Nghiên cứu phương pháp thử định hướng dấu vết máu bằng dung dịch phenolphthalein phục vụ công tác giám định sinh học pháp lý tại việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT -*** - ĐÀM THỊ HUỆ NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP THỬ ĐỊNH HƢỚNG DẤU VẾT MÁU BẰNG DUNG DỊCH PHENOLPHTHALEIN PHỤC VỤ CÔNG TÁC GIÁM ĐỊNH SINH HỌC PHÁP LÝ TẠI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Số h Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnuoá Nội – 2015 Trung tâm Học liệu Hà – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT -*** - LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Đề tài: NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP THỬ ĐỊNH HƢỚNG DẤU VẾT MÁU BẰNG DUNG DỊCH PHENOLPHTHALEIN PHỤC VỤ CÔNG TÁC GIÁM ĐỊNH SINH HỌC PHÁP LÝ TẠI VIỆT NAM Học viên: Đàm Thị Huệ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 Ngƣời hƣớng dẫn: PGS - TS Nguyễn Văn Hà Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Hà Nội – 2015 Số h Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnuoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn cao học Đàm Thị Huệ LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận văn tơi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới Đại tá, PGS-TS Nguyễn Văn Hà – Phó giám đốc – Phụ trách Trung tâm giám định Sinh học Pháp lý – Viện Khoa học hình - Bộ Cơng an tận tình hướng dẫn suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Viện Khoa học hình sự, Lãnh đạo Trung tâm đồng chí đồng nghiệp Trung tâm giám định Sinh học Pháp lý - Viện Khoa học hình tạo điều kiện thời gian sở vật chất để thực quy trình thí nghiệm đề tài luận văn Cảm ơn phịng kỹ thuật hình Cơng an tỉnh Vĩnh Phúc, Bắc Giang, Thanh Hóa, TP Hồ Chí Minh phân viện KHHS TP Hồ Chí Minh thử nghiệm đánh giá kít địa phương Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, thầy cô giáo thuộc Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật tận tình truyền đạt kiến thức, giúp đỡ tơi q trình học tập Cuối tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến gia đình, bạn bè động viên, góp ý, giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi q trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Học viên Đàm Thị Huệ Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn cao học Đàm Thị Huệ MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu Đối tượng, phạm vi nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Cấu trúc đề tài Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái niệm máu dấu vết máu 1.1.1 Khái niệm máu 1.1.2 Dấu vết máu 1.1.3 Ý nghĩa giám định dấu vết máu 1.1.4 Phương pháp phát hiện, ghi nhận dấu vết máu trường 10 1.2 Cơ sở khoa học, nguyên lý chung phương pháp giám định định hướng dấu vết máu 11 1.3 Các phương pháp giám định định hướng dấu vết máu giới 14 Dưới cấu tạo hóa học số chất 14 1.3.1 Kít thử định hướng dấu vết máu phenolphthalein 15 1.3.2 Benzidine 16 1.3.3 Que thử Hemastix 17 1.3.4 Kit thử định hướng dấu vết