Nghiên cứu tạo dòng vi khuẩn photobacterium damselae nhược độc bằng kháng sinh rifampicine phục vụ chế tạo vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng trên một số loại cá nuôi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH - - NGUYỄN THỊ HÀ PHƢƠNG NGHIÊN CỨU TAO DÒNG VI KHUẨN Photobacterium damselae NHƢỢC ĐỘC BẰNG KHÁNG SINH RIFAMPICINE PHỤC VỤ CHẾ TẠO VẮC-XIN PHỊNG BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG TRÊN MỘT SỐ LỒI CÁ NI KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KỸ SƢ NGÀNH NI TRỒNG THỦY SẢN Nghệ An - 05/2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH - - NGHIÊN CỨU TAO DÒNG VI KHUẨN Photobacterium damselae NHƢỢC ĐỘC BẰNG KHÁNG SINH RIFAMPICINE PHỤC VỤ CHẾ TẠO VẮC-XIN PHÒNG BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG TRÊN MỘT SỐ LỒI CÁ NI KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KỸ SƢ NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Người thực hiện: Nguyễn Thị Hà Phƣơng Lớp : 53K-NTTS MSSV : 1253036044 Người hướng dẫn: Th.S Lê Minh Hải PGS.TS Phạm Thị Tâm Nghệ An - 05/2016 i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực tập thực đề tài tốt nghiệp này, ngồi nỗ lực thân, tơi nhận giúp đỡ nhiệt tình từ thầy giáo khoa Nông Lâm Ngư, trường Đại Học Vinh, người tận tình dìu dắt tơi suốt thời gian ngồi ghế nhà trường Đặc biệt xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy giáo Lê Minh Hải, người hướng dẫn, bảo giúp đỡ tơi hồn thành tốt luận văn Xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, anh chị bạn khoa Công Nghệ Sinh Học, Viện Đại học Mở - Hà Nội, đặc biệt cô giáo Phạm Thị Tâm hỗ trợ tạo điều kiện trang thiết bị, sở vật chất để tơi hồn thành đề tài sở thực tập Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình người bạn động viên giúp đỡ suốt q trình học sống Kính chúc quý thầy cô, anh chị bạn sức khỏe thành công Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn ! ii MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan vi khuẩn Photobacterium damselae 1.1.1 Phân loại 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá 1.1.4 Đặc điểm gây bệnh vi khuẩn Photobacterium damselae 1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh vi khuẩn P.damselae gây giới Việt Nam 10 1.2.1 Tình hình nghiên cứu bệnh vi khuẩn P.damselae giới 10 1.2.2 Lịch sử phát bệnh Việt Nam 11 1.3 Tổng quan tạo chủng vi khuẩn nhược độc 11 1.3.1 Tình hình nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn nhược độc 11 1.3.1.1 Tình hình nghiên cứu giới 11 1.3.1.2 Tình hình nghiên cứu nước 13 1.3.2 Các phương pháp làm giảm độc vi khuẩn 14 1.3.3 Các tác nhân tạo chủng nhược độc 16 1.3.3.1 Tác nhân vật lý 16 1.3.3.2 Tác nhân hóa học 19 1.4 Đặc điểm hệ miễn dịch cá xương 22 1.4.1 Miễn dịch đặc hiệu 22 1.4.2 Miễn dịch tự nhiên 22 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 24 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 24 2.1.2 Môi trường, dung dịch thiết bị nuôi cấy 24 2.2 Nội dung nghiên cứu 26 2.3 Phương pháp nghiên cứu 27 2.3.1 Sơ đồ khối nghiên cứu 27 iii 2.3.2 Phương pháp vi sinh 28 2.3.3 Phương pháp tạo chủng nhược độc kỹ thuật gây đột biến kháng sinh Rifampicine .28 2.3.4 Phương pháp gây nhiễm động vật thí nghiệm 29 2.3.5 Phương pháp đánh giá khả tạo kháng thể bảo hộ cá 