Nghiên cứu tạo dòng thuốc lá (nicotiana tabacum l ) mang gen GmDREB2 phận lập từ cây đậu tương

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG THUỐC LÁ (NICOTIANA TABACUM L.) MANG GEN GmDREB2 PHẬN LẬP TỪ CÂY ĐẬU TƯƠNG Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.01.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS.Vũ Thị Thu Thuỷ Thái Nguyên, năm 2015 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn công trình nghiên cứu hướng dẫn TS Vũ Thị Thu Thủy, giúp đỡ thầy cô giáo, cán Bộ môn Di truyền & Sinh học đại Khoa Sinh học– Trường Đại học Sư phạm- Đại học Thái Nguyên Các số liệu nêu luận văn trung thực Các kết chưa công bố công trình khác Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm số liệu luận án Thái Nguyên, tháng 11 năm 2015 Tác giả Nguyễn Thị Phương Thảo XÁC NHẬN XÁC NHẬN CỦA KHOA CHUYÊN MÔN CỦA NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS Vũ Thị Thu Thủy Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN i http://www.lrc.tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Vũ Thị Thu Thủy định hướng khoa học, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện tốt suốt trình tiến hành nghiên cứu hoàn thành luận văn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS Chu Hoàng Mậu tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện để hoàn thành Bản luận văn thạc sĩ Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô, cán Bộ môn Di truyền & Sinh học đại, khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên; xin cảm ơn chị Trần Thị Hồng - KTV phòng Công nghệ tế bào thực vật, tạo điều kiện giúp đỡ trình học tập, thực thí nghiệm đề tài Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn tới bạn bè toàn thể gia đình động viên, khuyến khích, giúp đỡ tôi, quan tâm chỗ dựa cho suốt trình học tập hoàn thành luận văn Thái Nguyên, tháng 11 năm 2015 Tác giả Nguyễn Thị Phương Thảo Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN ii http://www.lrc.tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt iv Danh mục bảng v Danh mục hình vi MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây thuốc hệ thống tái sinh thuốc 1.1.1 Cây thuốc 1.1.2 Hệ thống tái sinh chuyển gen thuốc 1.2 Tính chịu hạn gen liên quan đến tính chịu hạn thực vật 1.2.1 Hạn tác hại hạn lên thực vật 1.2.2 Đặc tính chịu hạn thực vật 1.2.3 Gen liên quan đến tính chịu hạn 10 1.2.4 Gen DREB gen DREB2 12 1.3 Phương pháp tạo trồng chuyển gen 18 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Vâ ̣t liê ̣u hoá chấ t và thiế t bi 26 ̣ 2.1.1 Vật liệu 26 2.1.2 Hóa chất 26 2.1.3 Thiết bị 26 2.1.4 Điạ điể m nghiên cứu 26 2.2 Phương pháp nghiên cứu 27 2.2.1 Phương pháp tạo nguyên liệu biến nạp 27 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN iii http://www.lrc.tnu.edu.vn 2.2.2 Phương pháp chuyển gen vào thuốc thông qua A tumefaciens 27 2.2.3 Phân tích có mặt cấu trúc mang gen GmDREB2 phương pháp PCR 29 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Kết tạo nguyên liệu biến nạp 32 3.2 Kế t quả chuyể n vector mang cấu trúc GmDREB2 vào thuố c lá 33 3.2.1 Đồng nuôi cấy với dung dịch A tumefaciens cảm ứng tạo cu ̣m chồi 34 3.2.2 Tạo rễ chuyển môi trường tự nhiên 37 3.3 Kết kiểm tra có mặt gen chuyển dòng thuốc chuyển gen kỹ thuật