Nghiên cứu tạo dòng thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc RNAi kháng đồng thời SMV và BYMV

i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN THỊ PHƯƠNG NGÂN NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG THUỐC LÁ CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC RNAi KHÁNG ĐỒNG THỜI SMV VÀ BYMV LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC Mã số: 60.42.01.21 Cán hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên - 4/2015 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Thái Nguyên - 8/ 2014 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu được thực hiện dưới sự hướng dẫn của GS.TS Chu Hoàng Mâ ̣u Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa công bố công trình khác Thái Nguyên, ngày 10 tháng năm 2015 Tác giả Nguyễn Thi Phương Ngân ̣ Ban chủ nhiê ̣m khoa Cán bộ hướng dẫn khoa học GS.TS Chu Hoàng Mâ ̣u Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Chu Hoàng Mậu tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện để hoàn thành Bản luâ ̣n văn tha ̣c si ̃ Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại, cảm ơn Ban chủ nhiê ̣m khoa và các thầy cô khoa Sinh - KTNN tạo điều kiện giúp đỡ trình học tập hoàn thành đề tài luận văn Tôi xin cảm ơn cán bô ̣ Phòng ADN ứng du ̣ng, Phòng thí nghiệm Trọng điểm công nghệ gen, Viêṇ Công nghê ̣ sinh ho ̣c, Viêṇ Hàn lâm Khoa học Công nghê ̣ Viê ̣t Nam ta ̣o điề u kiêṇ và giúp đỡ quá trình tiế n hành thí nghiê ̣m của đề tài Tôi xin cảm ơn Tiến sỹ Lò Thị Mai Thu Thạc sĩ Lê Thị Hồng giúp đỡ trình thực hiêṇ đề tài luận văn Đề tài luận văn thuộc chương trình đào tạo nghiên cứu sinh và cao học của Bộ môn Di truyề n & Sinh học hiê ̣n đại, khoa Sinh-Kỹ thuật nông nghiê ̣p, trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên Tác giả Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN…………………………………………………… i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vii MỞ ĐẦU…………………………………………………………… Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………… 1.1 SOYBEAN MOSAIC VIRUS VÀ BEAN YELLOW MOSAIC VIRUS 1.1.1 Bệnh khảm ở đậu tương 1.1.2 Hệ gen SMV, BYMV Potyvirrus 1.2 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RNAi TRONG TẠO CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN KHÁNG VIRUS 11 1.2.1 Cây thuốc và bệnh virus thuốc 11 1.2.2 Cơ chế RNA interference (RNAi) 14 1.2.3 Ứng dụng kỹ thuật RNAi tạo trồng chuyển gen kháng virus 1.3 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ TRONG PHÂN TÍ CH CÂY 16 CHUYỂN GEN 18 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BI 22 ̣ 2.1.1 Vật liệu 22 2.1.2 Hóa chất 22 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iv 2.1.3 Thiết bị 22 2.1.4 Địa điểm nghiên cứu 23 2.2 Phương pháp nghiên cứu 23 2.2.1 Phương pháp chuyển gen vào thuốc thông qua Agrobacterium tumefaciens 23 2.2.2 Phân tích sự có mặt cấu trúc chuyển gen pK7GW/SMVBYMV-CPi phương pháp PCR………………………………… 26 2.2.3 Lây nhiễm nhân tạo SMV BYMV vào lá thuố c …… 28 2.2.4 Phân tích số lượng virus thuốc chuyển gen chứa cấu trúc CPi (SMV-BYMV) kỹ thuâ ̣t Real time RT- 29 PCR………………………………………………………………… Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 KẾT QUẢ CHUYỂN CẤU TRÚ C