30 2.4 Phương pháp xử lý số liệu 30 2.5 Thời gian địa điểm nghiên cứu 30 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Kết tạo dòng vi khuẩn Photobacterium damselae nhược độc 31 3.2 Kết đánh giá mức độ giảm độc lực dịng đơt biến 33 3.2.1 Kết thử khả dung huyết 33 3.2.2 Kết gây nhiễm cá 35 3.3 Kết đánh giá khă tạo kháng thể bảo hộ cho cá 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1.A Hình thái vi khuẩn P.damselae Hình 1.1.B Hình thái khuẩn lạc mơi trường TCBS Hình 1.2 Tác động tia tử ngoại tạo dimer thymine 17 Hình 1.3: Tác động tia UV làm cho DNA có chỗ phình cấu trúc 18 Hình 1.4: Cấu trúc RNA polymerase (RNAP) 20 Hình 1.5 Vùng kháng Rif tiểu đơn vị β RNAP [13] 21 Hình 1.6 Đột biến kháng Rif vùng I gen rpoB 21 Hình 2.1 Sơ đồ khối nghiên cứu 27 Hình 3.1 Số khuẩn lạc chịu môi trường TCBS+kháng sinh 33 Hình 3.2 khă dung huyết chủng T4.3 Dịng 35 Hình 3.3 Cá trước sau gây nhiễm chủng đột biến T4.3 37 v DANH MỤC HÌNH Bảng 2.1 Mơi trường thạch máu 24 Bảng 2.2 Môi trường TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Salts) 25 Bảng 2.3 Môi trường Brain Heart Infusion (BHI) Broth 25 Bảng 2.4 Các thiết bị dùng nghiên cứu 26 Bảng 3.1 Số khuẩn lạc sống sót sau xử lý kháng sinh Rifampicine 32 Bảng 3.2 Kết phản ứng thử khả dung huyết 34 Bảng 3.3 Kết gây nhiễm cá 36 Bảng 3.4 Kết đánh giá khả sinh kháng thể bảo hộ cho cá 38 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BHI Broth : Brain Heart Infusion Broth CFU : Colony Forming Unit Ctv : Cộng tác viên D : Đường kính DLY : Damselysin EDTA : Ethyllene diamine tetra acetic acid KIA : Kligler Iron Agar OD : Optical density UV : Ultrviolet light TCBS : Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose LB : Lubria – Bertani h : MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Theo thống kê Tổng cục Thủy sản (Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn), tổng sản lượng thủy sản nuôi trồng năm 2015 với 6,56 triệu tấn; đó, khai thác 3,03 triệu tấn, ni trồng 3,53 triệu tấn; diện tích ni trồng 1,28 triệu ha; kim ngạch xuất khoảng 6,72 tỷ USD Tổng cục Thủy sản cho biết, giai đoạn 2015-2020 ngành thủy sản hướng tới phát triển bền vững ngành xuất hàng hóa lớn, có khả cạnh tranh cao hội nhập vững giới Các loại cá như: Cá Mú (Epinephelus spp), cá Giò (Rachycentron canadum), cá Chẽm (Lates calcarifer), cá Hồng (Lutjanus spp)…có giá trị kinh tế cao hàm lượng dinh dưỡng giàu axit béo không no nên thị trường nước ưa chuộng Tuy nhiên, nghề ni cá biển phát triển người ni gặp khơng khó khăn có dịch bệnh xảy cá Một số nghiên cứu tác nhân gây bệnh chủ yếu cá biển nuôi lồng thường virus, nấm vi khuẩn, nguy hiểm bệnh tụ huyết trùng vi khuẩn Photobacterium damselae gây Vi khuẩn cơng gây bệnh cá biển nuôi tất giai đoạn phát triển cá từ giai đoạn ấu trùng, cá giống đến cá ni thương phẩm Khi bị bệnh, cá có biểu dạng mãn tính cấp tính Biểu bệnh tụ huyết trùng bao gồm: gây loét da, xuất nốt kem trắng u hạt màu trắng số quan nội tạng, gây hoại tử nội tạng, hoại tử tập trung thận lách, gây nhiễm trùng hoại tử rộng rãi (Evelyn năm 1996; Romalde 2002; Barnes cộng sự, 2005) Dấu hiệu lâm sàng bệnh bao gồm: cá ăn, da tối màu, mang hoại tử Cá bệnh chết sau - 10 ngày với tỷ lệ chết cao từ 80 - 100% gây thiệt hại kinh tế lớn số nước như: Nhật, Mỹ, Pháp, Tây