PCR 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHI ̣ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 PHỤ LỤC Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN iv http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT ABA Abscisic acid AS Acetosyringone A.tumefacines Agrobacterium tumefacines BAP 6-Benzyl Amino Purine bp Base pair (cặp base) DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP Deoxynucleic triphosphate DREB Dehydration Responsive Binding protein ĐC Đối chứng EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetate Acid IAA Indoleacetic acid IBA Indole-3 butyric acid LB Luira and Bertani LEA Late Embryogenesis Abundant MS Môi trường theo Murashige Skoog (1962) PCR Polymerase chain reaction RM Môi trường rễ TAE Tris Acetate EDTA Taq Thermus aquaticus Ti-plasmid Plasmid tạo khối u Vir Virulence region Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN iv http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1 Thành phần dung dịch đệm chiết DNA tổng số 29 Bảng 2.2 Trình tự nucleotide của că ̣p mồ i PCR khuế ch đa ̣i đoa ̣n GmDREB2 30 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen GmDREB2 31 Bảng 2.4 Chu trình nhiệt cho phản ứng nhân gen GmDREB2 31 Bảng 3.1 Kết cảm ứng chồi từ mảnh thuốc 36 Bảng 3.2 Kế t quả tạo rễ tái sinh thuốc thí nghiệm đối chứng 38 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN v http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Cây thuốc giai đoạn trưởng thành giai đoạn hoa Hình 1.2 Cấu trúc Ti - Plasmid 22 Hình 1.3 Mô hình chuyển gen gián tiếp nhờ A tumefaciens 23 Hình 3.1 Tạo nguyên liệu biến nạp 32 Hình 3.2 Vùng T-DNA vector pBI121 - GmDREB2 33 Hình 3.3 Hình ảnh nhiễm khuẩn mẫu đồng nuôi cấy 35 Hình 3.5 Hình ảnh tạo rễ môi trường kháng sinh chọn lọc 38 Hình 3.6 Các dòng thuốc lá chuyển gen ở thế ̣ T0 trồ ng châ ̣u nhà lưới 39 Hình 3.7 Kế t quả điện di kiể m tra sản phẩ m PCR nhân đoa ̣n GmDREB2 từ 17 dòng thuốc chuyể n gen 40 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN vi http://www.lrc.tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Một tượng thay đổi môi trường ảnh hưởng tới sinh trưởng phát triển thực vật tình trạng hạn Hạn hán có ảnh hưởng xấu mức độ khác suốt trình hay giai đoạn sống thể thực vật dẫn đến làm giảm suất trồng, chậm phát triển gây chết Hiện giới diện tích đất nông nghiệp bị hạn hán ngày tăng Ở Việt Nam tình trạng hạn hán trở nên báo động năm 2015, diện tích đất nông nghiệp nước để sản xuất tăng cao Khả chịu hạn thực vật tính trạng nhiều gen quy định Hiện nay, người ta chưa tìm gen cụ thể thực định tính chịu hạn, mà xác định gen liên quan đến tính chịu hạn thực vật Nhiều trình tự gen liên quan đến tính chịu hạn đậu tương công bố Ngân hàng gen Quốc tế, có gen DREB DREB (Dehydration Responsive Element Binding) họ gen sản xuất protein kích hoạt nhóm gen liên quan đến tính chịu hạn thực vật Việc nghiên cứu gen DREB2 liên quan đến tính chịu hạn cho thấy nhóm gen đa dạng cấu trúc, chức tác giả khuyến cáo cần tiếp tục mở rộng nghiên cứu Hiện nay, nhờ tiến kỹ thuật di truyền mà người ta tạo giống trồng có khả chịu hạn cách lai giống, đột biến thực nghiệm, công nghệ tế bào, chuyển gen Chọn tạo giống trồng thực nhiều phương pháp khác chọn dòng