuếch đại gen độc tố gây bệnh hoại tử thận kỹ thuật PCR(Polymerase Chain Reaction) 28 2.3.3.3 Phƣơng pháp điện di DNA gel agarose Error! Bookmark not defined 2.3.4 Phƣơng pháp gây nhiễm động vật thí nghiệm 30 2.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu 30 2.5 Thời gian địa điểm nghiên cứu 30 2.5.1 Thời gian 30 2.5.2 Địa điểm 30 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Kết tạo dòng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus nhƣợc độc kháng sinh rifampicin 31 3.2 Kết đánh giá mức độ giảm độc lực dịng đơt biến 43 3.2.1 Kết thử khả dung huyết 43 3.2.2 Kết chạy PCR xác định gen độc tố 45 3.2.2 Kết gây nhiễm cá 46 3.3 Kết đánh giá khă tạo kháng thể bảo hộ cho cá 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 PHỤ LỤC 56 iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các thiết bị dùng nghiên cứu 23 Bảng 2.2.Thành phần phản ứng 29 Bảng 2.3: Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR 30 Bảng 3.1 Số khuẩn lạc sống sót sau xử lýkháng sinh rifampicin 42 Bảng 3.2 Kết khả dung huyết 44 Bảng 3.3 Kết kiểm tra có mặt gen độc tố 46 Bảng 3.4 Kết gây nhiễm cá sau 15 ngày tiêm 47 Bảng 3.5 Kết đánh giá khă sinh kháng thể bảo hộ cho cá dòng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus đột biến so với chủng đối chứng 50 iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình thái vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus Hình 1.2 Tác động tia tử ngoại tạo dimer thymine .16 Hình 1.3 Tác động tia UV làm cho DNA có chỗ phình cấu trúc 17 Hình 1.4.Cấu trúc RNA polymerase (RNAP) 19 Hình 1.5 Vùng kháng Rif tiểu đơn vị β RNAP [13] 19 Hình 1.6 Đột biến kháng Rif vùng I gen rpoB .20 Hình 2.1 Sơ đồ khối nghiên cứu 24 Hình 3.1 Khuẩn lạc chịu đƣợc mơi trƣờng TCBScó bổ sung kháng sinh .43 Hình 3.2 Khả dung huyết chủng A3.13 Dòng 44 Hình 3.3 Kích thƣớc DNA tổng số dòng 45 Hình 3.4: Sản phẩm PCR xác định gen độc tố Tox R, tlh 46 Hình 3.5 Cá sau gây nhiễm chủng đột biến, chủng đối chứng A3.13 48 cá khoẻ mạnh 48 v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Brain Heart Infusion Broth BHI Broth Base pair bp Brain Heart Infusion BHI Deoxyribonucleotide Acid DNA Deoxynucleotidetriphosphate dNTP Food and Drug Adimistration FDA Polymerase Chain Reaction PCR Rifampicin Rif Thiosulfate Citrae Bile Salt Sucrose TCBS vi MỞ ĐẦU 1.Lý chọn đề tài Hiện nay, đối tƣợng nuôi mơ hình ni thủy sản Việt Nam phong phú.Trong đó, mơ hình ni cá lồng ngày khẳng định đƣợc vị trí Đây mơ hình đƣợc áp dụng cho nhiều lồi cá có giá trị kinh tế cao Cá nuôi lồng phải chịu nhiều yếu tố gây stress phải thích nghi với môi trƣờng sống mới, tập quán sinh sản kiếm ăn bị đảo lộn, sức đề kháng bị ảnh hƣởng Vì thế, cá ni lồng thƣờng mắc số bệnh vi khuẩn virus gây Đáng lƣu ý bệnh hoại tử gan thận cá biển chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra, làm thiệt hại không nhỏ đến ngƣời nuôi cá biển Bệnh hoại tử gan thận xuất hầu hết loài cá biển (cá mú, cá chẽm, cá giờ, cá hồng, cá bớp…), đặc biệt cá nuôi lồng, xuất cá nƣớc Khi vi khuẩn V.parahaemolyticus xâm nhập vào thể cá