máu O – Tolidine 17 1.3.5 Kít thử định hướng dấu vết máu TMB – dẫn suất benzidine 18 1.3.6 Kít thử định hướng dấu vết máu LMG 19 1.3.7 Kít thử định hướng dấu vết máu quang hóa huỳnh quang 19 1.3.8 Luminol 20 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn cao học Đàm Thị Huệ 1.4 Phương pháp giám định định hướng dấu vết máu sử dụng Việt Nam 21 1.4.1 Phương pháp Benzidine 21 1.4.2 Bộ test thử định hướng dấu vết máu “hemo test” Viện kỹ thuật hóa sinh tài liệu nghiệp vụ - Bộ Công an 22 1.4.3 Cách tiếp cận phương pháp thử định hướng dấu vết máu 22 Chƣơng NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Hóa chất, thiết bị dụng cụ 25 2.1.1 Hóa chất 25 2.1.2 Thiết bị 25 2.1.3 Dụng cụ 25 2.2 Phương pháp nghiên cứu 26 2.2.1 Phương pháp pha lỗng máu người tồn phần 26 2.2.2 Các phương pháp tiến hành 27 2.3 Các phương pháp nghiên cứu bổ trợ 29 2.3.1 Phương pháp xác định máu loài theo Ochternoly 29 2.3.2 Phương pháp tách DNA Chelex® 30 2.3.3 Phương pháp định lượng DNA kit QuantifilerTM Human DNA Quantification 31 2.3.4 Sử dụng kỹ thuật PCR kít AmpFlSTR Identifier PCR Amplification Kit để nhân bội ADN từ dấu vết máu thử phenolphthalein 33 2.3.5 Phương pháp điện di huỳnh quang 34 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1.Kết nghiên cứu 36 3.1.1 Kết xác định hóa chất chuyển đổi phenolphthalein từ dạng oxi hóa sang dạng khử 36 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn cao học Đàm Thị Huệ 3.1.2 Kết xác định nồng độ hóa chất tối ưu cho dung dịch thuốc thử 40 3.1.3 Kết xác định độ nhạy dung dịch thuốc thử phenolphthalein 40 3.1.4 Kết xác định dương tính giả thuốc thử chất máu 42 3.1.5 Nghiên cứu điều kiện khả bảo quản kit 43 3.1.6 Thử nghiệm với máu bị phân hủy điều kiện môi trường 45 3.2 So sánh độ nhạy thuốc thử phương pháp phân tích dấu vết máu có 47 3.2.1 Với kháng huyết kháng protein người 47 3.2.2 Với kít định lượng ADN người (Human Quantifiler) Applybiosystems (Mỹ) sản xuất 48 3.7.3 Với kít truy nguyên cá thể người Identifiler Applybiosystems (Mỹ) sản xuất 48 3.3 So sánh độ nhạy thuốc thử phenolphthalein với phương pháp thử định hướng khác 50 3.3.1 So sánh với phương pháp benzidine truyền thống 50 3.3.2 So sánh với kít phenolphthalein hãng Medtech (Đức) 51 3.3.3 So sánh với kít Hemastix hãng Roche 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn cao học Đàm Thị Huệ DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ADN (DNA): Axit deoxyribonucleic PCR: Polymerase Chain Reaction (phản ứng nhân bội gen) STRs: short tandem repeat: trình tự AND lặp lại ngắn TMB: Tetramethylbenzidine LMG: Leucomalachite green KTHS: kỹ thuật hình KHHS: Khoa học hình Hb: Hemoglobin C54: Viện Khoa học hình - Bộ Cơng an PC54: Phịng kỹ thuật hình - Cơng an tỉnh, thành phố Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn cao học Đàm Thị Huệ DANH MỤC BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ VÀ HÌNH Bảng biểu Bảng 2.1 Độ pha loãng máu mật độ hồng cầu trung bình 26 