Ban Nha, Hy Lạp, Thổ Nhỹ Kỳ,…Ở Việt Nam, bệnh phân bố hầu hết vùng nuôi nước Thực tế nuôi trồng thủy sản, để khống chế vi khuẩn người dân thường sử dụng nhiều loại hóa chất kháng sinh, nhiên việc sử dụng kháng sinh nhiều dẫn đến tượng nhờn thuốc không mang lại hiệu cao Với khả tạo màng bảo vệ chống lại loại thuốc kháng sinh Chính thế, dịch bệnh thường bùng phát trở lại nhanh sau thuốc hết tác dụng Mặt khác, dư lượng kháng sinh sản phẩm từ cá biển gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng thịt cá sức khỏe người Hiện phương pháp phòng bệnh hiệu sử dụng vắc-xin Việc nghiên cứu loại vắc-xin phòng bệnh cần thiết Một bước quan trọng để nghiên cứu vắc-xin phải tạo chủng vi khuẩn nhược độc, làm sở ban đầu hướng đến việc sản xuất vắc-xin bệnh tụ huyết trùng cá nuôi Xuất phát từ lý luận thực tiễn trên, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tạo dòng vi khuẩn Photobacterium damselae nhược độc kháng sinh Rifampicine phục vụ chế tạo vắc-xin phòng bệnh tụ huyết trùng số loại cá nuôi” làm sở ban đầu hướng đến việc sản xuất vắc-xin bệnh tụ huyết trùng cá nuôi Mục tiêu đề tài 2.1 Mục tiêu chung Tạo chủng vi khuẩn Photobacterium damselae nhược độc có khả tạo kháng thể bảo hộ cá góp phần làm nguyên liệu sản xuất vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng cá ni 2.2.2 Mục tiêu cụ thể  Tạo dịng vi khuẩn Photobacterium damselae nhược độc kỹ thuật đột biến sử dụng kháng sinh rifampicine  Đánh giá đặc tính chủng đột biến: - Đánh giá lại khả dung huyết - Đánh giá lại mức độ gây bệnh qua lây nhiễm cá  Đánh giá khả tạo kháng thể bảo hộ cho cá sử dụng vi khuẩn nhược độc 31 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết tạo dòng vi khuẩn Photobacterium damselae nhƣợc độc Sau tăng sinh sơ bộ, tiến hành pha loãng nồng độ 10-5 cấy trang môi trường Marine agar 28oC sau 32 thu dạng khuẩn lạc có hình dạng màu sắc khác Theo Ortigosa et al (1994), vi khuẩn P.damselae cấy môi trường Marine agar mọc lên khuẩn lạc màu trắng sữa, đục nâu vàng, trịn, trơn, bóng Vì vậy, chúng tơi lựa chọn khuẩn lạc có đặc điểm với kích thước khác để tiến hành làm tiêu nhuộm gram xem hình thái vi khuẩn Quan sát kính hiển vi quang học nhận được: Vi khuẩn trực khuẩn, đứng riêng lẻ, bắt màu hồng, gram (-), vi khuẩn bắt màu sẫm hai đầu nhạt hay gọi nhuộm lưỡng cực Từ chủng Photobacterium damselae tự nhiên T4.3 phân lập từ gan ruột cá mú, cá giò, cá chẽm, cá hồng mắc bệnh tụ huyết trùng thu số khu vực nuôi cá lồng vùng biển quanh đảo Cát Bà - Hải Phòng; vùng biển Đồng Châu - Thái Bình; vùng biển Hải Thịnh- Nam Định Tơi tiến hành sử dụng tác nhân kháng sinh Rifampicine để tạo chủng nhược độc Yếu tố lựa chọn để tạo chủng vi khuẩn nhược độc Rifampicine hoạt động theo chế ức chế nhân lên vi khuẩn thông qua ức chế tổng hợp mRNA, dòng vi khuẩn chống chịu Rifampicine chủng bị đột biến, bị thay đổi chế gen độc tố bị đột biến Từ chủng tự nhiên T4.3, tiến hành tăng sinh môi trường BHI ngày, cấy lên mơi trường TCBS có bổ sung kháng sinh Rifampicine nồng độ 0,3µg/ml Ni lắc 28°C, tốc độ lắc 150 vòng/phút, ngày xác định khuẩn lạc mọc được, sau lấy ngẫu nhiên khuẩn lạc tăng sinh môi trường BHI lần Nuôi lắc 28°C, tốc độ lắc 150 vòng/phút, Tiến hành pha loãng dịch tăng sinh nước muối sinh lý Sau liên tục gây áp lực lần với