biển, gây hoại tử lên nội quan cá (đặc biệt gan, thận), lở loét lớp biểu bì Gan thận bị hoại tử, gan từ màu xám nâu chuyển thành màu vàng, làm cho cá biển chết hàng loạt Bệnh thƣờng xảy giai đoạn cá, tìm phƣơng pháp phịng trị bệnh hạn chế tổn thất dịch bệnh gây cần thiết Thực tế nuôi trồng thủy sản, ngƣời dân thƣờng sử dụng nhiều hóa chất kháng sinh để khống chế vi khuẩn này, song việc sử dụng kháng sinh gây tƣợng nhờn thuốc không mang lại hiệu cao Vi khuẩn có khả tạo màng bảo vệ trƣớc thuốc diệt khuẩn kháng sinh Chính thế, dịch bệnh thƣờng bùng phát trở lại nhanh sau thuốc hết tác dụng Mặt khác, dƣ lƣợng kháng sinh sản phẩm từ cá biển gây ảnh hƣởng xấu đến chất lƣợng thịt cá sức khỏe ngƣời Hiện phƣơng pháp phòng bệnh hiệu sủ dụng vắc-xin Việc nghiên cứu loại vắc-xin phòng bệnh tƣơng đối cần thiết Một bƣớc quan trọng để nghiên cứu vắc-xin phải tạo đƣợc chủng vi khuẩn nhƣợc độc, làm sở ban đầu hƣớng đến việc sản xuất vắc-xin bệnh hoại tử gan thận cá biển Xuất phát từ lý luận thực tiễn trên, chúng tơi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tạo dịng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus nhược độc phục vụ chế tạo vắcxin phòng bệnh hoại tử thận số loại cá biển.” làm sở ban đầu hƣớng đến việc sản xuất vắc-xin bệnh hoạt tử gan thận cá biển Mục tiêu nghiên cứu Tạo đƣợc chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus nhƣợc độc kỹ thuật đột biến sử dụng kháng sinh rifampicine Tạo đƣợc chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus giảm độc lực đƣợc đánh giá tính an tồn, khả tạo kháng thể bảo hộ làm nguyên liệu có chất lƣợng tốt để sản xuất vắc-xin bệnh hoại tử gan thận cá biển 40µg/ml Khuẩn lạc vi khuẩn sống sót sau xử lý rifampicin 40µg/ml 45µg/ml Khuẩn lạc vi khuẩn sống sót sau xử lý rifampicin 45µg/ml Hình 3.1 Khuẩn lạc chịu đƣợc mơi trƣờng TCBScó bổ sung kháng sinh Qua dòng sử dụng kháng sinh với nồng độ khác nhận thấy: số khuẩn lạc vi khuẩn sống sót tỷ lệ nghịch với nồng độ kháng sinh bổ sung vào môi trƣờng BHI So sánh với dịng A3.13 đối chứng khơng sử dụng kháng sing dịng thứ nhất, mật độ vi khuẩn sống sót giảm đột ngột, ½ so với đĩa đối chứng khơng sử dụng kháng sinh Từ dịng thứ đến dòng thứ số khuẩn lạc sống sót cịn lại ít, cịn khuẩn lạc dịng thứ Nhƣ chúng tơi thu đƣợc dòng vi khuẩn đột biến sau xử lý kháng sinh Bây để xác định dịng có dịng đột biến theo hƣớng giảm độc lực dịng khơng, tiến hành đánh giá mức độ giảm độc lực dòng đột biến 3.2 Kết đánh giá mức độ giảm độc lực dòng V.parahaemolyticus đơt biến Từ dịng vi khuẩn thu đƣợc sau xử lý rifampicin đƣợc tiếp tục đánh giá mức độ giảm độc lực môi trƣờng thạch máu, chạy PCR kiểm tra độc tố gây nhiểm cá 3.2.1 Kết thử khả dung huyết dòng V.parahaemolyticus đột biến Độc tố dung huyết (haemolysis) yếu tố gây bệnh chủ yếu vi khuẩn V Parahaemolyticus vật chủ Độc tố haemolysin bám lên màng tế bào hồng cầu, gây thủng màng giải phóng haemoglobin Kết tạo tƣợng dung huyết hoàn toàn (β-haemolysis) Đánh giá khả gây dung huyết chủng đột biến nhằm mục đích xem xét mức độ giảm độc lực độc tố Kết đƣợc thu đƣợc Bảng 3.2, Hình 3.2 43 Bảng 3.2 Kết khả dung huyết dòng V.parahaemolyticus đột biến Chủng Nguồn gốc Khả dung huyết Chủng tự nhiên A3.13 Phân lập từ gan ruột cá hồng β Dòng Dòng Dòng Dòng Dòng Dòng Dòng Dòng Chịu đƣợc nồng độ kháng sinh(10µg/ml) Chịu đƣợc nồng độ kháng sinh (15µg/ml) Chịu đƣợc nồng độ kháng sinh (20 µg/ml) Chịu đƣợc nồng độ kháng sinh (25 µg/ml) Chịu đƣợc nồng độ kháng sinh (30 µg/ml) Chịu đƣợc nồng độ kháng sinh (35 µg/ml) Chịu đƣợc nồng độ kháng sinh (40 µg/ml) Chịu đƣợc nồng độ kháng sinh (45 µg/ml) Ghi chú: γ khơng dung huyết, β dung huyết β γ β γ γ γ β γ A3.13 Khơng xuất vịng dung huyết Xuất dung huyết vòng dung huyết rõ Hình 3.2 Khả dung huyết chủng A3.13 Dòng 44 Qua kết thử khả dung huyết dịng vi khuẩn chúng tơi thu đƣợc kết là: - Chủng tự nhiên A3.13, dòng 1, dịng 3, dịng dịng có khả dung huyết => chƣa giảm độc lực - Dòng 2, dòng 4, dòng 5, dòng 6, dòng dịng khơng có khả dung huyết => giảm độc lực Từ chúng tơi chọn đƣợc dịng đột biết theo chiều hƣớng giảm độc lực là: dòng 2, dòng 4, dòng 5, dòng 6, dòng Chúng tơi tiếp tục sử dụng dịng để tiếp tục đánh giá khả tạo kháng thể bảo hộ cho cá 3.2.2 Kết chạy PCR xác định gen độc tố dòng V.parahaemolyticus đột biến Các dòng vi khuẩn đƣợc lựa chọn nghiên cứu mục 3.2.1 đƣợc tiếp tục sử dụng để xác định gen độc tố Mục đích thí nghiệm để xác định chế giảm độc lực chủng nghiên cứu Các dòng vi khuẩn: dòng 1, dòng 2, dòng 3, dòng 4, dòng 5, dòng 6, dịng 7, dịng 8, A3.13, đƣợc ni cấy mơi trƣờng BHI, đem tăng sinh khối máy lắc vòng 24h, 28ºC với tốc độ 150 vòng/phút Sau đem dịch ni cấy ly tâm thu cặn tế bào Điện di kiểm tra lại Kết đƣợc thể Hình 3.3 (M: maker; 9: A3.13; 1: dòng 1; 2: dòng 2; 3: dòng 3; 4: dòng 4; 5: dòng 5; 6: dòng 6; 7: dòng 7; 8: dịng 8; M: maker.) Hình 3.3 Kích thƣớc DNA tổng số dòng chủng A3.13 g Kết đƣợc thể qua Hình 3.3 cho thấy kết tách DNA tốt, sản phẩm đƣợc dùng làm nguyên liệu cho phản ứng PCR Chúng tiến hành kiểm tra gen độc tố Tox R, tdh, tlh, trh dòng đột biến chủng A3.13 tự nhiên kết đƣợc thể Bảng 3.3.Hình 3.4 45 Bảng 3.3 Kết kiểm tra có mặt gen độc tố dòng V.parahaemolyticus đột biến Dòng A3.13 Dòng Dòng Dòng Dòng Dòng Dòng Dòng Dòng Tox R Có Có Có Có Có Có Có Có Có tdh Không Không Không Không Không Không Không Không Không tlh có có có có có có có có có trh có có có có có có có có có Qua bảng kết kiểm tra gen độc tố dòng đột biến chủng A3.13 chứng tỏ gen độc tố chủng sau xử lý rifampicin hồn tồn giống số lƣợng kích thƣớc so với chủng tự nhiên Theo nghiên cứu Zulkifli cộng sự, 1987 2009[31] Gen toxR có mặt tất chủng không gây bệnh chủng gây bệnh, có chức điều hịa biểu gen độc tố loài V parahaemolyticus Sự có mặt gen dòng vi khuẩn chứng tỏ chúng V.parahaemolyticus q trình gây đột biến khơng có tƣợng tạp nhiễm Gen Tox R (368bp) Gen tlh (450bp) Hình 3.4: Sản phẩm PCR xác định gen độc tố Tox R, tlh Từ kết đánh giá mức độ giảm độc lực kết xác định gen đôc tố PCR cho phép bƣớc đầu kết luận sơ rằng: dòng 2, dòng 4, dòng 5, dòng 6, dòng dòng vi khuẩn bị đột biến gen theo hƣớng giảm độc lực 3.2.2 Kết gây nhiễm cá dòng V.parahaemolyticus