NGHIÊN CỨU TẠO CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN KHÁNG SÂU vip 3A

Trong lịch sử , cây thuốc lá được trồng đầu tiên ở Châu Mĩ từ hơn 6000 năm trước công nguyên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ----------      ---------- TRẦN THỊ THANH HẢO NGHIÊN CỨU TẠO CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN KHÁNG SÂU vip3A LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: TRỒNG TRỌT Mã số: 60.62.01 Người hướng dẫn: 1. TS. CHU HOÀNG HÀ 2. GS.TS NGUYỄN QUANG THẠCH HÀ NỘI - 2009 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… i LỜI CAM ðOAN - Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào. - Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Trần Thị Thanh Hảo Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ii LỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành chương trình học tập, thực hiện ñề tài và hoàn chỉnh luận văn tốt nghiêp, tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp ñỡ vô cùng quý báu của Ban giám hiệu, Khoa Sau ñại học trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, Ban lãnh ñạo Viện Kinh tế Kỹ thuật Thuốc lá Hà Nội và tập thể Phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học. Tôi xin trân trọng cảm ơn Tiến sĩ Chu Hoàng Hà - Phó trưởng phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học ñã giúp ñỡ và tạo ñiều kiện cho tôi hoàn thành tốt quá trình học tập, thực hiện nghiên cứu ñề tài và hoàn chỉnh luận văn. Tôi cũng xin ñược trân trọng cảm ơn và GS.TS Nguyễn Quang Thạch, trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, người luôn theo dõi và hướng dẫn chu ñáo ñể tôi hoàn thành bản luận văn này. Qua ñây, tôi cũng chân thành cảm ơn tập thể cán bộ bộ phòng Sinh học Viện Kinh tế Kỹ thuật Thuốc lá Hà Nội, Khoa Nông học, Bộ môn Công nghệ Sinh học - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, những người thân trong gia ñình và bạn bè ñã tạo ñiều kiện giúp ñỡ tôi thực hiện ñề tài và hoàn thành bản luận văn tốt nghiệp. Tác giả luận văn Trần Thị Thanh Hảo Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iii MỤC LỤC Lời cam ñoan Error! Bookmark not defined. Lời cảm ơn Error! Bookmark not defined. Mục lục Error! Bookmark not defined. Danh mục các chữ viết tắt Error! Bookmark not defined. Danh mục bảng Error! Bookmark not defined. Danh mục hình Error! Bookmark not defined. 1. MỞ ðẦU 1 1.1 ðặt vấn ñề 1 1.2 Mục ñích và yêu cầu 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Giới thiệu chung về cây thuốc lá 3 2.1.1 Lịch sử hình thành - phát triển thuốc lá 4 2.1.2 Các ñặc ñiểm thực vật học cây thuốc lá 5 2.1.3 Tình hình sâu bệnh hại 6 2.1.5 Giá trị của cây thuốc lá 7 2.1.6 Tình hình sản xuất thuốc lá nguyên liệu 7 2.2. Chuyển gen ở thực vật - cơ sở khoa học của dề tài 9 2.2.1 Khái niệm chuyển gen 9 2.2.2 Các phương pháp chuyển gen cho cây trồng 10 2.3 Giới thiệu chung về Bacillus thuringiensis (Bt) 19 2.3.1 Lịch sử phát hiện ñộc tố Bt 19 2.3.2 Các loại protein ñộc tố của Bt 20 2.4 Một số thành tựu chuyển gen vào cây thuốc lá trên thế giới 22 2.5 Tình hình nghiên cứu về cây thuốc lá chuyển gen trong nước 23 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 3.1 Vật liệu, hoá chất, thiết bị 25 3.1.1 Vật liệu 25 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iv 3.1.2 Hoá chất, thiết bị 25 3.2 ðịa ñiểm và thời gian: 26 3.3 Phương pháp nghiên cứu 26 3.3.1 Phương pháp thiết kế vector chuyển gen 26 3.3.2 Phương pháp chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào A. tumefaciens bằng xung ñiện 31 3.3.3 Phương pháp chuyển gen vào thuốc lá thông qua A. tumefaciens (theo Topping, 1998 ) 31 3.3.4 Phân tích cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR 33 3.4 Các chỉ tiêu theo dõi: 36 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 4.1 Thiết kế vector pBI121 mang gen vip3A 37 4.1.1 Thiết kế mồi 38 4.1.2 PCR nhân ñoạn gen vip3A và tinh sạch sản phẩm PCR 39 4.1.3 Ghép nối ñoạn gen vip3A vào vector tách dòng 40 4.1.4 Biến nạp plasmit tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α 40 4.1.5 Chọn lọc plasmit tái tổ hợp 41 4.1.6 Tạo vector chuyển gen mang gen vip3A 42 4.2 Chuyển gen vip3A vào cây thuốc lá 45 4.2.1 Biến nạp vector mang gen vip3A vào tế bào A. tumerfaciens bằng xung ñiện 45 4.2.2 Chuyển cấu trúc mang gen vip3A vào cây thuốc lá thông qua vi khuẩn A. tumefaciens 46 4.3 Kiểm tra và theo dõi kết quả chuyển gen 53 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 5.1 Kết luận 57 5.2 Kiến nghị 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC 64 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BAP 6 - benzyladenine bp Base pair = cặp bazơ Bt Bacillus thuringiensis Cefo Cefotaxime CNSH Công nghệ sinh học cry Crystal toxin gene = gen mã hóa protein nội ñộc tố δ cs Cộng sự CTTN Công thức thí nghiệm CV Coefficient of variation = sai số thí nghiệm DNA Deoxyribonucleic Acid EtBr Ethidium bromide GM Kan 30 Môi trường tái sinh chồi chứa kanamycin nồng ñộ 30mg/l GM Kan 50 Môi trường tái sinh chồi chứa kanamycin nồng ñộ 50mg/l GM Môi trường tái sinh chồi gus β - Glucuronidase gene = Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase IBA Indole-3-butyric acid Kan Kanamycin kb kilo base kDa kilo Dalton LB Môi trường theo Luria và Bertani LSD Least significant difference = sai khác nhỏ nhất có ý nghĩa MS Môi trường cơ bản theo Murashige và Skoog (1962) MT Môi trường OD Optical density = mật ñộ quang học PCR Polymerase Chain Reaction = phản ứng chuỗi polymerase RM Môi trường ra rễ RM Kan 50 Môi trường ra rễ chứa kanamycin nồng ñộ 50mg/l RNA Ribonucleic Acid TAE Tris bazơ - Axit acetic – EDTA T-DNA Transfer - DNA = ñoạn DNA ñược chuyển TE Tris HCl - EDTA, pH = 8 Ti- plasmid Tumor inducing plasmid = plasmid gây khối u v/p Vòng/phút vip Vegetative insecticidal protein = gen mã hoá protein sinh dưỡng diệt côn trùng vir Virulence region = vùng gây ñộc Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vi DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1. Sản lượng các dạng thuốc lá nguyên liệu chủ yếu của thế giới giai ñoạn 2004 - 2008 8 2.2. Tình hình sản xuất TLNL vàng sấy của Việt Nam 2006 – 2008 9 4.1. Trình tự và những thông số liên quan của cặp mồi nhân gen vip3A 38 4.2. Tỷ lệ tái sinh/sống sót của các mẫu qua các giai ñoạn 49 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1 Cấu trúc Ti- Plasmit 12 2.2 Mô chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium 14 4.1 Kết quả ñiện di tinh sạch sản phẩm PCR nhân gen vip3A 39 4.2 Kết quả biến nạp plasmit tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α 40 4.3 Kết quả ñiện di sản phẩm cắt plasmit 41 4.4 Sản phẩm cắt bằng enzyme BamHI& SacI 43 4.5 Kết quả ñiện di sản phẩm PCR từ 14 dòng khuẩn lạc cặp mồi ñặc hiệu V1.2/V2.2 44 4.6 Kết quả ñiện di kiểm tra sản phẩm phản ứng cắt plasmit tái tổ hợp bằng enzyme BamHI & SacI 45 4.7 Vi khuẩn A.tumerfaciens/ C58 /vip3A trên