vi khuẩn môi trường TCBS bổ sung Rifampicine có nồng độ 0,3µg/ml 0,5µg/ml 0,7µg/ml 0,9µg/ml 1,1µg/ml 1,3µg/ml 1,5µg/ml 1,7µg/ml, tơi thu kết Bảng 3.1, Hình 3.1 32 Bảng 3.1 Số khuẩn lạc sống sót sau xử lý kháng sinh Rifampicine Nồng độ kháng sinh Số khuẩn lạc sống sót (µg/ml) (CFU/đĩa) T4.3 ( chủng gốc) 250 0,3 115 0,5 154 0,7 98 0,9 56 1,1 14 1,3 1,5 1,7 Qua đời sử dụng kháng sinh với nồng độ khác chúng tơi nhận Dịng vi khuẩn thấy: số khuẩn lạc vi khuẩn sống sót tỷ lệ nghịch với nồng độ kháng sinh bổ sung vào môi trường TCBS Riêng đời 1, mật độ vi khuẩn sống sót giảm đột ngột, ½ so với đĩa đối chứng không sử dụng kháng sinh Từ đời thứ số khuẩn lạc CFU/đĩa bắt đầu giảm mạnh Giảm từ đời với 56CFU/đĩa xuống 14CFU/đĩa đời thứ đến đời khơng cịn khuẩn lạc mọc 1,3µg/m lml 1,5µg/ml 33 0,3µg/ml ml 0,5µg/ml ml Hình 3.1 Số khuẩn lạc chịu đƣợc môi trƣờng TCBS+kháng sinh Như vậy, từ vi khuẩn P.damselae tự nhiên T4.3 ( chủng gốc) tơi tìm dịng vi khuẩn đột biến sau sử dụng tác nhân kháng sinh Rifampicine dòng 1, dòng 2, dòng 3, dòng 4, dòng 5, dòng 6, dòng Lưu giữ giống tiếp tục tiến hành đánh giá mức độ giảm độc lực dịng tìm 3.2 Kết đánh giá mức độ giảm độc lực dịng đơt biến Từ dịng vi khuẩn tìm sau xử lý kháng sinh Rifampicine tiếp tục đánh giá mức độ giảm độc lực môi trường thạch máu cá 3.2.1 Kết thử khả dung huyết Độc tố dung huyết (haemolysis) yếu tố gây bệnh chủ yếu vi khuẩn P.damselae vật chủ Độc tố haemolysis bám lên màng tế bào hồng cầu, gây thủng màng giải phóng haemoglobin Kết tạo tượng dung huyết hoàn toàn (β-haemolysis) Đánh giá khả gây dung huyết chủng đột biến nhằm mục đích xem xét mức độ giảm độc lực độc tố Kết khả gây dung huyết dòng vi khuẩn P.damselae tạo tác nhân kháng sinh Rifampicine thu Bảng 3.2, Hình 3.2 34 Bảng 3.2 Kết phản ứng thử khả dung huyết Chủng Nguồn gốc Chủng tự nhiên T4.3 Phân lập từ gan ruột cá bệnh Khả dung huyết β Dòng Chịu nồng độ kháng sinh γ 0,3µg/ml) Dịng Chịu nồng độ kháng sinh β 0,5µg/ml) Dịng Chịu nồng độ kháng sinh γ 0,7µg/ml) Dịng Chịu nồng độ kháng sinh β 0,9µg/ml) Dịng Chịu nồng độ kháng sinh β 1,1µg/ml) Dịng Chịu nồng độ kháng sinh γ 1,3µg/ml) Dịng Chịu nồng độ kháng sinh γ 1,5µg/ml) Sau tiến hành thử phản ứng mơi trường thạch máu chúng tơi nhận thấy, có dịng có biểu giảm độc lực khơng có tượng dung huyết thạch máu cừu là: dịng (nồng độ kháng sinh 0,3µg/ml), dịng (nồng độ kháng sinh 0,7µg/ml), dịng (nồng độ kháng sinh 1,3µg/ml), dịng (nồng độ kháng sinh 1,5µg/ml) Có dịng khơng có biểu giảm độc lực : dịng (nồng độ kháng sinh 0,5µg/ml), dịng (nồng độ kháng sinh 0,9µg/ml), dịng (nồng độ kháng sinh 1,1µg/ml) 35 T 4.3 Xuất dung huyết vịng dung huyết rõ Dịng Khơng xuất dung huyết Hình 3.2 khă dung huyết chủng T4.3 Dòng 3.2.2 Kết gây nhiễm cá Trên đối tượng động vật mẫn cảm, sử dụng cá Rơ phi có kích thước 5cm để gây nhiễm dòng vi khuẩn gây đột biến, dịng tự nhiên T4.3 lơ với nước cất Liều tiêm cho cá 0,5ml canh khuẩn chứa 105CFU/ml Cá thí nghiệm ni điều kiện cho giống tự nhiên, thời gian theo dõi 15 ngày Kết tiến hành gây nhiễm thực nghiệm dòng đột biến dòng tự nhiên ban đầu T4.3, lo tiêm với nước cất cho cá Rơ phi phịng thí nghiệm Sau tiêm dòng: dòng (nồng độ kháng sinh 0,3µg/ml), dịng (nồng độ kháng sinh 0,7µg/ml), dịng (nồng độ kháng sinh 1,3µg/ml), dịng (nồng độ kháng sinh 1,5µg/ml), chủng T4.3 tự nhiên đối chứng lô tiêm nước cất để theo dõi 15 ngày Kết gây nhiễm thể Bảng 3.3 Hình 3.3 36 Bảng 3.3 Kết gây nhiễm cá STT lô tiêm Liều gây nhiểm (CFU/ ml) Số cá Tỷ Số cá thí lệ sống nghiệ chết sót m (%) Thời gian chết Vi khuẩn P.damselae T4.3 đối 105 30 100 12 đến 96 h chứng Biểu - Lở loét tồn than - Nội tạng hoại tử có u hạt màu trắng xuất - Toàn thân bên bình thường Vi khuẩn Dịng 10 30 27 10 24 đến 264 h - Không xuất hoại tử gan thận - Cá chết sau 24 giờ, bị stress tiêm Vi khuẩn Dòng Vi khuẩn Dòng Da tối màu, xuất huyết da, 10 30 26 13,3 36 lở loét vị trí tiêm, nội tạng hoại tử - Lở loét toàn than 10 30 100 24h - Nội tạng hoại tử có u hạt màu trắng xuất - Khơng có tượng lở lt Vi khuẩn Dịng - Khơng xuất điểm hoại 10 30 26 13,3 24 h tử gan thận - Cá chết sau 24 giờ, bị stress tiêm - Khơng có tượng lở loét - Không xuất điểm hoại Nước cất 30 28 3,4 24 h tử gan thận - Cá chết sau 24 giờ, bị stress tiêm - Khơng có tượng lở loét Không tiêm 30 30 - - Không xuất điểm hoại tử gan thận 37 Như vậy, từ kết thu thí nghiệm gây đột biến đánh giá mức độ giảm độc lực, xác định dịng vi khuẩn nhược độc, dòng: dòng 1, dòng 3, dòng Cá khỏe mạnh (khơng tiêm) Cá có dấu hiệu bệnh lý tiêm chủng gốc T4.3 (xuất máu tụ gan thận) Trước tiêm Sau tiêm Hình 3.3 Cá trƣớc sau gây nhiễm chủng đột biến T4.3 3.3 Kết đánh giá khă tạo kháng thể bảo hộ cho cá Một chủng vi khuẩn nhược độc đạt tiêu chuẩn sản xuất vắc-xin đạt hai tiêu chí: an tồn động vật mẫn cảm có khả sinh kháng thể bảo hộ Cá Rô phi sử dụng cho nghiên cứu có kích thước 5cm, mạnh khỏe, kiểm tra không nhiễm bệnh tụ huyết trùng phản ứng PCR Liều gây miễn dịch cho cá 105 CFU/ml, sau gây miễn dịch sở, cá thử thách chủng tự nhiên T4.3 với liều công cường độc 107CFU/ml 38 Từ kết xác định dòng vi khuẩn nhược độc, tiếp tục đánh giá khả tạo kháng thể bảo hộ dòng vi khuẩn nhược độc tác nhân kháng sinh bao gồm: dòng 1,dòng 3,dòng Kết thể Bảng 3.4 Bảng 3.4 Kết đánh giá khả sinh kháng thể bảo hộcho cá Gây nhiễm Dòng Số cá Số cá ban sống đầu sót Trạng thái bệnh tích Trạng thái Trạng thái bơi lấy thức ăn Không xuất huyết da Nhanh Dịng 30 21 -Khơng xuất điểm nhẹn, Bắt mồi phản xạ chậm tốt Bệnh tích cá hoại tử gan thận - Cá chết sau 24 giờ, bị stress tiêm - Khơng xuất huyết da Bơi lội Dịng 30 19 nhanh nhẹn -Không xuất điểm Bình thường hoại tử gan thận - Cá chết sau 24 giờ, bị stress tiêm - Khơng xuất huyết da Bơi lội Dịng 30 23 nhanh nhẹn - Khơng xuất điểm Bình thường hoại tử gan thận - Cá chết sau 24 giờ, bị stress tiêm 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ chủng Photobacterium damselae tự nhiên T4.3 với tác nhân kháng sinh Rifampicine chúng tơi tìm dịng nhược độc Từ dịng nhược độc tìm chúng tơi tiến hành thử phản ứng dung huyết cá tìm mức độ giảm độc lực dịng Chúng tơi kiểm tra dịng đột biến: dòng 1(kháng sinh 0,3 g/ml),dòng 3(kháng sinh 0,7 g/ml), dòng 6(kháng sinh 1,3 g/ml), dòng 7(kháng sinh 1,5 g/ml) dòng giảm độc lực Các dòng vi khuẩn nhược độc tiếp tục đánh giá khả sinh kháng thể bảo hộ cá thu dịng đột biến có khả sinh kháng thể bảo hộ với mức độ giảm dần: dòng với 76,7%, dòng 1với 70%, dòng với 63,3% Kiến nghị Nên sử dụng dòng 1, dòng 3, dòng làm nguyên liệu để chế tạo vắc-xin phòng bệnh tụ huyết trùng cho cá Do thời gian có hạn