đột biến Trên đối tƣợng động vật mẫn cảm, sử dụng cá mú có kích thƣớc 3cm để gây nhiễm dòng vi khuẩn gây đột biến dòng tự nhiên A3.13, Liều tiêm cho cá 0,5ml canh khuẩn chứa 105CFU/ml Cá thí nghiệm đƣợc nuôi điều kiện cho giống tự nhiên, thời gian theo dõi 15 ngày Kết tiến hành gây nhiễm thực nghiệm dòng đột biến 46 dòng tự nhiên ban đầu A3.13 cho cá Mú phịng thí nghiệm có kết cụ thể Bảng 3.4 Hình 3.5 Bảng 3.4 Kết gây nhiễm cá sau 15 ngày tiêm dòng V.parahaemolyticus đột biến STT Dòng vi khuẩn Liều gây nhiểm (CFU/ml) Số cá thí nghiệm Số cá sống sót Tỷ lệ chết (%) Thời gian chết Biểu A3.13 đối chứng 105 30 100 3-7 ngày - Xuất huyết toàn thân, nội tạng - Hoại tử gan thận Dòng 105 30 90 5-7 ngày Dòng 105 30 25 16,7 5-7 ngày Dòng 105 30 83,3 3-10 ngày Dòng 105 30 22 26,6 3-6 ngày Dòng 105 30 27 10 3-5 ngày Dòng 105 30 24 20 3-7 ngày Dòng 105 30 100 3-9 ngày Dòng 105 30 20 33,3 4-7 ngày 10 Nƣớc cất 105 30 30 0 47 - Lờ đờ, hoạt động bơi lội - xuất huyết chỗ tiêm, thân vây,biếng ăn - Không xuất huyết da - Không xuất điểm hoại tử gan thận - Cá chết sau 24 giờ, bị stress tiêm - Lờ đờ, hoạt động bơi lội - xuất huyết chỗ tiêm, thân vây,biếng ăn - Không xuất huyết da - Không xuất điểm hoại tử gan thận - Cá chết sau 24 giờ, bị stress tiêm - Khơng xuất huyết da - Không xuất điểm hoại tử gan thận - Cá chết sau 24 giờ, bị stress tiêm - Khơng xuất huyết da - Không xuất điểm hoại tử gan thận - Cá chết sau 24 giờ, bị stress tiêm - Xuất huyết toàn thân, nội tạng - Hoại tử gan thận - Không xuất huyết da - Không xuất điểm hoại tử gan thận - Cá chết sau 24 giờ, bị stress tiêm - Khơng xuất huyết da - Không xuất điểm hoại tử gan thận Lơ cá có đƣợc gây bệnh với dòng 1, dòng 3, dòng chủng tự nhiên A3.13 sau 48-72 gây nhiễm cá bắt đầu chết Chủng tự nhiên A3.13 dòng gây chết hồn tồn cá thí nghiệm, dịng cịn con, dịng cịn Các lơ cá có gây nhiễm với dịng 2, dịng 4, dòng 5, dòng 6, dòng 8, cho số lƣợng cá sống sót cao hơn, từ 20-27 sau 24-48 lây nhiễm cá có tƣợng ăn hoạt động Tuy vậy, sau 48 cá hoạt động lại bình thƣờng Một số cá bị chết nhƣng bị stress tiêm Cá đƣợc tiêm chủng đột biến Cá đƣợc tiêm chủng A3.13 đối chứng Cá khoẻ mạnh khơng tiêm Hình 3.5 Cá sau gây nhiễm chủng đột biến, chủng đối chứng A3.13 cá khoẻ mạnh 48 Lô cá đƣợc tiêm chủng A3.13 đối chứng, dòng 1, dòng 3, dòng cá chết có biểu bệnh hoại tử gan thận vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây nhƣ: cá biếng ăn, hoạt động bơi bị rối loạn Cơ thể có màu đen đặc biệt vùng lƣng vết thƣơng tổn da, vây sƣng lên bị lở loét Cơ hạch, mang nhợt nhạt, mắt cá lồi đục Lớp dƣới da có nhiều sắc tố melanin màu đen thể dấu hiệu hoại tử, có tƣợng lở loét lớp biểu bì Lá lách, gan, thận bị hoại tử, vết hoại tử lan nhanh, hoá lỏng lách có màu đỏ anh đào, dần hình dạng ban đầu nó, gan chuyển từ màu xám nâu thành màu vàng Các quan bên khoang bụng xuất mạch máu rõ lên Tim cá bị bệnh xuất vết nâu đen Cá đƣợc tiêm chủng đột biến dòng 2, dòng 4, dòng 5, dịng 6, dịng khơng có biểu bênh hoại tử gan thận vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây Nhƣ vậy, từ kết thu