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR sử dụng kít Identifiler 33 Bảng 2.3 Chu trình nhiệt sử dụng cho phản ứng nhân gen 33 Bảng 2.4 Thành phần hỗn hợp điện di máy AB 3130 35 Bảng 3.1 Kết chuyển màu phenolphthalein môi trường kiềm mạnh không tác động nhiệt 37 Bảng 3.2 Đánh giá độ đậm màu dung dịch phenolphthalein dung dịch kiềm 37 Bảng 3.3 Kết chuyển màu phenolphthalein môi trường kiềm mạnh tác động nhiệt (đun sôi máy khuấy từ gia nhiệt) 38 Bảng 3.4 Độ ổn định màu dung dịch thuốc thử theo thời gian 39 Bảng 3.5 Thử nghiệm thuốc thử với độ pha loãng máu khác 41 Bảng 3.6 Kết thử nghiệm dương tính giả với chất tẩy rửa 42 Bảng 3.7 Kết thử nghiệm dương tính giả với nhựa thực vật 42 Bảng 3.8 Kết thực nghiệm dương tính giả với chất hóa tổng hợp 42 Bảng 3.9 Kết thử nghiệm với máu động vật 43 Bảng 3.10 Kết xác định độ bền thuốc thử theo thời gian bảo quản 44 Bảng 3.11 Kết thử nghiệm với máu bị phân hủy 46 Bảng 3.12 Xác định hàm lượng ADN người nồng độ 48 pha loãng máu khác 48 Bảng 3.13 Bảng tổng hợp kết so sánh độ nhạy thuốc thử phenolphthalein phương pháp phân tích dấu vết máu có 49 Bảng 3.14 Kết tổng hợp so sánh độ nhạy phản ứng 53 kít thử định hướng thương mại 53 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn cao học Đàm Thị Huệ Sơ đồ Sơ đồ 1.1 Nguyên lý phương pháp định hướng dấu vết máu 12 Sơ đồ 1.2 Cơ chế phản ứng thử định hướng dấu máu sử dụng phenolphthalein 15 Sơ đồ 1.3 Cơ chế phản ứng thử định hướng vết máu sử dụng Benzidine 17 Sơ đồ 1.4 Cơ chế phản ứng thử định hướng vết máu sử dụng LMG 19 Sơ đồ 1.5 Cơ chế phản ứng thử định hướng vết máu sử dụng Luminol 20 Sơ đồ 2.1 Sơ đồ pha loãng máu từ máu tồn phần 26 Hình Hình Kết thử với dung dịch máu pha loãng để 47 điều kiện sau tháng 47 Hình Kết xác định độ nhạy máu pha loãng với kháng huyết kháng protein người 48 Hình So sánh trực tiếp thuốc thử định hướng phenolphthalein dung dịch benzidine truyền thống 50 Hình So sánh với kít phenolphthalein hãng Medtech (Đức) 51 Hình So sánh với kít Hemastix hãng Roche 51 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn cao học Đàm Thị Huệ MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Trong vụ án hình sự, đặc biệt vụ án xâm phạm tính mạng, sức khỏe nhân phẩm người, máu loại dấu vết thường gặp máu hệ điển hình tác động qua lại chế hình thành dấu vết hoạt động phạm tội hình Dấu vết máu dạng dấu vết vật chất có vai trị nguồn cung cấp thơng tin có giá trị cơng tác điều tra, xét xử vụ án Dấu vết máu tìm thấy trường trở thành chứng trực tiếp để giải vụ án hình Trong giám định sinh học pháp lí, bước giám định định hướng loại dấu vết nói chung dấu vết máu nói riêng vơ quan trọng khơng phương pháp xác định vị trí dấu vết vật mang góp phần làm rõ chế hình thành dấu vết mà nhằm loại trừ nhanh dấu vết trường, giảm số lượng dấu vết cần phải gửi tới quan giám định Từ trước đến nay, phương pháp giám định định hướng dấu vết máu Viện Khoa học hình sử dụng dung dịch Benzidine bão hòa axit axetic (CH3COOH) Benzidine chất độc hại, nhân