pK7GW/SMV-BYMV-CPi VÀO THUỐC LÁ 30 3.1.1 Đồng nuôi cấy với dung dịch A tumeffaciens cảm ứng tạo cu ̣m chồi 30 3.1.2 Tạo rễ phát triển chuyể n gen hoàn chỉnh …………… 33 3.2 KẾT QUẢ PHÂN TÍ CH CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN 35 3.2.1 Kết kiểm tra cấ u trúc RNAi dòng thuốc chuyển gen 35 3.2.2 Phân tích khả kháng virus các dòng chuyển gen CPi (SMV-BYMV) điề u kiêṇ lây nhiễm nhân tạo 36 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHI…………………………………… ̣ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………… 41 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iv DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT AS Acetosyringone A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens BAP 6-Benzyl Amino Purine BGMV Bean Golden Mosaic Virus BYMV Bean yellow mosaic virus bp Base pair (cặp base) CP Coat protein (protein vỏ) CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide cs Cộng sự ĐC Đối chứng EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetate Acid DNA Deoxyribo Nucleic Acid GA3 Gibberellic acid GM Môi trường tạo chồi hpRNA Hairpin RNA (cấu trúc RNA kẹp tóc) IhpRNA Intron hairpin RNA (Cấu trúc kẹp tóc mang intron) IAA Indoleacetic acid IBA Indole-3butyric acid Kb Kilo base Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn v LB Luria and Bertani MS Môi trường theo Murashige Skoog (1962) PCR Polymerase chain reaction RM Môi trường rễ RNAi RNA interference siRNA Short interfering RNA SMV Soybean mosaic virus T0, T6, T12 Các dòng thuốc chuyển gen TAE Tris Acetate EDTA Taq Thermus aquaticus Vir Virulence Region WT1, WT2, WT3 Cây thuốc không chuyển gen Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn v DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Thành phần loại môi trường tái sinh in vitro………… 24 Bảng 2.2 Thành phần dung dịch đệm tách DNA tổng số…………… 26 Bảng 2.3 Trình tự nucleotide của că ̣p mồ i PCR khuế ch đa ̣i đoa ̣n Cpi 28 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen Cpi 28 Bảng 3.1 Kết cảm ứng chồi từ mảnh lá………………………… 31 Bảng 3.2 Kết tạo chồi từ mảnh lá……………………………… 33 Bảng 3.3 Kế t quả tạo rễ tái sinh thuốc ở thí nghiệm đối chứng………………………………………………………………… 34 Bảng 3.4 Kết định lượng sự có mặt virus SMV thuốc chuyển gen………………………………………………… Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 39 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Lá đậu tương bị nhiễm SMV .5 Hình 1.2 Sơ đồ cấu trúc hệ protein potyvirus Hình 1.3 Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pK7GW-CPi (SMV-BYMV) 11 Hình 1.4 Cây thuốc giống C9-1 11 Hình 1.5 Cơ chế hoạt động RNAi 15 Hin ̀ h 3.1 Các mảnh được ngâm dung dịch huyền phù vi khuẩn A.tumefaciens tái tổ hơ ̣p 31 Hình 3.2 Hình ảnh phát sinh cu ̣m chồ i .32 Hình 3.3 Hình ảnh tạo rễ môi trường kháng sinh chọn lọc 34 Hin ̀ h 3.4 Các dòng thuốc lá chuyển gen ở thế ̣ T0 trồ ng châ ̣u nhà lưới 35 Hình 3.5 Kế t quả điện di kiể m tra DNA tổng số tách từ mẫu thuốc chuyể n gen 35 Hình 3.6 Kế t quả điện di kiể m tra sản phẩ m PCR nhân đoa ̣n CPi (SMV-BYMV) từ 21 dòng thuốc chuyể n gen 36 Hin ̀ h 3.7 Hình ảnh mô ̣t số dòng thuố c lá chuyể n gen và đố i chứng .37 Hình 3.8 Đồ thị khuếch đại đoa ̣n cDNA từ mẫu