đƣợc thí nghiệm gây đột biến đánh giá mức độ giảm độc lực, xác định đƣợc dịng vi khuẩn nhƣợc độc, dòng: dòng 2, dòng 4, dòng 5, dòng 6, dòng 3.3 Kết đánh giá khă tạo kháng thể bảo hộ cho cá dòng V.parahaemolyticus đột biến nhƣợc độc Một chủng vi khuẩn nhƣợc độc đạt tiêu chuẩn sản xuất vắc-xin đạt hai tiêu chí: 1) an tồn động vật mẫn cảm 2) có khả sinh kháng thể bảo hộ Từ kết xác định đƣợc dịng vi khuẩn nhƣợc độc, chúng tơi tiếp tục đánh giá hai tiêu chí dịng vi khuẩn đột biến là: dòng 2, dòng 4, dòng 5, dòng 6, dòng Cá mú đƣợc sử dụng cho nghiên cứu có kích thƣớc 3cm, mạnh khỏe, đƣợc kiểm tra không nhiễm bệnh hoại tử gan thận phản ứng PCR Liều gây miễn dịch cho cá 105CFU/ml, sau gây miễn dịch sở 15 ngày, cá đƣợc thử thách chủng tự nhiên A3.13 với liều công cƣờng độc 107CFU/ml (Yong-hua Hu, Tian Deng, Bo-guang Sun, Li Sun,2012) Kết đƣợc thể Bảng 3.5 49 Bảng 3.5 Kết đánh giá khă sinh kháng thể bảo hộ cho cá dòng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus đột biến nhƣợc độc so với chủng đối chứng Dòng Gây nhiễm Số cá Số cá sống ban đầu sót Dịng 30 26 Dịng 30 28 Dòng 30 26 Dòng 30 10 Dòng 30 24 Chủng đối chứng A3.13 30 Trạng thái bệnh tích - Chậm chạp, lờ đờ, ăn - Không xuất huyết da - Không xuất điểm hoại tử gan thận - Cá chết sau 24 giờ, bị stress tiêm - Lấy thức ăn, bơi bình thƣờng - Khơng xuất huyết da - Không xuất điểm hoại tử gan thận - Cá chết sau 24 giờ, bị stress tiêm - Chậm chạp bình thƣờng, ăn - Khơng xuất huyết da - Không xuất điểm hoại tử gan thận - Cá chết sau 24 giờ, bị stress tiêm - Cá chết sau 60 - Xuất huyết toàn thân, nội tạng - Hoại tử gan thận - Chậm chạp, lờ đờ, ăn - Không xuất huyết da - Không xuất điểm hoại tử gan thận - Cá chết sau 24 giờ, bị stress tiêm - Cá chết sau 60 - Xuất huyết toàn thân, nội tạng - Hoại tử gan thận Qua bảng kết thu đƣợc thấy khả tạo kháng thể bảo hộ cho cá dòng cao nhất, dòng 2, dòng Trạng thái bệnh tích dịng gần giống nhƣ chậm chạp, lờ đờ, ăn, không xuất huyết, cá chết sau 24 bị stress sau tiêm Ở kết gây cảm nhiểm cho cá số cá chết dịng cao dịng 6, nhƣng qua kết thử khả tạo kháng thể bảo hộ cho cá số cá chết dòng 50 lại cao dòng Và số cá chết dịng lại có dấu hiệu bệnh hoại tử gan thận vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây Từ kết kết luận dòng: dòng 2, dòng 4,dòng 5, dòng 8, có khả sinh kháng thể bảo hộ cá, đạt yêu cầu nguyên liệu để sản xuất Vắc-xin Vì sử dụng dịng làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin Và không nên sử dụng dòng để làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin dịng có đột biến giảm độc lực nhƣng khả tạo kháng thể bảo hộ cho cá thấp gây chết cá 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Từ chủng Vibrio parahaemolyticustự nhiên A3.13 đƣợc phân lập từ gan ruột cá hồng có dấu hiệu hoại tử Cát Bà, Hải Phịng Chúng tơi tiến hành sử dụng kháng sinh rifampicin để tạo chủng nhƣợc độc Chúng tạo đƣợc dòng đột biến cụ thể là: dòng 1(Chịu đƣợc nồng độ kháng sinh 10µg/ml), dịng (Chịu đƣợc nồng độ kháng sinh 15µg/ml), dịng (Chịu đƣợc nồng độ kháng sinh 20µg/ml), dịng (chịu đƣợc nồng