tố gây ung thư khó phân hủy mơi trường tự nhiên Các phòng giám định sinh học giới từ lâu cấm sử dụng Benzidine thay dẫn xuất Benzidine chất khác độc hại để bảo vệ sức khỏe người giám định viên bảo vệ môi trường Mặt khác công tác giám định định hướng dấu vết máu triển khai Việt Nam kít thử định hướng dấu vết máu hãng sản xuất đòi hỏi kinh phí cao phải nhập Vì mục đích đề tài đặt phải tìm phương pháp giám định định hướng có độ nhạy tương đương với phương pháp sử dụng dung dịch Benzidine mà hóa chất sử dụng dễ tìm kiếm, chi phí thấp, khơng bay mơi trường thí nghiệm, tiện sử dụng Đặc biệt, công tác giám K17-Viện sinh thái tài nguyên sinh vật Luận văn cao học Đàm Thị Huệ Ghi chú: TT: tình trạng dung dịch kiểm tra ; DT: Khả dương tính TS: dung dịch tồn dạng suốt V: dung dịch ngả sang màu vàng nhạt VV: dung dịch ngả vàng (+): dung dịch cho kết dương tính rõ ràng với vết máu có độ pha lỗng 10.000 lần (+-): dung dịch cho kết dương tính khơng rõ ràng với vết máu có độ pha lỗng 10.000 lần (-+): dung dịch cho kết dương tính yếu với vết máu có độ pha loãng 10.000 lần ĐK 1: Trong điều kiện bảo quản: 40C không bị tác dụng ánh sáng ĐK 2: Trong điều kiện bảo quản: 40C tác dụng ánh sáng thường ĐK 3: Trong điều kiện ngồi mơi trường thơng thường (phịng thí nghiệm từ tháng 02 đến tháng năm 2015) ĐK 4: Trong điều kiện ngồi mơi trường thơng thường (phịng thí nghiệm từ tháng 02 đến tháng năm 2015) để hộp kín, khơng bị tác dụng ánh sáng Kết quả: Thuốc thử bảo quản tốt 40C không bị tác dụng ánh sáng 3.1.6 Thử nghiệm với máu bị phân hủy điều kiện môi trƣờng Thuốc thử sau pha tiến hành thử trực tiếp với mẫu máu pha loãng để ống eppenderf thời gian tháng, tháng tháng sau thấm que tăm bơng Số đợt thí nghiệm 02 lần độc lập Số mẫu thực cho lần 25 mẫu tăm Tổng số mẫu thực N=50 mẫu K17-Viện sinh thái tài nguyên sinh vật 45 Luận văn cao học Đàm Thị Huệ Mẫu âm tính (Negative): dung dịch NaCl 0,9% Mẫu dương tính (Positive): dung dịch máu người toàn phần Kết thực nghiệm: Kết thực nghiệm thuốc thử với máu bị phân hủy theo thời gian nêu bảng sau: Bảng 3.11 Kết thử nghiệm với máu bị phân hủy Kí hiệu Độ pha lỗng Kết (%) dương tính với máu sau tháng điều kiện thường Kết (%) dương tính với máu sau tháng điều kiện thường Kết (%) dương tính với máu sau tháng điều kiện thường 1/2 50/50 (100%) 50/50 (100%) 50/50 (100%) 1/4 50/50 (100%) 50/50 (100%) 50/50 (100%) 1/8 50/50 (100%) 50/50 (100%) 50/50 (100%) 1/16 50/50 (100%) 50/50 (100%) 50/50 (100%) 1/32 50/50 (100%) 50/50 (100%) 50/50 (100%) 1/64 50/50 (100%) 50/50 (100%) 50/50 (100%) 1/128 50/50 (100%) 50/50 (100%) 50/50 (100%) 1/256 50/50 (100%) 50/50 (100%) 50/50 (100%) 1/512 50/50 (100%) 50/50 (100%) 50/50 (100%) 10 1/1024 50/50 (100%) 50/50 (100%) 50/50 (100%) 11 1/2048 50/50 (100%) 50/50 (100%) 50/50 (100%) 12 1/4096 50/50 (100%) 50/50 (100%) 50/50 (100%) 13 1/8192 50/50 (100%) 50/50 (100%) 50/50 (100%) 14 1/16384 50/50 (100%) 47/50 (94%) 45/50 (90%) 15 1/32768 45/50 (90%) 37/50 (74%) 34/50 (68%) 16 