môi truờng LB ñặc chọn lọc 48 4.8 Dịch huyền phù vi khuẩn 48 4.9 Mảnh lá CTTN trên MT GM Kan 30 50 4.10 Mảnh lá ð/C1 trên MT GM Kan 30 50 4.11 Mảnh lá ð/C2 trên MT GM 50 4.12 Cụm chồi CTTN trên MT GM Kan 50 50 4.13 Cụm chồi ð/C1 trên MT GM Kan 50 50 4.14 Cụm chồi ð/C2 trên MT GM 50 4.15 Cây tái sinh trên MT RM Kan 50 (chọn lần 1) 51 4.16 Cây tái sinh trên MT RM Kan 50 (chọn lần 2) 51 4.17 Cây ð/C trên MT RM Kan 50 51 4.18 Rễ cây chuyển gen trên môi trường RM Kan 50 51 4.19 Rễ cây ð/C trên môi trường RM Kan 50 51 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… viii 4.20 Cây trong bầu trấu cát 53 4.21 Cây trồng trong bầu ñất 53 4.22a Kết quả ñiện di sản phẩm PCR của 16 dòng thuốc lá với cặp mồi 33S Fs/Rs 54 4.22b Kết quả ñiện di sản phẩm PCR của 6 dòng thuốc lá với cặp mồi 35S Fs/Rs 55 4.23 Kết quả ñiện di sản phẩm PCR của 22 dòng thuốc lá với cặp mồi V2.1/V2.3 56 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 1 1. MỞ ðẦU 1.1 ðặt vấn ñề Thuốc lá (Nicotiana tabacum L) là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao. Sản phẩm thu hoạch là lá tươi, phải thông qua giai ñoạn chế biến ñặc trưng (sấy, hong, phơi…) mới có thể dùng lá làm nguyên liệu sản xuất thuốc lá. Ngoài ra cây thuốc lá cũng ñược sử dụng làm nguyên liệu sản xuất nicotin, dùng làm chế phẩm trừ sâu, axit hữu cơ, hạt dùng ñể chiết xuất dầu thực vật. Nghiên cứu chọn tạo giống thuốc lá theo các hướng khác nhau ñược quan tâm ở các quốc gia lớn như Mỹ, Brazil, Trung Quốc, Zimbawe…Một trong những hướng chọn tạo giống ñược quan tâm hiện nay là ứng dụng công nghệ biến ñổi di truyền ñể chọn tạo giống kháng sâu bệnh hại chính như kháng các bệnh virus khảm lá thuốc lá (TMV,CMV), virus xoăn lá thuốc lá (TLCV) hoặc kháng sâu (sâu xanh, sâu xám .). Ngoài khuynh hướng tạo tính kháng sâu của cây bằng gen cry mã hóa cho sự tạo nội ñộc tố δ trong pha sinh bào tử của vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt), gần ñây các nhà khoa học ñã phát hiện các gen vip (vegetative insecticidal protein - các protein sinh dưỡng diệt côn trùng) mã hóa cho các protein trong pha dinh dưỡng của chu trình phát triển vi khuẩn Bt và Bacillus cereus (Bc), chiết tách, nhân bản, xác ñịnh trình tự và thử hoạt tính sinh học. Kết quả cho thấy các protein Vip có hoạt lực và phổ tác dụng diệt côn trùng cao hơn rất nhiều lần các protein do gen cry mã hóa. Gen vip3 tạo protein có hoạt tính kháng sâu xám cao gấp 260 lần so với protein cry IA và có phổ hoạt ñộng rộng như diệt ñược sâu xanh hại ngô, sâu xanh hại thuốc lá [12]. Ở Việt Nam, cây thuốc lá là một trong những cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao [7]. Vấn ñề sâu bệnh hại trong sản xuất là một trong những nguyên nhân gây giảm năng suất và chất lượng của nguyên liệu, do vậy ứng [...]... tài: Nghiên c u t o cây thu c lá chuy n gen kháng sâu vip3 A” 1.2 M c ñích và yêu c u 1.2.1 M c tiêu c a ñ tài: T o ra cây thu c lá chuy n gen mang gen kháng sâu (vip3 A) 1.2.2 N i dung nghiên c u: - Thi t k vector chuy n gen mang gen vip3 A - Chuy n gen vip3 A vào cây thu c lá thông qua vi khu n A tumerfaciens - Theo dõi, ki m tra và ñánh giá các dòng thu c lá chuy n gen Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i... kháng sâu b nh h i là m t trong nh ng hư ng ñi ñ gi i quy t v n ñ ñó Vi n Công ngh Sinh h c ñã bư c ñ u chuy n thành công gen kháng b nh vào cây thu c lá (kháng b nh kh m lá thu c lá TMV, kh m lá dưa chu t CMV)… [2] nhưng