thuốc phân tích Real time RT-PCR .38 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) loại trồng cạn có giá trị kinh tế hàm lượng dinh dưỡng cao Hạt đậu tương được dùng làm thực phẩm cho người, thức ăn cho gia súc Ngoài sản phẩm khô dầu đậu tương được dùng làm mực in, sơn, xà phòng, chất dẻo, thuốc trừ sâu Hạt đậu tương được dùng nhiều y học, giúp tránh hiện tượng suy dinh dưỡng ở trẻ em, người già; hạn chế bệnh loãng xương ở phụ nữ; bệnh đái tháo đường, thấp khớp Ngoài đậu tương trồng ngắn ngày, thích hợp cho luân canh, xen canh gối vụ với nhiều loại khác cải tạo đất tốt [4] Việt Nam nước nông nghiệp, đậu tương trồng chủ đạo Mặc dù bắt đầu tiến hành sản xuất quy mô công nghiệp từ năm 2011 Việt Nam vẫn tiếp tục phải nhập phần lớn lượng bột đậu tương nhằm bù đắp sự thiếu hụt thực phẩm protein nước đáp ứng nhu cầu ngày tăng ngành công nghiệp thức ăn chăn nuôi nuôi trồng thủy sản Năng suất sản lượng đậu tương nước ta ở mức thấp có thể nguyên nhân như: Nhiều giống hiện trồng suất tính ổn định chưa cao, sức biến động lớn miền, vùng; Khả kháng virus sâu bệnh giống đậu tương trồng thấp; Chưa có dự báo thời vụ gieo trồng thích hợp cho vùng Đậu tương số trồng dễ bị nhiễm nhiều loại virus, ví dụ bệnh khảm (Soybean mosaic virus - SMV), bệnh khảm vàng ở đậu tương (Soybean yellow mosaic virus - SYMV), bệnh xoăn lá, bệnh gỉ sắt hại đậu tương nấm Phakopsora pachyrhizi, bệnh Sương mai (đốm phấn) nấm Peronospora manshurica, bệnh lở cổ rễ nấm Rhizoctonia solani Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 33 Bảng 3.2 Kết tạo chồi từ mảnh Cấu trúc RNAi Số mẫu Tổng số Số chồi Tỉ lệ tạo tạo chồi chồi trung chồi (%) bình/mảnh pK7GW-CPi (SMV- BYMV) ĐC0 25 64 2,62 62,5 - - - - ĐC1 38 102 2,7 95,0 Bảng 3.2 cho thấ y 95% mảnh lô đố i chứng ĐC1 không chuyển gen thu được chồi, với tỉ lệ trung bình 2,7 chồi/mảnh Số lượng mẫu tạo chồi trung bình ở lô chuyển gen 25 số chồi trung bình 2,62 chồi/mảnh Như vậy, có sự khác số lượng mảnh có cảm ứng môi trường chọn lọc, tỉ lệ tạo chồi khác không đáng kể lô chuyển gen lô không chuyển gen 3.1.2 Tạo rễ phát triển chuyể n gen hoàn chỉnh Tạo rễ khâu cuối nuôi cấy in vitro có ý nghĩa quan trọng đối với kỹ thuật chuyển gen ở thực vật Những nghiên cứu tái sinh chuyển gen thuốc ghi nhận IBA, NAA IAA hormone sinh trưởng được lựa chọn nghiên cứu tạo rễ bổ sung IBA 0,0001g/l Nồng độ chất điều khiển sinh trưởng dao động khoảng 0,1 mg/l Cụm chồi tuần tuổi có chiều cao 1cm được tách nhỏ chuyển sang môi trường tạo rễ Sau 4-5 tuần, quan sát thấy rễ xuất hiện ở hầu hết chồi (Hình 3.3 Bảng 3.3) Các chồi phát triển xanh tốt tạo nhiều mới Quan sát thấy chồi không chuyển gen môi trường đối chứng có trình tạo rễ tương tự Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 34 Hình 3.3 Hình ảnh tạo rễ môi trường kháng sinh chọn lọc Bảng 3.3 Kế t quả tạo rễ tái sinh thuốc ở thí nghiệm đối chứng Cấu trúc RNAi Số chồi tạo thành Số sống sót Số rễ Số bầu đất Số trồng nhà lưới pK7GW-CPi (SMV- 64 40 35 25 25 ĐC0 - - - - ĐC1 102 87 40 25 BYMV) 80 Bảng 3.3 cho thấ y với tổng số chồi ở lô thí nghiê ̣m thu đươ ̣c 40 số ng sót và có 35 rễ; bầ u 25 và đem trồ ng ta ̣i nhà lưới Ở lô đố i chứng có 87 số ng, 80 rễ, cho bầ u 