nên tơi hồn thành đề tài với nội dung Cần có nhiều thời gian nghiên cứu mức độ sinh phân tử để kiểm tra có mặt gen độc tố có dịng vi khuẩn nhược độc tạo ranhằm đánh giá cách xác chủng vi khuẩn nhược độc để phục vụ chế tạo vắc–xin phòng bệnh tụ huyết trùng cho cá biển Tiếp tục đánh giá dòng vi khuẩn đột biến lựa chọn dịng có vi khuẩn an toàn nhất, tạo đáp ứng miễn dịch bền vững để nghiên cứu chế tạo vắc-xin phòng bệnh tụ huyết trùng cho cá biển 40 MỘT SỐ HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO A.Tài liệu nƣớc Trần Thị Kim Anh (2008) “Bài giảng kỹ thuật nuôi cá biển hải đặc sản” Khoa Nông Lâm Ngư, trường Đại Học Vinh Bộ Thủy Sản (2006) Báo cáo đánh giá kết thực chương trình phát triển ni trồng thủy sản giai đoạn 2000-2005 biện pháp thực đến năm 2010 168 trang Phạm Công Hoạt (2005), “Bài giảng vấn đề vi sinh vật” Bộ khoa học công nghệ Phạm Công Hoạt, Phạm Thị Tâm, Lê Văn Nhương “Xác định số độc tố gây bệnh vi khuẩn Aeromonas hydrophila phân lập từ cá chép bị bệnh xuất huyết đốm đỏ khu vực Đồng Bắc Bộ” Tạp chí nơng nghiệp PTNT, số (163) năm 2011 Marketing nông nghiệp, ngành Thủy sản Tổng quan ngành thuỷ sản Việt Nam, 14/6/2013 Vũ Thị Thanh Hương, Bùi Thị Thanh Tịnh Nguyễn Quốc Bình (2011), Tạo chủng Edwardsilla ictaluri nhược độc cách chọn môi trường kháng sinh Rifampicin nhằm ngăn ngừa bệnh gan thận mủ cá tra, Kỷ yếu Hội nghịcơng nghệ sinh học tồn quốc, Khu vực phía Nam lần II, tiểu ban 5: Công nghệ sinh học Thủy sản, tr.108 Ngô Trọng Lư, Thái Bá Hổ, Nguyễn Kim Độ (2004), Kỹ thuật nuôi cá lồng biển, NXB NN TP HCM Trang tin thị trường xúc tiến thương mại, chuyên trang thủy sản, tin xuất nhập phát ngày 06/01/2015: Xuất thuỷ sản năm 2015 đối mặt nhiều thách thức Trang thông tin điện tử – tổng cục thủy sản, Tổng quan nuôi trồng thủy sản giới giai đoạn 2000-2012, 16/10/2014 10 Trần Phước Linh (2008),”Phương pháp phân tích vi sinh vật”, Nhà xuất giáo dục 42 11 Phạm Thị Bích Ngọc (2011), Tìm hiểu quy trình phát Vibriotrong thủy hải sản đơng lạnh, Khóa luận tốt nghiệp, Trường đại học kỹ thuật công nghệ TP HCM, tr15, 40-42 12 Bùi Quang Tề (1998), “Chẩn đốn phịng trị số bệnh truyền nhiễm cá nuôi lồng thuỷ đặc sản”, Các cơng trình nghiên cứu khoa học ngành thuỷ sản 1996-2000, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, trang 109-119 13 Khuất Hữu Thanh (2006), Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội, tr186-198 14 Lê Anh Tuấn (2004a), “Tình hình ni cá mú Việt Nam: trạng trở ngại mặt kỹ thuật”, Tạp chí Khoa học – Cơng nghệ Thủy sản, Số đặc biệt kỷ niệm 45 năm thành lập Trường, Trường ĐH Thủy sản, tr 174-179 15 Trung tâm Khuyến nông – Khuyến ngư Quốc gia (2003), Kỹ thuật nuôi trồng số đối tượng thủy sản biển, NXB Nông nghiệp B Tài liệu nƣớc 16 Agarinos, Romalde, A and Toranzo, A.E (1997a) Viability of starved Pasteurella piscicida in seawater monitored by fl o w cytometry and the effects of antibiotics on its resusci- tation Letters in Applied Microbiology 24 , 122–126 17 Alvarez JR, Lamba S., Dyer KY, Apuzzio JJ 2006 An unusual case of urinary tract infection in a pregnant woman with Photobacterium damsela Infect Dis Obstet Gynecol 80682 :1–3 18 Asato J., Kanaya F 2004 Fatal infection of the hand due to Photobacterium damsela: a case report Clin Infect Dis, 100–101 19 