Nghiên cứu tạo giống bèo tấm mang gen kháng nguyên h5n1 phòng chống bệnh cúm gia cầm

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIỆP BÁO CÁO TỔNG KẾT KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG BÈO TẤM MANG GEN KHÁNG NGUYÊN H5N1 PHÒNG CHỐNG BỆNH CÚM Ở GIA CẦM Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Di truyền Nông nghiệp Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Lê Huy Hàm Thời gian thực hiện: 01/2007-06/2011 8908 Hà Nội, 2011 BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIỆP Chương trình trọng điểm phát triển và ứng dụng CNSH trong lĩnh vực Nông nghiệp và PTNT đến 2020 BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI Nghiên cứu tạo giống bèo tấm mang gen kháng nguyên H5N1 phòng chống bệnh cúm ở gia cầm Chủ nhiệm đề tài/ dự án (ký tên) Cơ quan chủ trì đề tài/ d ự án: (ký tên và đóng dấu) PGS. TS Lê Huy Hàm BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D 2,4 Dichlorophenoxyacetic acid AS Acetosyringone BAP 6 – Benzylaminopurine Bp base pair (cặp bazơ) CH Casein hydrolysate CL Chọn lọc CTTN Công thức thí nghiệm DNA Deoxyribo Nucleic Acid EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Axit Et-Br Ethidium Bromide Gus -Glucuronidase gene (gen mã hóa -glucuronidase) H Hutner Hb Hemoglobin (lượng hemoglobin có trong một thể tích máu) Hct Hematocrit Hpt Gen mã hóa hygromycin phosphotransferase H/2 Môi trường Hutner/2 LG Lemna gibba LM Lemna minor MS Murashige and Skoog MSC Multi - Cloning Site MCPA 2-methyl – 4 cholorophenoxy acetic acid MCH Mean corpuscular hemoglobin - giá trị hemoglobin trung bình MCHC Mean corpuscular hemoglobin concentration - nồng độhemoglobin trung bình MCV Mean corpuscular volume - thể tích hồng cầu trung bình MPV Mean platelet volume - thể tích trung bình của tiểu cầu NAA 2- naphthalen-1-yl acetic acid NOS Nopalin Sythetase OD Optical Density (mật độ quang học) PCR Polymerase Chain Reaction RBC Red blood cell - số lượng hồng cầu (đơn vị 10 12 tế bào/L) RDW Red cell distribution width - độ phân bố về kích thước của hồng cầu SP Spirodela polyrrhiza SDS Sodium Dodecyl Sulfate TAE Tris-Acetate-EDTA TE Tris-EDTA T- DNA Transfer DNA TDZ Thidiazuron Ti-Plasmid Tumor inducing plasmid (plasmit gây khối u thực vật) VIR Virulence region (vùng gây độc có khả năng tạo khối u) WBC White blood cell - số lượng bạch cầu X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-glucuronodase acid 2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài MỤC LỤC Chương 1: MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu 2 1.3. Đối tượng nghiên cứu 2 1.4. Phạm vi nghiên cứu 2 Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Tính cấp thiết của đề tài 3 2.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống H5N1 5 2.2.1. Tình hình nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống H5N1 trên thế giới 5 2.2.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống H5N1 ở Việt Nam 7 2.3. Gen Hemagglutinin 8 2.4. Chuyển gen vào bèo tấm thực tại và triển vọng 11 2.4.1. Bèo tấm và tiềm năng chuyển gen 11 2.4.2. Agrobacterium với quá trình chuyển gen vào thực vật 16 2.4.3. Nâng cao khả năng biểu hiện gen trong thực vật 19 Chương 3: NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 3.1. Nội dung nghiên cứu 31 3.2. Vật liệu nghiên cứu 32 3.2.1. Vật liệu thực vật 32 3.2.2. Vật liệu di truyền 32 3.2.3. Các vật liệu khác 32 3.2.4. Hóa chất 