40 và đem trồ ng 25 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 35 Những thuố c lá chuyể n gen trồ ng ở nhà lưới biểu hiện xanh tốt, mập mạp (Hình 3.4) Hin ̀ h 3.4 Các dòng thuốc lá chuyển gen ở thế ̣ T0 trồ ng châ ̣u nhà lưới 3.2 KẾT QUẢ PHÂN TÍ CH CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN 3.2.1 Kết kiểm tra cấ u trúc RNAi dòng thuốc chuyển gen Các dòng thuốc chuyển gen sau trồng nhà lưới được khoảng 3-4 tuần tiến hành thu tách chiế t DNA tổ ng số và thực hiện phản ứng PCR kiểm tra sự có mặt đoa ̣n gen chuyển CPi Từ mẫu non 21 dòng thuốc chuyển gen ở hệ T0 trồng nhà lưới sau - tuần DNA tổng số được tách chiế t điện di gel agarose 0,8%, kế t quả đươ ̣c thể hiê ̣n ở hiǹ h 3.5 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21  Hình 3.5 Kế t quả điện di kiể m tra DNA tổng số tách từ mẫu thuốc chuyể n gen (1-21: Băng DNA của 21 dòng thuốc chuyể n gen) Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 36 PCR đươ ̣c thực hiêṇ với cặp mồi đặc hiệu SMV-CPi-F/BYMV-CPi-R và kết điện di sản phẩm PCR gel agarose hình 3.6 cho thấy, tất 21 dòng dương tính với phản ứng PCR, băng điện di sản phẩm PCR thu được có kích thước khoảng 500 bp, tương tự kết ở mẫu đối chứng dương Kích thước hoàn toàn phù hợp với kích thước của cấ u trúc CPi (SMV-BYMV) Vì vậy, có thể khẳng định cấu trúc CPi (SMV-BYMV) được chuyển thành công vào thuốc giố ng C9-1 (+) (-) M 10 11 12 13 14 500 bp M 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 500 bp Hình 3.6 Kế t quả điện di kiể m tra sản phẩ m PCR nhân đoa ̣n CPi (SMVBYMV) từ 21 dòng thuốc chuyể n gen 1-21: 21 dòng thuốc chuyển gen; (+) Đối chứng dương plasmid pK7GW-CPi (SMV-BYMV); (-) Đối chứng âm sản phẩm PCR sử dụng khuôn DNA tách từ thuốc không chuyển gen; M: Marker 1kb (Thermo Scientific) 3.2.2 Phân tích khả kháng virus các dòng chuyển gen CPi (SMV-BYMV) điề u kiêṇ lây nhiễm nhân ta ̣o Để kiểm tra tính kháng virus khảm lá , 21 dòng thuốc chuyển gen dương tính với PCR 10 dòng đối chứng không chuyể n gen được lây nhiễm bằ ng dich ̣ chứ a SMV và BYMV qua ba lần, lần cách 15 ngày Sau lần lây nhiễm, dòng thuốc được quan sát sự biểu hiện bê ̣nh khảm Kế t quả đã xá c đinh ̣ đươ ̣c dòng thuố c lá kháng bê ̣nh, dòng nhiễm bê ̣nh và các đố i chứng không chuyể n gen Những đối chứng các dòng chuyể n gen nhiễm bệnh nhiễm hai loài SMV và Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 37 BYMV biể u hiêṇ có bị khảm và xoăn, còi cọc sinh trưởng Trong đó, dòng kháng hoàn toàn vẫn sinh trưởng phát triển bình thường, xanh tốt (Hình 3.7) Như vậy, phương pháp lây nhiễm nhân ta ̣o SMV và BYMV nguồn nhiễm bệnh khảm có thể áp dụng tốt để đánh giá khả kháng cho dòng thuốc chuyển cấu trúc CPi (SMVBYMV) T 05 WT1 T 012 WT2 T 019 WT3 Hin ̀ h 3.7 Hình ảnh mô ̣t số dòng thuố c lá chuyể n gen và đố i chứng T05, T012, T019- Dòng thuố c lá chuyể n gen; WT1, WT2, WT3- Cây thuố c lá không chuyể n gen Số lượng virus SMV các dòng thuốc chuyển gen chứa cấu trúc CPi (SMV-BYMV) không chuyển gen (WT) đươ ̣c kiể m tra bằ ng phản ứng Real time RT- PCR Sử du ̣ng của dòng thuốc chuyển gen triệu chứng bệnh là T05, T012; T019 thuốc không chuyển gen có triệu chứng bệnh nặng là WT1, WT2, WT3 ở lần lây