Austin, B., Austin, D.A., Blanch, A.R., Cerdà, M., Grimont, F., Grimont, P.A.D., Jofre, J., Koblavi, S., Larsen, J.L., Pedersen, K., Tiainen, T., Verdonck, L and Swings, J (1997) A comparison of methods for the typing of fish-pathogenic Vibrio spp Systematic and Applied Microbiology 20, 89–101 20 A Labella, C Berbel, M Manchado, D Castro and J J Borrego (2011) Photobacterium damselae subsp Damselae, an emerging pathogen affecting new culture marine fish species in Southern Spain Archives of virology 142, 2345-2364 43 21 Benjamin R.L., Scott E.L., Douglas R.C., Kenneth D.C (2008), Isolation of Rifampicin resistant Flavobacterium psychrophilum strains and their potential as live attenuated vaccine candidates,Vaccine 26: 5582 – 5589 22 Clarridge, J.L & Zighelboim-Daum, S (1985) Isolation and characterization of two hemolytic phenotypes of Vibrio damsela associated with a fatal wound infection Journal of Clinical Microbiology 21: 302-306 23 Cutter D L., Kreger A S 1990 Cloning and expression of the damselysin gene from Vibrio damsela.Infect Immun 58:266–268 24 Elizabeth A.C., NataliyaK., Arkady M., Katsuhiko M., Satish N., Alex G., Seth A.D (2001), Structural mechanism for Rifampicin inhibition of bacterial RNA polymerase,Cell 104: 901 – 912 25 Fouz B., Barja J L., Amaro C., Rivas C., Toranzo A E 1993 Toxicity of the extracellular products of Vibrio damsela isolated from diseased fish Curr Microbiol 27:341–347 26 Fouz, B., Biosca, E.G and Amaro, C (1997) High af fi nity iron-uptake systems in Vibrio damsela: role in the acquisition of iron from transferrin Journal of Applied Microbiology 82 , 157–167 27 Fouz, B., Toranzo, A.E., Millan, M & Amaro, C (2000) Evidence that water transmits the disease caused by the fish pathogen Photobacterium damselae subsp damselae Journal of Applied Microbiology 88: 531-535 28 Fraser, S.L., Purcell, B.K., Delgado, B., Jr., Baker, A.E & Whelen, A.C (1997) Rapidly fatal infection due to Photobacterium (Vibrio) damsela Clinical Infectious Diseases 25: 935- 936 29 FriesenJ.D Archambault J (1993), Genetics of eukaryotic RNA polymerases I, II, and III Microbiology and Molecular Biology Reviews: 57(3):p 703-724 30 Gauthier, G., Lafay, B., Ruimy, R., Breittmayer, V., Nicolas, J.L., Gauthier, M & Christen, R (1995) Small-subunit rRNA sequences and whole DNA relatedness concur for the reassignment of Pasteurella piscicida (Snieszko et al.) Janssen and Surgalla to the genus Photobacterium as Photobacterium damsela 44 subsp piscicida comb nov International Journal of Systematic Bacteriology 45: 139-144 31 Hawke, J P., Plakas, S M., Minton, R V., McPhearson, R M., Snider, T G & Guarino, A M (1987) Fish pasteurellosis of cultured striped bass (Morone saxatilis) in coastal Alabama Aquaculture: Volume 65, Issues 3–4, 15 September 1987, Pages 193–204 32 Kim H R., Kim J W., Lee M K., Kim J G 2009 Septicemia progressing to fatal hepatic dysfunction in a cirrhotic patient after oral ingestion of Photobacterium damsela: a case report Infection 37:555–556 33 KumarK.P., Chatterji D (1992), Differential inhibition of abortive transcription initiation at different promoters catalysed by E.coli RNA polymerase – effect of Rifampicin on purine or pyramidine–initiated phosphodiester synthesis, Federation