1/65536 42/50 (84%) 26/50 (52%) 21/50 (42%) 17 1/131072 25/50 (50%) 13/50 (84%) 10/50 (20%) 18 1/262144 7/50 (14%) 2/50 (4%) 2/50 (4%) 19 1/524288 0/50 (0%) 0/50 (0%) 0/50 (0%) 20 1/1048576 0/50 (0%) 0/50 (0%) 0/50 (0%) Negative 0/50 (0%) 0/50 (0%) 0/50 (0%) Positive 50/50 (100%) 50/50 (100%) 50/50 (100%) K17-Viện sinh thái tài nguyên sinh vật 46 Luận văn cao học Đàm Thị Huệ Kết thử với dung dịch máu pha loãng để điều kiện sau tháng thể hình đại diện sau: Hình Kết thử với dung dịch máu pha loãng để điều kiện sau tháng Kết luận: dựa vào thử nghiệm tiến hành, thấy, khả phát dấu vết máu thuốc thử bị giảm bậc từ khả phát với máu có độ pha lỗng 1/131.072 xuống 1/65.536 với máu dung dịch sau tháng khả phát tiếp tục giảm với máu sau tháng thuốc thử có khả phát với máu có độ pha loãng 1/32.768 lần 3.2 So sánh độ nhạy thuốc thử phƣơng pháp phân tích dấu vết máu có 3.2.1 Với kháng huyết kháng protein người Chúng sử dụng phương pháp khuếch tán miễn dịch kép (theo Ouchternoly) xác định độ nhạy với máu pha loãng dùng đề tài với kháng protein huyết Viện Khoa học hình cung cấp, kết thể hình sau: K17-Viện sinh thái tài nguyên sinh vật 47 Luận văn cao học Đàm Thị Huệ Hình Kết xác định độ nhạy máu pha loãng với kháng huyết kháng protein người Kết xác định xác protein loài theo phương pháp Ochternoly cho thấy: Nồng độ pha lỗng tối đa cho kết dương tính quan sát mắt thường nồng độ pha lỗng tối đa 1/8.192 3.2.2 Với kít định lượng ADN người (Human Quantifiler) Applybiosystems (Mỹ) sản xuất Sử dụng máu pha loãng dùng đề tài để xác định nồng độ ADN người với kít định lượng ADN người (Human Quantifiler) Kết thể bảng sau: Bảng 3.12 Xác định hàm lượng ADN người nồng độ pha loãng máu khác Độ pha loãng 1/2 Nồng độ ADN 11,1 5,6 1/4 1/8 2,7 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048 0,9 0,5 0,3 0,1 0,006 0,003 0,001 0,0001 3.7.3 Với kít truy nguyên cá thể người Identifiler Applybiosystems (Mỹ) sản xuất[14] Tương tự, xác định độ nhạy với máu pha lỗng dùng đề tài với kít truy nguyên cá thể người sử dụng phổ biến K17-Viện sinh thái tài nguyên sinh vật 48 Luận văn cao học Đàm Thị Huệ giới Việt Nam, kết cho thấy kít truy nguyên cá thể xác định kiểu gen với nồng độ pha loãng máu tối đa 1/2048 lần Bảng 3.13 Bảng tổng hợp kết so sánh độ nhạy thuốc thử phenolphthalein phương pháp phân tích dấu vết máu có Độ pha lỗng máu Dương tính với dung dịch phenolphthalein Dương tính kháng huyết người Nồng độ AND (ng/µl) Mức độ xác định kiểu gen 1/2 + + 11,1 Đầy đủ 1/4 + + 5,6 Đầy đủ 1/8 + + 2,7 Đầy đủ 1/16 + + 0,9 Đầy đủ 1/32 + + 0,5 Đầy đủ 1/64 + + 0,3 Đầy đủ 1/128 + + 0,1 Đầy đủ 1/256 + + 0,006 Đầy đủ 1/512 + + 0,003 Đầy đủ 1/1024 + + 0,001 Một số 1/2048 + + 0,0001 Một vài 1/4096 + + Không 1/8192 + + Không 1/16384 + - Không 1/32768 + - Không 1/65536 + - Không 1/131072 + - Không 1/262144 - - Không 1/524288 - - Không 1/1048576 - - Không 1/2097152 - - Không K17-Viện sinh thái tài nguyên sinh vật 49 Luận văn cao học Đàm Thị Huệ 3.3 So sánh độ nhạy thuốc