nhiễm nhân tạo thứ làm vật liệu cho phản ứng Real time RT-PCR Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 38 RNA tổng số được tách từ 1g thuốc lá, sau sử dụng µg RNA tổng số cho phản ứng tổng hợp cDNA Đường chuẩn được xây dựng từ phản ứng có số lượng tế bào E coli mang vector pBT-SMV tái tổ hợp được xác định buồng đếm tế bào Hàm lượng DNA mẫu chuẩn có hàm lượng tương ứng là: 1000, 100 10 DNA/µl (1 tế bào tương ứng với sao) Phương trình đường chuẩn được dựng dựa phản ứng Real time RT- PCR với cặp mồi SMVqF/SMVqR, phương trình đường chuẩn tuyến tính để xác định số DNA theo chu kỳ ngưỡng được lập có dạng: Y= -168,15x + 4202,7 R2 = 0,898 Hình 3.8 Đồ thị khuếch đại đoa ̣n cDNA từ mẫu thuốc phân tích Real time RT-PCR Từ kết ở hình 3.8, số liệu chu kỳ ngưỡng phát hiện virus SMV lượng sao/1 g thuốc được trình bày ở bảng 3.4 Bảng 3.4 cho thấy, virus SMV có mặt ở mẫu thuốc chuyển gen không chuyển gen sau lây nhiễm virus nhân tạo Trong không chuyển gen số lượng SMV trung bình 810 cao 1,93 lần so với chuyển gen (trung bình 418,67 sao) Do sự hoạt động cấu trúc pK7GW-CPi (SMV-BYMV) có mặt hệ gen SMV bị phân Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 39 hủy theo RNAi số lượng SMV thuốc chuyển gen thấp Tuy nhiên, chuyển gen số lượng SMV khác nhau, dòng T01 có 386 sao, T02 lên tới 466 sao, T03 có 404 Như vậy, mức độ biể u hiê ̣n của tính kháng bệnh ở các dòng chuyể n gen có sự khác Kế t quả phân tích Real time PCR đã cho thấ y cấ u trúc RNAi CPi(SMV-BYMV) đã biể u hiê ̣n tăng cường tính kháng SMV ở các dòng thuố c lá chuyể n gen Bảng 3.4 Kết định lượng sự có mặt virus SMV thuốc chuyển gen Tên mẫu CP Số bản copy/1 g (-) 28.68 - WT1 20.66 729 WT2 19.66 897 WT3 20.21 804 T01 22.70 386 T02 22.22 466 T03 22.59 404 1x 19.52 1000 10x 23.21 100 100x 25.65 10 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN Trung bin ̀ h 810,00 418,67 http://www.lrc.tnu.edu.vn 40 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHI ̣ Kế t luâ ̣n 1.2 Cấu trúc RNAi pK7GW-SMV-BYMV-CPi đã đươ ̣c chuyể n thành công vào mô lá thuố c lá giống C9-1 thông qua lây nhiễm A tumefaciens 1.3 Phân tích các dòng thuố c lá chuyể n gen đã xác đinh ̣ đươ ̣c 21/21 dòng thuố c chuyể n gen ở thế ̣ T0 dương tiń h với phản ứng PCR 1.4 Các dòng thuốc chuyển gen và WT đã đươ ̣c lây nhiễm nhân ta ̣o virus khảm, kỹ thuâ ̣t Real time RT-PCR đã xác đinh ̣ đươ ̣c WT số lượng SMV cao 1,93 lần so với chuyển gen Như cấ u trúc CPi (SMV-BYMV) biểu hiện tăng cường tính kháng SMV ở các dòng thuốc lá chuyển gen Đề nghi ̣ Tiếp tu ̣c theo dõi, phân tích và đánh giá tính kháng với SMV của các dòng thuố c chuyể n gen ở các ̣ sau Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Vũ Thị Bản, Đào Đức Thức, Chu Hoàng Hà Nghiên cứu chọn tạo giống thuốc vàng sấy kháng bệnh virus TMV (bệnh khảm lá) Báo cáo khoa học 2007 Lê Trần Bình (2008), Phát triển trồng chuyển gen thực vật, Nxb Khoa học tự nhiên Công nghệ Nguyễn Liên Chi, Nguyễn Hữu Hồ, Nguyễn Văn Uyển, 1989 Chuyển gen kháng kanamycin vào mô thuốc (N.tabacum) mô cà úc vi khuẩn A.tumefaciens Tạp chí di truyền 1/1989 Ngô Thế Dân, Trần Đình Long, Trần Văn Lài, Đỗ Thị Dung, Phạm Thị Đào (1999), Cây đậu tương, Nxb Nông nghiệp