of European biochemical societiesletter306 (1): 46 -50 34 Labella A., et al 2010 Toxicity of Photobacterium damselae subsp damselae strains isolated from new cultured marine fish Dis Aquat Org 92:31–40 35 Morris J G., Jr., et al 1982 Illness caused by Vibrio damsela and Vibrio hollisae Lancet i:1294–1297 36 Nicky B Buller (author), Department of Agriculture and Food, Western Australia Bacteria and Fungi from Fish and other Aquatic Animals: A Practical Identification Manual, 2nd Edition 37 Osorio C R., Romalde J L., Barja J L., Toranzo A E 2000 Presence of phospholipase D (dly) gene coding for damselysin production is not a pre-requisite for pathogenicity in Photobacterium damselae subsp damselae Microb Pathog 28:119–126 38 Pasqualina Laganas, Gabriella Caruso, Eleonora Minutoli, Renata Zaccone, Santi Delia Susceptibility to antibiotics of Vibrio spp and Photobacterium damsela ssp Piscicida strains isolated from Italian aquaculture farms The new microbiologica 34, 1/2011, 53-63 39 P.R Rajan , J.H.-Y Lin , M.-S Ho and H.-L Yang 1,2 Simple and rapid detection of Photobacterium damselae ssp piscicida by a PCR technique and 45 plating method Journal of Applied Microbiology 2003, 95, 1375–1380 With Institute of BioAgricultural Sciences, Academia Sinica, Nankang, Taipei, Taiwan and Institute of Biotechnology, National Cheng Kung University, Tainan, Taiwan 40 Rajan P.R1 , J.H.-Y Lin1 , M.-S Ho1 and H.-L Yang1,2 Simple and rapid detection of Photobacterium damselae ssp piscicida by a PCR technique and plating method Journal of Applied Microbiology 2003, 95, 1375–1380 With 1Institute of BioAgricultural Sciences, Academia Sinica, Nankang, Taipei, Taiwan and 2Institute of Biotechnology, National Cheng Kung University, Tainan, Taiwan 41 Robohm RA (1983) Pasteurella piscicida In: Anderson DP, Dorsonand M, Dubourget P (eds) Antigens of fish pathogens Collection Foundation Marcel Merieux, Lyon, France, pp 161–175 42 S.Botella, M.-J.Pujalte, M.-C.Maciasn, J Hernandez and E Garay (2002) Amplified fragment length polymorphism (AFLP) and biochemical typing of Photobacterium damselae subsp Damselae Journal of Applied Microbiology, Volume 93, Issue 4, 681–688 43 Thyssen, A., Van Eygen, S., Hauben, L., Goris, J., Swings, J and Ollevier, F The applica- tion of AFLP for taxonomic and epidemiological studies of Photobacterium damselae subsp piscicida International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 50 , 1013–1019 44 Yamane K., et al 2004 Two cases of fatal necrotizing fasciitis caused by Photobacterium damsela in Japan J Clin Microbiol 42:1370–1372 ... ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH - - NGHIÊN CỨU TAO DÒNG VI KHUẨN Photobacterium damselae NHƢỢC ĐỘC BẰNG KHÁNG SINH RIFAMPICINE PHỤC VỤ CHẾ TẠO VẮC -XIN PHÒNG BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG TRÊN MỘT SỐ... phục vụ chế tạo vắc- xin phòng bệnh tụ huyết trùng số loại cá nuôi? ?? làm sở ban đầu hướng đến vi? ??c sản xuất vắc- xin bệnh tụ huyết trùng cá nuôi Mục tiêu đề tài 2.1 Mục tiêu chung Tạo chủng vi khuẩn. .. nhược độc tạo ranhằm đánh giá cách xác chủng vi khuẩn nhược độc để phục vụ chế tạo vắc? ? ?xin phòng bệnh tụ huyết trùng cho cá biển Tiếp tục đánh giá dòng vi khuẩn đột biến lựa chọn dịng có vi khuẩn