thử phenolphthalein với phương pháp thử định hướng khác 3.3.1 So sánh với phương pháp benzidine truyền thống Chúng tiến hành so sánh độ nhạy thuốc thử với kít thử định hướng dấu vết máu benzidine kít thử định hướng hãng khác giới: [16] Hình So sánh trực tiếp thuốc thử định hướng phenolphthalein dung dịch benzidine truyền thống Ghi chú: Tăm bên phải: thuốc thử định hướng Benzidine cho kết màu xanh Tăm bên trái: thuốc thử định hướng phenophthalein cho kết màu hồng 15: độ pha loãng 32.768 16: độ pha loãng 65.536 17: độ pha loãng 131072 K17-Viện sinh thái tài nguyên sinh vật 50 Luận văn cao học Đàm Thị Huệ 3.3.2 So sánh với kít phenolphthalein hãng Medtech (Đức) Hình So sánh với kít phenolphthalein hãng Medtech (Đức) Với kít thử Phenolphthalein Presumptive Blood kit hang Medtech, phản ứng có kết dương tính với mức pha loãng máu tối đa 1/262.144 lần, thuốc thử phenolphthalein đề tài có độ nhạy tương đương 3.3.3 So sánh với kít Hemastix hãng Roche Hình So sánh với kít Hemastix hãng Roche Độ nhạy kít thử định hướng dấu vết máu Hemastix 1/2.097.152 cao so với kít thử định hướng đề tài (kít thử định hướng đề tài 1/262.144) K17-Viện sinh thái tài nguyên sinh vật 51 Luận văn cao học Đàm Thị Huệ THẢO LUẬN Dựa vào đặc tính Phenolphthalein từ kết nghiên cứu đưa quy trình pha chế sử dụng thuốc thử phenolphthalein cho giám định định hướng dấu vết máu sau: Quy trình pha chế - Dung dịch gốc: Pha dung dịch KOH 25% Cân 25g KOH, bổ sung dI H2O đến 100ml Bổ sung 10g bột kẽm (Zn) vào dung dịch Bổ sung 2g phenolphthalein Đun sôi hỗn hợp thời gian 120 phút (dung dịch chuyển hết sang trạng thái không màu, suốt) Lọc hỗn hợp giấy lọc Bổ sung 0.25g bột kẽm Bảo quản dung dịch lọ thủy tinh tối màu điều kiện 4oC - Dung dịch hoạt động Pha dung dịch gốc với ethanol 95% tỉ lệ 1:1 Bảo quản nhiệt độ 40C điều kiện tối Cơ chất cho trình phản ứng H2O2 3% Với máu dấu vết trạng thái khô, dùng dung dịch Ethanol 95% để làm ướt dấu vết Quy trình sử dụng kít thƣơng phẩm - Dùng bơng hay tăm thấm ẩm nước cất, lau nhẹ để tách phần nhỏ dấu vết cần thử định hướng - Nhỏ giọt dung dịch Alcohol (dung dịch 1) vào dấu vết đợi khoảng 40 giây, nhỏ tiếp giọt dung dịch đổi màu (dung dịch 2), sau nhỏ giọt H2O2 3% (dung dịch 3) vào dấu vết đọc kết K17-Viện sinh thái tài nguyên sinh vật 52 Luận văn cao học Đàm Thị Huệ - Đánh giá kết quả: + Dương tính: cho kết màu hồng + Âm tính: khơng đổi màu Phản ứng đọc kết vòng phút Bảng 3.14 Kết tổng hợp so sánh độ nhạy phản ứng kít thử định hướng thương mại Độ pha lỗng Dương tính phenol Dương tính benzidine Dương tính metech Dương tính Hemastix 1/2 + + + + 1/4 + + + + 1/8 + + + + 1/16 + + + + 1/32 + + + + 1/64 + + + + 1/128 + + + + 1/256 + + + + 1/512 + + + + 10 1/1024 + + + + 11 1/2048 + + + + 12 1/4096 + + + + 13 1/8192 + + + + 14 1/16384 + + + + 15 1/32768 + + + + 16 1/65536 + - + + 17 1/131072 + - + + 18 1/262144 - - - + 19 1/524288 - - - + 20 1/1048576 - - - + 21 1/2097152 - - - + 22 1/4194304 - - - - STT Độ pha K17-Viện sinh