Trần Quốc Dung, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ (2006), Công nghệ chuyển gen, Nxb Đại học Sư phạm, Huế Chu Hoàng Hà, Đỗ Xuân Đồng, Phạm Bích Ngọc, Lâm Đại Nhân, Lê Văn Sơn, Lê Trần Bình (2011), Nghiên cứu tạo giống đu đủ kháng bệnh đốm vòng ứng dụng chế RNAi Hội thảo quốc gia bệnh hại thực vật Việt Nam: 316 – 326 Chu Hoàng Hà, Nguyễn Minh Hùng, Bùi Chi Lăng, Lê Trần Bình (2004), Đánh giá tính đa dạng dòng virus gây bệnh đốm vòng đu đủ Việt Nam thông qua tách dòng, xác định so sánh trình tự gen mã hoá protein vỏ (CP)”, Tạp chí Công nghệ sinh học, 2(4):451-459 Vũ Triệu Mân (2003), Chẩn đoán nhanh bệnh hại thực vật, Nxb Nông nghiệp Vũ Triệu Mân (2007), Giáo trình Bệnh chuyên khoa Đại học Nông Nghiệp Hà Nội Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 42 10 Chu Hoàng Mậu, Phương pháp phân tích di truyền đại chọn giống trồng, NXB Đại học Thái Nguyên năm 2008 11 Lê Lương Tề, Vũ Triệu Mân (1999), Bệnh vi khuẩn bệnh virus hại trồng, Nxb Giáo dục 12 Nguyễn Đức Thành (2008), Chuyển gen thực vật, Nxb Khoa học tự nhiên Công nghệ 13 Lò Thị Mai Thu, Hoàng Hà, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà, Chu Hoàng Mậu (2014) Đặc điểm đoạn gen mã hóa coat protein phân lâ ̣p từ Soybean Mosaic Virus Tạp chí sinh học 36 (1se), tr 283-292 14 Lò Thị Mai Thu, Lê Hồ ng Trang, Chu Hoàng Hà, Chu Hoàng Mậu (2014) Nghiên cứu ta ̣o đậu tương chuyển gen kháng soybean mosaic virus và bean yellow mosaic virus Tạp chí khoa học & Công nghê ̣- Đại học Thái Nguyên, 115 (02), tr 111-115 15 Lê Đình Thụy, Phạm Kiến Nghiệp, 1996 Trồng chế biên thuốc NXB T/p Hô Chí Minh 16 Đỗ Năng Vịnh (2007) Công nghệ can thiệp RNAi (RNAi) gây bất hoạt gen tiềm ứng dụng to lớn Tạp chí Công nghệ Sinh học 5(3): 265275 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 17 Afanasiev M M., Morris H E (1952), “Bean Virus (yellow) on Great Northern bean in Montana”, Phytopathology, 42, pp 101-104 18 Atreya, C.D., Raccah, B., and Pirone, T.P 1990 A point mutation in the coat protein abolishes aphid transmissibility of a potyvirus Virology 178: 161-165 19 Atreya, P.L., Atreya, C.D., and Pirone, T.P 1991 Amino acid substitution in the coat protein result in loss of insect transmissibility of a plant virus Proc Natl Acad Sci USA 88:7887-7891 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 43 20 Atreya, P.L., Lopez-Moya, J J., Chu, M Atreya, C.D., and Pirone, T.P 1995 Mutational analysis of the coat protein N-terminal amino acids involved in potyvirus transmis sion J Gen Virol 76:265-270 21 Arya M., Shergill I.S., Williamson M., Gommersall, l.,Arya N., Patel H.R.H 2005 Basic principles of real – time quantitative PCR Expert Rev Mol Diagn.,5:1-11 22 Baulcombe D (2004) RNA silencing in plants Nature 431(7006) : 356-63 23 Bubner B., Gase K., Baldwin I T (2004), “Two - fold differences are the detection limit for determining transgene copy numbers in plants by real - time PCR”, BMC Biotechnology, 4, pp 4-14 24 Bustin S.A., Nolan T.2004 Pìfalls of quantitative real – time Reversetranscription Polymerase Chain Reaction Joiurnal of Biomolecular Techniques 15:155-166 25 Brunt A A., Crabtree K., Dallwitz M J., Gibbs A J., Watson L., Zurcher