chưa có nghiên c u nào ñư c công b v s d ng gen vip3 A trong t o gi ng cây tr ng chuy n gen kháng sâu Trên cơ s ñó chúng tôi ti n hành nghiên c u ñ tài: Nghiên c u t o cây thu c lá. .. thành t u chuy n gen vào cây thu c lá trên th gi i Cây thu c lá chuy n gen kháng ch t di t c ñư c ti n hành t i M và Pháp năm 1986 Cây thu c lá là ñ i tư ng ñư c chuy n gen kháng sâu ñ u tiên vào năm 1987 (Barton và cs, 1987; Fischoff và cs, 1987; Vaeck và cs, 1987) [28] Trung Qu c là qu c gia ñã thương m i hóa cây thu c lá chuy n gen kháng b nh (kháng virus kh m lá thu c lá) , kháng sâu (Zhao Rong min,... v nh ng nghiên c u chuy n gen kháng sâu vip3 A vào cây thu c lá Vi t Nam Chính vì v y chúng tôi ti n hành nghiên c u t o cây thu c lá mang gen kháng sâu vip3 A Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………24 3 V T LI U, N I DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 3.1 V t li u, hoá ch t, thi t b 3.1.1 V t li u - V t li u th c v t: Gi ng thu c lá K326 là gi ng thu c lá nh p... 2020 Do h th ng tái sinh cây thu c lá tương ñ i ñơn gi n và th i gian phân hóa t mô ñ n cây hoàn ch nh khá ng n nên trong nh ng nghiên c u v chuy n gen các nhà khoa h c thư ng ch n cây thu c lá là cây mô hình vì v y nh ng nghiên c u v chuy n gen trên cây thu c lá ñã ñư c ti n hành t khá s m Nguyên Liên Chi và cs (1989) [6] ñã chuy n thành công gen kháng kanamycin vào mô thu c lá (N.tabacum) b ng vi khu... (1992) cũng ñã t o ñư c cây thu c lá chuy n gen cry1A(c) mRNA có ñ c t cao g p 10 - 20 l n so v i cây thu c lá chuy n gen dùng CaMV35S promoter, hàm lư ng protein ñ c t thu ñư c chi m g n 1% lư ng protein hoà tan t ng s trong lá Gen cryIII cũng ñư c chuy n vào cây Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………22 thu c lá và cây khoai tây ñ kháng sâu Colorado potato beetle... và cs, 1993) [40] Gen cry1A(b) và cry1A(c) cũng ñư c chuy n vào cây ñ phòng tr côn trùng cánh v y (Van der Salm và CS, 1994) 100% sâu xanh (H virescens, H zea và S exigua) ch t khi ăn lá c a cây thu c lá thu c lá ñư c chuy n gen cry2Aa2 (Kota và cs, 1999) [36] Selvapandian và cs (1998) chuy n gen cry1Ia5 vào thu c lá và cũng th hi n tính kháng sâu xanh (H armigera ) tương ñương v i gen cry1A(b) ho c... s “nhi u gen và không b n v ng c a gen trong th c v t, t n s chuy n gen th p, k t qu có th thu ñư c nh ng cây mang th kh m nghĩa là ch mang gen m t s v trí trên cây ð c bi t là khi như c ñi m c a A tumerfaciens ch chuy n gen trên cây hai lá m m ñư c kh c ph c, vi c chuy n gen vào cây m t lá m m tr thành hi n th c và ñư c ng d ng thành công thì phương pháp chuy n gen nh vi khu n Agrobacterium ngày... gam h t có t 10.000 ñ n 15.000 h t [14] 2.1.3 Tình hình sâu b nh h i Cây thu c lá b các lo i b nh h i chính là b nh kh m lá thu c lá do virus (TMV,CMV), b nh xoăn lá thu c lá do virus (TLCV), b nh héo rũ vi khu n , ñen thân, héo ñ m cà chua Các lo i sâu chính gây h i trên thu c lá là sâu xanh (Helicoverpa assulta), sâu khoang (Prodenia litura), sâu xám (Agrotis ypsilon) Vi t Nam, tuy chưa có s li u... và cs (1994) [10] cũng công b k t qu nghiên c u bi n n p m t s gen ch n l c vào các dòng thu c lá b ng cách s d ng Ti-plasmit vector Nguy n ð c Thành và cs (1994) [11] ñã ti n hành nghiên c u chuy n gen l c l p thu c lá Tr n ðăng Kiên và cs (1999) [8] ñã nghiên c u phương pháp bi n n p gen t o gi ng thu c lá có kh năng kháng sâu b nh, trong ñó ñã xác ñ nh ñư c mô lá là b ph n t t nh t bi n n p, n ng