độ kháng sinh 25 µg/ml), dịng (chịu đƣợc nồng độ kháng sinh 30µg/ml), dịng (Chịu đƣợc nồng độ kháng sinh 35µg/ml), dịng (chịu đƣợc nồng độ kháng sinh 40µg/ml), dịng (chịu đƣợc nồng độ kháng sinh 45µg/ml) - Từ dòng vi khuẩn qua đánh giá mức độ giảm độc lực môi trƣờng thạch máu, PCR cá Chúng tơi xác định đƣợc dịng vi khuẩn nhƣợc độc, dịng: dịng 2, dòng 4, dòng 5, dòng 6, dòng - Từ dòng vi khuẩn đƣợc đánh giá khả sinh kháng thể bảo hộ chúng xác định đƣợc dịng:dịng 2, dịng 4, dịng 5, dịng 8, có khả sinh kháng thể bảo hộ cá Khả tạo kháng thể bảo hộ dòng cao với tỷ lệ cá sống lên đến 93,3%, dòng dịng tỷ lệ cá sống 86,6% dòng tỷ lệ cá sống 80% Các dịng sử dụng làm ngun liệu để sản xuất vắc-xin Kiến nghị - Tiếp tục đánh giá dòng vi khuẩn đột biến lựa chọn dịng có vi khuẩn an tồn nhất, tạo đáp ứng miễn dịch bền vững để nghiên chế tạo vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận cho cá biển - Qua kết chạy PCR thấy kích thƣớc số lƣợng gen không thay đổi so với chủng gốc ban đầu, vi khuẩn đột biến giảm độc lực Chúng nghi ngờ đột biến điểm để kiểm tra xác dạng đột biến cần giải trình tự gen đột biến so với gen tự nhiên gốc ban đầu Nhƣng thời gian có hạn nên chúng tơi hồn thành đề tài với nội dung - Nên tiếp tục nghiên cứu bệnh hoại tử gan thận vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây loài cá biển khác 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Từ Thanh Dung (2011), Thử nghiệm văcxin phòng bệnh gan thận mủ cho cá tra ni thâm canh, Tạp chí thương mại thủy sản [2] Vũ Thị Thanh Hƣơng, Bùi Thị Thanh Tịnh Nguyễn Quốc Bình (2011), Tạo chủng Edwardsilla ictaluri nhƣợc độc cách chọn môi trƣờng kháng sinh Rifampicin nhằm ngăn ngừa bệnh gan thận mủ cá tra, Kỷ yếu Hội nghịcông nghệ sinh học tồn quốc, Khu vực phía Nam lần II, tiểu ban 5: Công nghệ sinh học Thủy sản, tr.108 [3]Phạm Thị Bích Ngọc (2011), Tìm hiểu quy trình phát Vibriotrong thủy hải sản đơng lạnh, Khóa luận tốt nghiệp, Trường đại học kỹ thuật công nghệ TP HCM, tr15, 40-42 [4] Khuất Hữu Thanh (2006), Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội, tr186-198 Tài liệu tiếng Anh [5] Amy J.V., Joseph D.B., Stephanie P.F., Christine T.H., Kimothy L.S.,Paul K (2002), Molecular analysis of Rifampicin resistance in Bacillus anthracis and Bacillus cereus, Antimicrobial agents and chemotherapy46 (2): 511-513 [6] Austin B., Austin D.A (2007) Vibrios, bacterial fish pathogens: diseases in farmed and wild fish, Praxis Publishing Ltd, Chichester, UK, p 594 [7] Alsina M and Blanch A.R (1994) Improvement and update of a set of keys for biochemical-identification of Vibrio species, Journal of Applied Bacteriology 77: 719-721 [8] Benjamin R.L., Scott E.L., Douglas R.C., Kenneth D.C (2008), Isolation of Rifampicin resistant Flavobacterium psychrophilum strains and their potential as live attenuated vaccine candidates,Vaccine 26: 5582 – 5589 [9] Chao G., Jiao X., Zhou X., Yang Z., Huang J., Zhou L., Qian X (2009), Distribution, prevalence, molecular typing, and virulence of Vibrio parahaemolyticusisolated from different sources in coastal