E J (2003), Plant Viruses Online, Descriptions and Lists from the VIDE Database Version: 20th August 1996 26 Chicas., Macino, 2001 Charateristics of post- transcriptionnal gene silencing EMBO (11): 992-6 27 Dahmer M L., Hildebrand D F., Collin, G B (1992), “Comparative protein accumulation patterns in soybean somatic and zygotic embryos”, In Vitro Cell Dev Biol, 28, pp 106–114 28 DeCleene M., DeLey J (1976), “The host range of crown gall”, Bot Rev pp 389–466 29 Di Nicola-Negri E, Brunetti A, Tavazza M, Ilardi V (2005) Hairpin RNA-mediated silencing of Plum pox virus P1 and HC-Pro genes for efficient and predictable resistance to the virus.Transgenic Res 14(6): 98994 coat protein, partial cds, isolate: OK2”, Plant Virology 30 Gal-On, A., Antignus, Y., Rosner, A., Raccah, B 1992 A zucchini yellow mosaic virus coat protein gene mutations restores aphid Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 44 transmissibilty but has no effect on multiplication J Gen Virol 73:21832187 31 Gibbs A., Harrison B.(1976), Plant virology the principles, Edward Amold 32 Gough K H., Shukla D D (1992), “Major sequence variations in the N - terminal region of the capsid protein of a severe strain of passion fruit woodiness potyvirus”, Arch Virol., 124, pp 389-396 33 Hartman G L., Sinclair J B., Rupe J C (1999), “Compendium of Soybean Diseases, Fourth Edition”, The American Phytopathological Society Press, Minnesota, USA 34 Hartman G L., West E D., Herman, T K (2011), “Crops that feed the World Soybean-worldwide production, use and constraints caused by pathogens and pests”, Food Sec., 3, pp 5–17 35 Hill J., Bailey T B., Benner H I., Tachibana H., Durand D P (1987), “Soybean mosaic virus: Effects of primary disease incidence on yield and seed quality”, Plant Disease, 71, pp 237-239 36 Hill J H (1999), Soybean mosaic virus In Compendium of Soybean Diseases, 4th edn, pp 70–71, Edited by G L Hartman J B Sinclair & J C Rupe St Paul, MN: American Phytopathological Society 37 Hunt M.Real-time PCR Microbiology and Immunology On-line 38 Jayaram, Ch., Hill, J.H., and Miller, W.A 1992 Complete nucleotide sequences of two soybean mosaic virus strains differentiated by response of soybean containing the Rsv resistance gene J Gen Virol 73:2067-2077 39 Jayaram, Ch., Hill, J.H., Miller, W.A 1991 Nucleotide sequences of the coat protein genes of two aphid-transmissible strains of soybean mosaic virus J Gen Virol 72:1001-1003 40 Jimenez V M (2001), “Regulation of in vitro somatic embryogenesis with emphasis on the role of endogenous hormones”, Rev, Bras Fisiol Veg., 13, pp 196-223 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 45 41 Kirichenko A N (2013), “The characterization of bean yellow mosaic virus isolated from soybean”, Mikrobiol Z., 75 (3), pp 68-73 42 Lo Thi Mai Thu, Le Van Son, Chu Hoang Ha, Chu Hoang Mau (2014) Designing an RNA interference structure aims at creating transgenic soybean plants resistant to both Soybean Mosaic Virus (SMV) and Bean Yellow Mosaic Virus (BYMV) in Vietnam International Journal of Bioscience, Biochemistry and Bioinformatics (IJBBB), (3), pp 43 Pradeep K., Satya V K., Selvapriya M., Vijayasamundeeswari