32 3.3. Phương pháp nghiên cứu 35 3.3.1. Phương pháp tạo dòng gen mã hóa kháng nguyên và tạo vi sinh vật biểu hiện gen H5N1 trên bề mặt 36 3.3.2. Phương pháp tạo bèo tấm mang gen protein vỏ virus H5N1 40 3.3.3. Khảo nghiệm sản phẩm chuyển gen 51 Chương 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 56 NỘI DUNG A: TẠO DÒNG MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN 56 Nội dung 1: Thu thập, đánh giá nguồn vật liệu ban đầu (vật liệu TV) cho các nghiên cứu biến nạp di truyền 56 Nội dung 2: Xác định trình tự gen quan tâm, so sánh với các trình tự gen đã công bố trước đó, xác định những thay đổi về mặt cấu trúc gen 57 Nội dung 3: Tạo dòng các gen mã hóa kháng nguyên HA, NA của virus H5N1 trên cúm gia cầm tại Việt Nam 61 Nội dung 4: Tạo dòng các gen mã hóa kháng nguyên dạng đột biến mất đoạn hoặc gen dung hợp các đoạn peptid khác nhau hoặc các epitope khác nhau 63 4.1. Tách dòng gen HA gắn enzyme giới hạn nhận biết 63 4.2. Tách dòng gen HA1 gắn enzyme giới hạn nhận biết 64 4.3. Cải biến gen HA1 65 2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài 4.3.1. Cải biến vị trí MD2 trên đoạn gen HA1 bằng phương pháp Megaprimer 65 4.3.2. Cải biến vị trí MD5, MD3 trên gen HA1 bằng phương pháp Quickchange 67 4.3.3. Cải biến vị trí MD4 trên gen HA1 bằng phương pháp Megaprimer 68 4.3.4. Cải biến vị trí M2 trên đoạn gen HA1 sử dụng phương pháp OE-PCR kéo dài các đoạn gối lên nhau 70 NỘI DUNG B. TẠO VI SINH VẬT BIỂU HIỆN GEN H5N1 TRÊN BỀ MẶT 73 Nội dung 5: Tạo dòng và biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp của virus H5N1 trong E.coli phục vụ mục đích phát triển kháng thể chuyên biệt với các kháng nguyên của H5N1. 73 NỘI DUNG C. TẠO BÈO TẤM MANG GEN PROTEIN VỎ VIRUS H5N1 77 Nội dung 6: Lựa chọn, sưu tập, định danh, đánh giá khả năng sinh trưởng phát triển của một số giống bèo tấm đáp ứng yêu cầu là cây chủ để sản xuất protein tái tổ hợp. 77 Nội dung 7: Nghiên cứu tối ưu hoá các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo callus và tái sinh cây bèo tấm (L. gibba, L. minor, S. polyrrhiza) 84 Nội dung 8: Tách chiết phân lập các promotor đặc hiệu ở bèo tấm 88 8.1. Tách dòng đoạn promoter từ loài bèo tấm S. polyrrhiza DB2 88 8.2. Tách dòng đoạn promoter Ubiquitin từ loài bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 92 8.3. Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen HA1 đã cải biến - pPAM- HA1 M 95 8.4. Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen HA, HA1 đã cải biến với promoter bèo tấm (pPAM-Sp-HA1) 97 Nội dung 9: Thiết kế vectơ tái tổ hợp mang gen HA cho chuyển gen bằng Agrobacterium và bằng súng bắn gen 101 9.1. Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen HA cho chuyển gen bằng súng bắn gen 101 9.2. Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen HA cho chuyển gen bằng Agrobacterium 103 9.3 Chuyển vector tái tổ hợp chứa gen HA vào chủng A. tumefaciens. Kiểm tra chủng 111 Nội dung 10: Thử nghiệm các chủng Agrobacterium để xác định được chủng thích hợp cho chuyển gen vào callus và nguyên cây ở L. gibba, L. minor, S. polyrrhiza 112 Nội dung 11: Nghiên cứu tối ưu hoá quy trình chuyển gen vào callus và nguyên cây ở L. gibba, L. minor, S. polyrrhiza bằng súng bắn gen 114 11.1. Ảnh hưởng của tuổi mẫu đến biểu hiện tạm thời của gen gus 114 11.2. Ảnh hưởng khoảng cách bắn và áp lực khí He đến biểu hiện tạm thời của gen gus 116 11.3. Ảnh hưởng của việc