thái tài nguyên sinh vật 53 Luận văn cao học Đàm Thị Huệ Đánh giá triển khai địa phương Từ kết nghiên cứu đạt được, tiến hành thử nghiệm dung dịch phenolphthalein dạng kít gửi số địa phương để kiểm nghiệm, đánh giá chất lượng, có 07 đơn vị gửi đánh giá số tiêu chí sau: + Chất lượng kít + Thao tác sử dụng + Độ nhạy + Khả triển khai giám định khám nghiệm trường Các địa phương gửi kết nhận xét: - Phịng KTHS Cơng an TP Hải Phịng - Phịng KTHS Cơng an tỉnh Vĩnh Phúc - Phịng KTHS Cơng an tỉnh Bắc Giang - Phịng KTHS Cơng an tỉnh Thanh Hóa - Phịng KTHS Cơng an Thừa Thiên Huế - Phịng KTHS Cơng an TP Hồ Chí Minh - Phân Viện KHHS TP Hồ Chí Minh Bảng 3.15 Tổng hợp kết nhận xét địa phương Đánh giá Tiêu chí Chất lượng kít Rất tốt Đạt Tốt Không đạt 4/7 2/7 1/7 - - 6/7 - 1/7 Độ nhạy 3/7 4/7 - - Khả triển khai 3/7 3/7 - 1/7 Thao tác sử dụng khám nghiệm trường K17-Viện sinh thái tài nguyên sinh vật 54 Luận văn cao học Đàm Thị Huệ Hiện có 30 đơn vị phịng Kỹ thuật hình Cơng an địa phương đề nghị đưa dung dịch thuốc thử phenolphthalein vào sản xuất thành kít để cung cấp cho địa phương nhằm thay thuốc thử dấu vết máu dung dịch Benzidine K17-Viện sinh thái tài nguyên sinh vật 55 Luận văn cao học Đàm Thị Huệ KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã xác định hóa chất chuyển đổi phenolphthalein từ trạng thái oxy hóa sang dạng khử kim loại kẽm (Zn), trình chuyển đổi diễn nhiệt độ sôi dung dịch Đã tối ưu đưa quy trình chuẩn dùng để pha chế thuốc thử định hướng xây dựng bước hướng dẫn sử dụng thuốc thử định hướng dấu vết máu Đã xác định độ nhạy phản ứng dung dịch máu pha loãng tới 1/65.536 lần cho kết dương tính đạt tới tỉ lệ 98% Với máu sau tháng độ nhạy giảm xuống khả dương tính với tỉ lệ 84% sau tháng, tháng tỉ lệ 52% 42% Khả dương tính giả thuốc thử: dương tính với nhóm nhựa thuộc họ cải nhóm chất tiến hành thử nghiệm Độ nhạy thuốc thử nhạy so với thuốc thử dung dịch benzidine (dung dịch benzidine có độ nhạy với máu tồn phần pha lỗng 1/32.768) Thuốc thử định hướng dấu vết máu sử dụng phenolphthalein đáp ứng đầy đủ tiêu chí giám định dấu vết máu, như: - Có tính đặc hiệu cao với dấu vết máu - Có độ nhạy đảm bảo tiêu chuẩn giám định sinh học pháp lý - Được sử dụng rộng rãi giới - Có độc tính thấp - Dễ tìm kiếm sử dụng bảo quản - Dễ pha chế thiết bị thông thường với giá thành rẻ K17-Viện sinh thái tài nguyên sinh vật 56 Luận văn cao học Đàm Thị Huệ Kiến nghị: Sau thực đề tài, có số kiến nghị sau: Phương pháp giám định định hướng kít phenolphthalein thay phương pháp giám định định hướng dấu vết máu sử dụng benzidine lợi ích mơi trường, sức khỏe cán chiến sỹ đặc biệt gia tăng độ nhạy, độ tiện dụng phương pháp tránh sai sót q trình khám nghiệm trường giám định dấu vết máu Tiếp tục nghiên cứu để tạo kít hồn chỉnh tiến tới nghiên cứu để tạo kít dạng khơ, tương tự kít Hemastic thị trường phục vụ tốt cho công tác giám định khám nghiệm trường dấu vết máu K17-Viện sinh thái tài nguyên sinh vật 57 Luận văn cao học Đàm Thị Huệ TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt PGS.TS Ngô Tiến Quý, Hà Quốc Khanh, TS Nguyễn Văn Hà, cộng sự, Giám định sinh học pháp lý Giáo trình Viê ̣n khoa ho ̣c hình sự, 2005 Hà Quốc Khanh, TS Nguyễn Văn Hà (2007), Giám định ADN, Giáo trình, Viê ̣n khoa ho ̣c hình sự PGS.TS Ngô Tiến Quý (2008), Bảo vệ khám nghiệm trường, NXB Công an Nhân dân Ths Phạm Xuân Thủy, CN Hà Quốc Khanh (2010), Dấu vết sinh vật pháp y hình sự, Giáo trình, Học viện Cảnh sát Nhân dân PGS.TS Ngô Tiến Quý (2013), Phát hiện, thu, bảo quản, nghiên cứu giám định dấu vết sinh học, NXB Công an Nhân dân Bạch Quốc Tuyên cộng (1974), Huyết học, tập 1, NXB Y học, Hà Nội Vũ Triệu An, Lê Đức Cư, Văn Đình Hoa, Nguyễn Ngọc Lanh, Đỗ Trung Phấn, Phạm Hoàng Phiệt (1982), Những kỹ thuật miễn dịch học, tập 2, NXB Y học, Hà Nội Tiếng anh Budowle B, Leggitt JL, Defenbaugh DA, Keys KM, Malkiewicz SF The presumptive reagent fluorescein for detection of dilute bloodstains and subsequent STR typing of recovered DNA J Forensic Sci 2000;45:1090-2 Butler J.M (2001), Forensic DNA: biology adn technology behind STR marker Academic Press, London 10.Butler J.M., Ruitberg C.M and Reeder D.J (1997), Proceedings of the Eighth Internationnal Symposium on Human Identification Madison WI: Promega corporation, pp73-88 11.Culliford, B.J.and Nickolls, L.C., The Benzidine Test, Journal of Forensic Sciences JFSCA, vol.9, No.1, Jan.1964, pp.175-191 K17-Viện sinh thái tài nguyên sinh vật 58 Luận văn cao học Đàm Thị Huệ 12.D.D Garner, Ph.D.;K.M.Cano, M.S.;R.S.Peimer, M.S.;and T.E Yeshion, M.S An Evaluation of Tetramethylbenzidine as a Presumptive Test for Blood 13.Cox, M, A study of the sensitivity and specificity of tests for blood Stock Four, Forensic Science Journal, JFSCA, Vol 36, No 5, September 1991, pp.1503-1511 14 Justin lautz, B.S Samantha webb, B.S.A comparision a study on the new formula of bluster latent bloodstain and its effects on ADN tying/ Amplyfication 15.Occupational Safety and Health Administration, Regulation H002 Washington, D.C.,29 jan.1974 16.Shanan S.Tobe,M.Sc.; Nigel Watson, Ph.D.; and Niamh Nic Dae’id, Ph.D.Evaluation of six Presumptive Tests for Blood, Their Specificity, Sensitivity, and Effect on High Molecular – Weight ADN 17.Chelex® DNA Extraction, Method N0 6A Victoria forensic Science – 1998 K17-Viện sinh thái tài nguyên sinh vật 59 ... nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu phương pháp thử định hướng dấu vết máu dung dịch phenolphthalein phục vụ công tác giám định sinh học pháp lý Việt Nam? ?? Mục tiêu nghiên cứu Tìm phương pháp thử định. .. dụng phương pháp thử định hướng dấu vết máu phenolphthalein y học hình sự, đề tài nghiên cứu thử nghiệm so sánh phương pháp thử định hướng dấu vết máu dung dịch phenolphthalein với phương pháp. .. dấu vết máu xác định dấu vết nghi vấn máu cần phải thu lượm phục vụ giám định tiếp theo.[5], [3] Giám định định hướng dấu vết máu bước tồn qui trình giám định dấu vết máu Về nguyên tắc giám định