A., Ladhalakshmi D., Paranidharan V., Rabindran R., Samiyappan R., Balasubramanian P., Velazhahan R (2012), “Engineering resistance against Tobacco streak virus (TSV) in sunflower and tobacco using RNA interference”, Biologia Plantarum, 56 (4), pp 735-741 44 Saghai M M A., Soliman K M., Jorgensen R A., Allard R W., (1984), “Ribosomal DNA spacer - length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location and population dymnamics”, Proc Natl Acad Sci USA, 81, pp 8014-8018 45 Selvaraj T., Nisha M C., Rajeshkumar S (2009), “Effect of indigenous arbuscular mycorrhizal fungi on some growth parameters and phytochemical constituents of Pogostemon patchouli Pellet”, Maejo international journal of science and technology, (1), pp 222-234 46 Smith NA, Singh SP, Wang MB, Stoutjesdijl PA, Green AG, Waterhouse PM(2000)Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs Nature, 407, pp 319-323 47 Shukla D D., Ward C W (1988), “Amino acid sequence homology of coat proteins as a basis for identification and classification of the potyvirus group”, J Gen Virol., 69, pp 2703-2710 48 Shukla D D., Ward C W., Brunt, A A (1994), The Potyviridae, CAB International, University Press, Cambridge, UK Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 46 49 Somers D.A., Samac D.A., Olhoft P.M., (2003), “Recent advances in legume transformation”, Plant Physiol, 131, pp 892-899 50 Sun ZN, Yin GH, Song YZ, An HL, Zhu CX, Wen FJ (2010) Bacterially Expressed Double-Stranded RNAs against Hot-Spot Sequences of Tobacco Mosaic Virus or Potato Virus Y Genome Have Different Ability to Protect Tobacco from Viral Infection Appl Biochem Biotechnol Epub ahead of print 51 Topping JF (1998) Tobacco transformation, Methods of Mol Biol, 81: 365 – 372 52 Vanderveken J J., Harris K F.,Maramorosch K (1977), Oils and other inhibitors of nonpersistent virus transmission, In Aphids as Virus Vectors Academic Press, London, pp 435-454 53 Waterhouse PM, Graham MW, Wang MB (1998) Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA Proc Natl Acad Sci USA 95(23):13959-64 54 Won S L, Yul H K., Kook H K (2003), “Complete Genome Sequences of the Genomic RNA of Soybean mosaic virus Strains G7H and G5”, Plant Pathol., 19 (3), pp 171-176 55 Yan P Q., Bai X Q., Wan X Q., Guo Z K., Li L J., Gong H Y., Chu C C (2007), “Expression of TMV coat protein gene RNAi in transgenic tobacco plants confer immunity to tobacco mosaic virus infection”, Yi Chuan, 29 (8), pp 1018-22 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 47 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ... thuật RNAi Xuất phát từ sở lựa chọn tiến hành Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn đề tài: Nghiên cứu tạo dòng thuốc chuyển gen mang cấu trúc RNAi kháng đồng thời SMV BYMV ... BYMV Mục tiêu nghiên cứu Tạo được dòng chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả kháng virus gây bê ̣nh khảm từ giống thuốc C9-1 Nội dung nghiên cứu (1) Nghiên cứu tạo thuốc chuyển gen bằ ng kỹ... chuyển cấu trúc RNAi vào thuốc đánh giá tính kháng đối với hai loài SMV, BYMV thuốc chuyển gen sở để thực hiện mục tiêu tạo đậu tương chuyển gen kháng đồng thời hai loài SMV BYMV theo nguyên