xử lý áp suất thẩm thấu đến hiệu quả chuyển gen tạm thời 118 11.4. Ảnh hưởng hàm lượng hạt vàng đến biểu hiện tạm thời của gen gus 120 11.5. Ảnh hưởng của kích thước hạt vàng đến biểu hiện tạm thời của gen gus và khả năng tái sinh 121 Nội dung 12: Nghiên cứu tối ưu hoá quy trình chuyển gen vào callus và nguyên cây ở L. gibba, L. minor, S. polyrrhiza bằng A. tumefaciens 122 2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài 12.1. Chọn lọc chủng vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen vào bèo tấm SP thông qua vi khuẩn A. tumefaciens 122 12.2. Kết quả nghiên cứu lựa chọn vector thích hợp cho chuyển gen vào bèo tấm SP thông qua vi khuẩn A. tumefaciens 123 12.3. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở SP nguyên cây và callus 123 12.4. Ảnh hưởng của thời gian ly tâm chân không tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở SP nguyên cây và callus 124 12.5. Ảnh hưởng của thời gian ly tâm chân không tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở SP nguyên cây và callus 126 Nội dung 13. Chuyển gen kháng nguyên H5N1 vào bèo tấm 129 13.1. Chuyển gen kháng nguyên H5N1 vào bèo tấm thông qua A. tumefaciens 129 13.2. Chuyển gen kháng nguyên H5N1 vào bèo tấm bằng súng bắn gen 130 Nội dung 14. Phân tích đánh giá cây chuyển gen bằng các phương pháp SHPT 131 14.1. Tách chiết và kiểm tra DNA tổng số của ba loài bèo tấm L. minor, L. gibba, S. polyrrhiza 131 14.2. Phân tích PCR sự có mặt của gen chuyển trong ba loài bèo tấm L. gibba, L. minor, S. polyrrhiza chuyển gen 131 14.3. Phân tích cây chuyển gen bằng phương pháp Southern blot 135 14.4. Phân tích Western blot 137 14.4.1. Kết quả điện di protein tổng số 138 14.4.2. Kết quả kiểm tra phản ứng lai miễn dịch với kháng thể H5 bằng kỹ thuật Western blot 138 Nội dung D. Khảo nghiệm sản phẩm chuyển gen 140 Nội dung 15. Khảo sát khả năng gây đáp ứng miễn dịch của các dòng tế bào trình diện kháng nguyên trên gà 140 15.1. Thu mẫu máu 140 15.2. Kết quả đáp ứng miễn dịch của các dòng tế bào trình diện kháng nguyên 142 Nội dung 16. Thử nghiệm đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch ở gà trong thực tế 144 16.1. Kết quả phát hiện kháng thể kháng nguyên H5 bằng phản ứng HI 148 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 148 KẾT LUẬN 148 KIẾN NGHỊ 149 CHƯƠNG 6: TỔNG QUÁT HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THU ĐƯỢC 150 6.1. Kết quả về khoa học 150 6.2. Kết quả đào tạo 152 6.3. Kết quả nổi bật 153 6.4. Trình độ công nghệ 154 6.5. Khả năng áp dụng 154 6.6. Tình hình sử dụng kinh phí 154 6.7. Danh sách các công trình công bố 155 6.8. Hạn chế của đề tài 156 TÀI LIỆU THAM KHẢO 157 2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài Tài liệu tiếng Việt 157 Tài liệu tiếng Anh 158 PHỤ LỤC 1 168 PHỤ LỤC 2 169 PHỤ LỤC 3 171 PHỤ LỤC 4 173 PHỤ LỤC 5 179 PHỤ LỤC 6. THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 182 DANH MỤC BẢNG B ả ng 2.1. Kích thước gen nhân của một số loài bèo tấm 14 B ả ng 2.2. Thành phần và hàm lượng các hợp chất hữu cơ có trong cánh bèo 15 B ả ng 2.3. Codon ưu tiên sử dụng trong bèo tấm, thực vật (một, hai lá mầm) và virus H5N1 (Dickey et al., 2007, Murray et al., 1989, Zhou et al., 2005) 26 B ả ng 3.1. Trình tự các primer sử dụng để gắn các enzyme cắt đặc hiệu (RE) vào đầu gen HA, HA1 33 B ả ng 3.2. Trình tự các primer tạo đột biến điểm trên gen HA 33 B ả ng 3.3. Trình tự các