province Jiangsu, China, Food Control 20: 907-912 [10] Christopher A.B., Thomas J.C., Kim O (2011),Vibrio parahaemolyticus cell biology and pathogenicity determinants", Microbes and Infection 13: 992-1001 [11] Daniels N.A., MacKinnon L., Bishop R., Altekruse S., Ray B., Hammond R.M., Thompson S., Wilson S., Bean N.H., Griffin P.M., Slutsker L 53 (2000),Vibrio parahaemolyticus infections in the United States 1973–1998 Journal of Infectious Diseases 181: 1661 – 1666 [12]Duff D.C.B (1942),The oral immunization of trout against Bacterium salmonicida, Journal Immunology 44: 87-94 [13] Elizabeth A.C., NataliyaK., Arkady M., Katsuhiko M., Satish N., Alex G., Seth A.D (2001), Structural mechanism for Rifampicin inhibition of bacterial RNA polymerase,Cell 104: 901 – 912 [14] Harris K.A., Hartley J.C (2003), Development of broad-range 16S rDNA PCR for use in the routine diagnostic clinical microbiology service, Journal of Medical Microbiology 52: 685-691 [15] Harikrishnan R., Balasundaram C., Heo M.S (2010), Molecular studies, disease status and prophylactic measures in grouper aquaculture: Economic importance, diseases and immunology, Aquaculture 309: 1-14 [16] Harikrishnan R., Kim J.S., Balasundaram C., Heo M.S (2012) Vaccination effect of liposomes entrapped whole cell bacterial vaccine on immune response and disease protection in Epinephelus bruneus against Vibrio harveyi, Aquaculture 342-343: 69-74 [17] Honda T., Iida T (1993),The pathogenicity ofVibrio parahaemolyticus& the role of thermostable direct hemolysin & related hemolysins Rev Med Microbiol 4: 106–113 [18] FriesenJ.D Archambault J (1993), Genetics of eukaryotic RNA polymerases I, II, and III Microbiology and Molecular Biology Reviews: 57(3):p 703-724 [19] Kaper J.B., Colwell R.R., Joseph S.W., Colwell R.R., Kaper J.B (1983),Vibrio parahaemolyticus and related halophilic vibrios Critical Rev Microbiol 10: 77-123 [20] Kaneko T., Colwell R.R (1973), Ecology of Vibrio parahaemolyticus in Chesapeake Bay", Journal of Bacteriology 113: 24-32 [21] Kazuyuki K., Shigeko T., Hiroo I (1979), Effect of Mediumon Flagellation of Vibrio parahaemolyticus, Appied and Environmental Microbioogyl 37: 1248-1249 [22] KumarK.P., Chatterji D (1992), Differential inhibition of abortive transcription initiation at different promoters catalysed by E.coli RNA polymerase – effect of Rifampicin on purine or pyramidine–initiated phosphodiester synthesis, Federation of European biochemical societiesletter306 (1): 46 -50 [23] Lee, A.S.G., Irene H.K., Lim, Lynn L.H Tang Sin Yew Wong,(2005) High frequency of mutations in the rpoB gene in Rifampicin – resistant clinical 54 isolates of Mycobacterium tuberculosis from Singapore Journal of Clinical Microbiology, 43(4): 2026 – 2027 [24] Nash G., Anderson I.G., Shariff M., Shamsudin M.N (1987), Bacteriosis associated with epizootic in the giant sea perch, Lates calcarifer, and the estuarine grouper, Epinephelus tauvina, cage cultured in Malaysia, Aquaculture 67:105-111 [25] Nishibuchi M., Kaper J.B (1995), Thermostable direct hemolysin