primer sử dụng nhân cấu trúc CAMV35Sprom-GUS- NOSter 34 B ả ng 3.4. Trình tự các primer sử dụng để phân lập promoter bèo tấm 34 B ả ng 3.5. Trình tự các primer sử dụng để gắn các enzyme cắt đặc hiệu (RE) vào đầu promoter bèo tấm S. polyrhyza 35 B ả ng 3.6. Trình tự các primer sử dụng để kiểm tra trình tự các vị trí nối các enzyme 35 B ả ng 3.7. Trình tự cặp primer sử dụng để gắn gen HA vào vector biểu hiện 35 B ả ng 3.8. Các chủng A. tumefaciens và vector sử dụng cho nghiên cứu 41 B ả ng 3.9. Trình tự các đoạn mồi sử dụng trong nghiên cứu 46 B ả ng 4.1 . Số trình tự H5 hoàn chỉnh của gà và vịt Việt Nam (đến năm 2007) 56 B ả ng 4.2. Số trình tự N1 hoàn chỉnh của gà và vịt Việt Nam (đến năm 2007) 57 B ả ng 4.3. Các vị trí đã được cải biến trên gen HA1 73 B ả ng 4.4. Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng môi trường đến khả năng sinh trưởng và phát triển của các loài bèo tấm L. minor, L. gibba, S. polyrrhiza 80 B ả ng 4.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh trưởng và phát triển của bèo tấm L. minor, L. gibba, S. polyrrhiza 82 B ả ng 4.6. Ảnh hưởng của hàm lượng đường lên khả năng sinh trưởng của các loài bèo tấm 84 B ả ng 4.7. Các vị trí nucleotide khác biệt giữa Sp-Ubi-pin (Mỹ) với Sp-Ubi-pin 16 (Việt Nam) 93 B ả ng 4.8. Các vị trí nucleotide khác biệt giữa La-Ubi-pin với La-Ubi-10F 97 B ả ng 4.9. Chọn lọc chủng vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen vào bèo tấm SP 116 B ả ng 4.10. Ảnh hưởng của tuổi mẫu đến biểu hiện gen tạm thời của gen gus ở cánh bèo tấm chuyển gen 119 B ả ng 4.11. Ảnh hưởng của tuổi mẫu đến biểu hiện tạm thời của gen gus ở callus bèo tấm L. minor chuyển gen 120 B ả ng 4.12. Ảnh hưởng của khoảng cách bắn và áp lực khí đến biểu hiện gen gus tạm thời ở cánh bèo tấm chuyển gen 121 B ả ng 4.13 . Ảnh hưởng của khoảng cách bắn và áp lực khí đến biểu hiện tạm thời của gen gus ở callus bèo S. polyrrhiza chuyển gen 122 B ả ng 4.14. Ảnh hưởng của xử lý áp suất thẩm thấu đến biểu hiện gen gus tạm thời ở bèo nguyên cây chuyển gen 123 B ả ng 4.15. Ảnh hưởng của xử lý áp suất thẩm thấu đến biểu hiện gen gus tạm thời ở callus bèo S. polyrrhiza chuyển gen 124 B ả ng 4.16. Ảnh hưởng hàm lượng hạt vàng đến biểu hiện tạm thời của gen gus ở bèo nguyên cây 125 B ả ng 4.17. Ảnh hưởng hàm lượng hạt vàng đến biểu hiện tạm thời của gen gus ở callus 125 B ả ng 4.18. Ảnh hưởng kích thước hạt vàng đến biểu hiện tạm thời của gen gus 126 B ả ng 4.19. Lựa chọn vector thích hợp cho chuyển gen vào bèo tấm SP thông qua vi khuẩn A. tumefaciens 127 B ả ng 4.20. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở bèo SP 128 B ả ng 4.21. Ảnh hưởng của thời gian ly tâm chân không tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở SP 129 B ả ng 4.22. Ảnh hưởng của hàm lượng AS tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở bèo SP 130 B ả ng 4.23. Tổng hợp số thí nghiệm chuyển gen kháng nguyên H5N1 vào bèo tấm chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 133 B ả ng 4.24. Tổng hợp các thí nghiệm chuyển gen kháng nguyên HA1 vào bèo tấm bằng súng bắn gen 135 B ả ng 4.25. Danh sách các mẫu máu gà thu được 145 B ả ng 4.26. Kết quả số lượng bạch cầu 146 B ả ng 4.27. Bảng kết quả tổng hợp một số chỉ tiêu của máu 147 B ả ng 4.2 8 . Kết quả phản ứng HI 148 DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Cấu trúc protein Hemagglutinin 9 Hình 2.2. Hoa của loài bèo Lemna gibba 13 Hình 2.3. Cây phân loại bèo tấm theo Landolt, 1986 13 Hình 2.4. Bản đồ cấu trúc Ti-plasmid (Lê Thị Thu Hiền, 2003) 17 Hình 2.5. Sơ đồ vector nhị thể (Lê Thị Thu Hiền, 2003) 18 Hình 2.6. Cấu trúc hệ thống điều khiển Ubiquitin ở ngô 22 Hình 2.7. Sơ đồ minh họa phương pháp Megaprimer 29 Hình 3.1. Sơ đồ thí nghiệm thiết kế các vector mang gen HA để chuyển vào bèo tấm 36 Hình 4.1. Các dòng tái tổ hợp pCR2.1 mang gen HA của virus cúm gà và vịt được cắt bằng enzyme EcoRV và HindIII. 62 Hình 4.2. Các dòng chứa plasmid pCR2.1 mang gen 63 Hình 4.3. Hình ảnh điện di kết quả tách dòng gen HA trên gel agarose 0,8 %. 64 Hình 4.4. Hình ảnh điện di kết quả tách dòng gen HA1 trên gel agarose 0,8%. 65 Hình 4.5. Sơ đồ một số vị trí cải biến trên gen HA1 (987 bp) 66 Hình 4.6. Hình ảnh điện di kết quả cải biến vị trí MD2 trên gel 0,8% agarose. 66 Hình 4.7. Hình ảnh điện di kết quả cải biến vị trí MD5 trên gel agarosre 2% 68 Hình 4.8. Hình ảnh điện di kết quả cải biến vị trí MD3 trên gel agarosre 2% 68 Hình 4.9. Hình ảnh điện di kết quả cải biến vị trí MD4 trên gel 0,8% 69 Hình 4.10. Hình ảnh điện di kết quả cải biến vị trí M2 trên gel agarose 0,8% 70 Hình 4.11. So sánh trình tự nucleotide và amino acid giữa gen HA1 và HA1 M tại vùng cải biến 71 Hình 4.12. Sơ đồ gắn gen HA vào plasmid pET-22b(+) 74 Hình 4.13. Kết quả kiểm tra vector pET22b (+) cắt bằng HindIII và NotI (giếng 1) và pCR2.1-H5 cắt bằng EcoRI (giếng 2). 75 Hình 4.14. Minh hoạ thực hiện phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) 76 Hình 4.15. Nuôi gà thí nghiệm và gây tối miễn dịch bằng vaccine H5N1, và lấy máu kiểm tra tối miễn dịch. 77 Hình 4.16. Lấy máu gà trước khi gây tối miễn dịch bằng vaccine H5N1 (trên trái), sau đó tiêm vaccine H5N1 dưới da cổ để gây tối miễn dịch cho gà (trên phải) và lấy máu gà 14 ngày tuổi trước khi tiêm vaccine 77 Hình 4.17. Bèo Lemna gibba nuôi trong môi trường H/2+ 10 g/l sucrose, pH 7,0 84 Hình 4.18. Ảnh hưởng của đường sucrose (g/l) tới hệ số nhân cánh ở bèo S. 84 [...]... tiêu nghiên cứu Tạo giống bèo tấm mang gen biến nạp HA và NA có khả năng gây miễn dịch bệnh cúm gia cầm thông qua đường tiêu hoá 1.3 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu trong đề tài này là ba loài bèo tấm L gibba, L minor, S polyrrhiza; gen kháng nguyên HA1 của virus H5N1 1.4 Phạm vi nghiên cứu Các nghiên cứu tái sinh, tạo callus và chuyển gen kháng nguyên HA1 của virus H5N1 các loài bèo tấm. .. hữu tính của bèo tấm chỉ xảy ra khi chúng gặp điều kiện bất lợi để bảo tồn nòi giống (Landolt, 1986) Hệ gen của bèo tấm: Các nghiên cứu đối với hệ gen bèo tấm được tiến hành từ đầu những năm 80 của thế kỷ trước cho đến ngày nay Các kết quả cho thấy, bộ gen bèo tấm giống với bộ gen của thực vật nói chung, bao gồm gen nhân và gen ngoài nhân Bảng 2.1 Kích thước gen nhân của một số loài bèo tấm Loài 2n... 2004, 2005 Mặc dù đã áp dụng nhiều biện pháp phòng chống, cho đến nay vẫn còn những ổ dịch nhỏ (www.cucthuy.gov.vn) Xuất phát từ những cơ sở khoa học và đòi hỏi của thực tế trên, Viện Di truyền Nông nghiệp đã được Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn cho phép thực hiện đề tài Nghiên cứu tạo giống bèo tấm mang gen kháng nguyên H5N1 phòng chống bệnh cúm ở gia cầm thuộc Chương trình trọng điểm phát triển... bèo chuyển gen Hình 4.43 Kết quả điện di kiểm tra mẫu DNA tổng số tách từ bèo tấm S 130 132 polyrrhiza chuyển gen trên gel agarose 0,8 % Hình 4.44 Kết quả phân tích PCR gen HA1các dòng bèo tấm Lemna gibba chuyển gen 132 Hình 4.45 Kết quả phân tích PCR gen HA1các dòng bèo tấm LM chuyển gen 133 Hình 4.46 Kết quả phân tích PCR gen HA1các dòng bèo tấm LM chuyển gen 133 Hình 4.47 Kết quả phân tích PCR gen. .. 2.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống H5N1 2.2.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống H5N1 trên thế giới Đối với bệnh truyền nhiễm, vaccine được coi là biện pháp có tính chiến lược, nhằm ngăn chặn lây lan, tạo bảo hộ miễn dịch (Subbarao, Luke, 2007) Đối với dịch cúm trên người, nghiên cứu phát triển vaccine không những ngăn ngừa làm giảm được bệnh ở gia cầm, mà còn khống chế... của một số loài bèo tấm so với các loài đối chứng được liệt kê trên bảng 2.1 (Landolt, 1986) Gen ngoài nhân của bèo tấm bao gồm gen lục lạp và gen ty thể Gen lục lạp (cpDNA) của bèo tấm là đối tượng được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất Tháng 5 năm 2008, bộ gen lục lạp của Lemna minor đã giải trình tự hoàn chỉnh Bộ gen lục lạp có cấu trúc mạch vòng bao gồm 165 955 bp mã hóa cho 112 gen (78 gen mã hóa protein,... gây chết gia cầm mà còn thích ứng và gây chết người bệnh Có thể coi dòng virus cúm A /H5N1 từ 1996 đến nay là cúm A hiện đại mới xuất hiện Virus H5N1 gây ra dịch cúm trên gia cầm tại Hồng Kông, Trung Quốc và lây lan sang hàng chục quốc gia của nhiều châu lục trên thế giới, trong đó có Việt Nam Cơ bản về cấu trúc virus cúm vẫn như trước đó, nhưng xét về độc lực,loài vật chủ nhiễm bệnh, tính kháng nguyên. .. tạo vaccine tái tổ hợp bằng cách đưa các đoạn gen mã hóa kháng nguyên HA hoặc tiểu đơn vị của kháng nguyên HA (HA1, HA2) của chủng H5N1 vào biểu hiện trong adenovirus Điều đáng chú ý là kháng nguyên HA1 và HA tái tổ hợp có mức bảo hộ 100% đối với gà thực nghiệm, trong đó kháng nguyên HA2 có mức độ bảo hộ 60% Hemagglutinin với nghiên cứu sản xuất vaccine thực vật Vấn đề biểu hiện và sản xuất kháng nguyên. .. dòng bèo tấm SP chuyển gen 134 Hình 4.48 Kết quả phân tích PCR gen HA1các dòng bèo S polyrrhiza 135 chuyển gen 136 Hình 4.49 DNA tổng số được cắt bằng BamHI Hình 4.50 Kết quả lai DNA của các dòng bèo tấm chuyển gen 137 Hình 4.51 Kết quả điện di protein tổng số các dòng bèo chuyển gen 138 Hình 4.52 Kết quả phân tích Western blot các dòng bèo chuyển gen 139 Hình 4.53 A Gà nuôi trong chuồng; B Cho gà ăn bèo. .. sử dụng 2.4 Chuyển gen vào bèo tấm thực tại và triển vọng 2.4.1 Bèo tấm và tiềm năng chuyển gen 2.4.1.1 Giới thiệu chung về cây bèo tấm Phân bố của bèo tấm: Bèo tấm với tên khoa học Lemnaceae là loài sinh vật thủy sinh có khả năng tồn tại và phát triển ở nhiều nơi trên thế giới, trừ những vùng cực bắc và cực nam quanh năm giá lạnh Ở vùng sa mạc và vùng ẩm ướt thì sự có mặt của bèo tấm cũng ít hơn Trong . BÁO CÁO TỔNG KẾT KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG BÈO TẤM MANG GEN KHÁNG NGUYÊN H5N1 PHÒNG CHỐNG BỆNH CÚM Ở GIA CẦM Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Di truyền Nông. 2020 BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI Nghiên cứu tạo giống bèo tấm mang gen kháng nguyên H5N1 phòng chống bệnh cúm ở gia cầm Chủ nhiệm đề tài/ dự án (ký tên) Cơ quan chủ trì đề. nghiệp và Phát triển nông thôn cho phép thực hiện đề tài Nghiên cứu tạo giống bèo tấm mang gen kháng nguyên H5N1 phòng chống bệnh cúm ở gia cầm thuộc Chương trình trọng điểm phát triển và ứng dụng