gene of Vibrio parahaemolyticus a virulence gene acquired by a marine bacterium Infection and immunity 63(6): 2093–2099 [26] Nishibuchi M., Kumagai K., Kaper J.B (1991), Contribution of the tdh1 gene of Kanagawa phenomenon-positive Vibrio parahaemolyticus to production of extracellular thermostable direct hemolysin Microbial Pathogeness 11: 453–460 [27] Tuyet D.T., Thiem V.D., Von S.L., Chowdhury A., Park E., Canh D.G., Chien B.T., Van T.T., Naficy A., Rao M.R., Ali M., Lee H., Sy T.H., Nichibuchi M., Clemens J., Trach D.D (2006), Clinical, epidemiological, and socioeconomic analysis of an outbreak of Vibrio parahaemolyticus in Khanh Hoa Province, Vietnam Journal of Infectious Diseases 186(11): 1615–1620 [28] Shyne A.P.S, Sobbhana K S, George K C, Paul R.R (2008) Phenotypic characteristics and antibiotic sensitivity of Vibrio parahaemolyticus strains isolated from diseases grouper (Epinephelus spp.), joumal of the marine biological association 50: 1-6 [29] Van W.B (2008),A history of fish immunology and vaccination The early days, Fish Shellfish Immunol 25: 397-408 [30] Zhang X.H., Austin B (2005),A review haemolysins in Vibrio species, Journal of Applied Microbiology 98: 1011–1019 [31] Zulkifli Y., Alitheen N.B., Son R., Yeap S.K., Lesley M.B.,Raha A.R (2009), Identification of Vibrio parahaemolyticus isolates by PCR targeted to the toxR gene and detection of virulence genes International Food Research Journal 16: 289-296 Tài liệu internet [32] http://doc.edu.vn/tai-lieu/de-tai-tim-hieu-ve-vibrio-sp-gay-benh-tren-thuy-san11372/ [33] http://www.tuamvisinh.com/tin-tuc/kiem-tra-dinh-tinh-vibrio-cholera-vibrioparahaemolyticus.html [34] http://vi.wikipedia.org/wiki/T%E1%BB%AD_ngo%E1%BA%A1i 55 PHỤ LỤC Bảng1 Môi trƣờng TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Salts) Peptone Cao men Natri citrate Natri thiosulfate Mật bị khơ Natri clorid Natri cholat Feric citrate Saccharose Dung dịch xanh thymol 1% Dung dịch xanh bromothymol 0,2% Thạch sợi Nƣớc cất vừa đủ Peptone NaCl Cao thịt Thạch Nƣớc cất Máu thỏ máu cừu Dịch não dê Dịch tim bò Polypeptone NaCl Na2HPO4 Dextrose Nƣớc cất 10 g 5g 10 g 10 g 5g 10 g 3g 1g 20 g ml 20 ml 15 g 1000ml Bảng Môi trƣờng thạch máu 10 g 5g 4g 20 g 1000 ml 50ml (Máu 5%) Bảng3 Môi trƣờng Brain Heart Infusion ( BHI) Broth 200 g 250 g 10 g 5g 2,5 g 2g 1000 ml 56 Một số hình ảnh trình thực đề tài 57 ... tài: ? ?Nghiên cứu tạo dòng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus nhược độc phục vụ chế tạo vắcxin phòng bệnh hoại tử thận số loại cá biển. ” làm sở ban đầu hƣớng đến vi? ??c sản xuất vắc- xin bệnh hoạt tử. .. DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH -& - NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG VI KHUẨN Vibrio Parahaemolyticus NHƢỢC ĐỘC PHỤC VỤ CHẾ TẠO VẮC -XIN PHÒNG BỆNH HOẠI TỬ GAN THẬN TRÊN MỘT SỐ LOẠI CÁ BIỂN NI KHĨA... mắc số bệnh vi khuẩn virus gây Đáng lƣu ý bệnh hoại tử gan thận cá biển chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra, làm thiệt hại không nhỏ đến ngƣời nuôi cá biển Bệnh hoại tử gan thận xuất