biến dị soma, lai giống, gây đột biến thực nghiệm, sử dụng công nghệ tế bào chuyển gen Đã có nhiều giống trồng chọn tạo giống lúa chịu hạn tác giả Đinh Thị Phòng [17], dòng lúa chịu nóng Nguyễn Thị Tâm [19] Các dòng lạc chịu hạn tạo cách gây đột biến Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn thực nghiệm- tác giả Vũ Thị Thu Thủy [23] Chuyển gen kỹ thuật cho phép đưa hay số gen định vào hệ gen chủ quan tâm để tạo trồng biến đổi gen nhằm cải thiện số đặc tính hay tính trạng theo hướng có lợi cho người Chuyển gen hướng nghiên cứu có nhiều triển vọng, tiến hành thực nghiệm nhiều giống trồng như: cà chua, lúa, ngô, đậu tương áp dụng nhiều nước giới Trong chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefacines (A.tumefacines) tỏ ưu cá kỹ thuật chuyển gen khác tốn kém, quy trình đơn giản, nhanh chóng, dễ áp dụng nhiều đối tượng trồng Do hệ thống tái sinh thuốc tương đối đơn giản thời gian phân hóa từ mô thành hoàn chỉnh ngắn nên nghiên cứu chuyển gen nhà khoa học thường chọn thuốc làm mô hình Xuất phát từ sở lựa chọn tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tạo dòng thuốc (Nicotiana tabacum L.) mang gen GmDREB2 phận lập từ đậu tương” Mục tiêu nghiên cứu Tạo dòng thuốc chuyển gen mang gen GmDREB2 phân lập từ đậu tương Nội dung nghiên cứu (1) Nghiên cứu tạo nguyên liệu biến nạp từ thuốc giống K326 (2) Nghiên cứu lây nhiễm A tumefaciens mang vector chuyển gen vào mảnh thuốc Tái sinh in vitro, chọn lọc tạo dòng thuốc chuyển gen (3) Phân tích có mặt gen chuyển dòng chuyển gen hệ T0 kỹ thuật PCR Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn PCR cho phép nhân số lượng lớn nguyên đoạn DNA thời gian ngắn Đây phương pháp thường dùng phân tích dòng thời gian thực nhanh, cần khuếch đại trình tự đáng quan tâm Thực đơn giản tốn Theo lý thuyết ta cung cấp cặp mồi đặc hiệu nhân xác đoạn gen nằm hai mồi Khi tiến hành PCR DNA tách từ chuyển gen cho kết đặc hiệu với cặp mồi ta kết luận mang đoạn gen cần chuyển Các dòng thuốc chuyển gen sau trồng nhà lưới khoảng 3-4 tuần tiến hành thu tách chiết DNA tổng số và thực phản ứng PCR kiểm tra có mặt đoa ̣n gen chuyển GmDREB2 PCR đươ ̣c thực hiêṇ với cặp mồi đặc hiệu GmDREB2 soyF/GmDREB2 soyR và kết điện di sản phẩm PCR gel agarose hình 3.7 cho thấy M (-) WT (+) 10 11 12 13 17 0,5kb 0,48kb Hình 3.7 Kế t quả điện di kiể m tra sản phẩ m PCR nhân đoa ̣n GmDREB2 từ 17 dòng thuốc chuyể n gen 1-17: 17 dòng thuốc chuyển gen; (+) Đối chứng dương plasmid pBI121/GmDreb2 ; (-) Đối chứng âm sản phẩm PCR sử dụng khuôn DNA tách từ thuốc không chuyển gen; M: Marker 1kb (Thermo Scientific) Có 11/17 dòng thuốc (64,7%) cho băng điện di sản phẩm PCR thu có kích thước khoảng gần 500 bp, tương tự kết mẫu đối chứng dương Kích thước hoàn toàn phù hợp với kích thước của cấ u trúc GmDREB2 Sáu dòng lại không cho băng dự kiến Vì vậy, khẳng định vector pBI121- GmDREB2 chuyển thành công vào thuốc giố ng K326 11/17 dòng thuốc Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN 40 http://www.lrc.tnu.edu.vn Gen ngoại lai biến nạp vào tế bào tồn tế bào chủ trạng thái: (1) Tạm thời dạng DNA tự do; (2) tồn lâu dài dạng thể plasmid độc lập tự nhân; (3) tồn ổn định đoạn DNA hệ gen tế bào chủ nhân lên theo dạng tương hợp hay không tương hợp Kết dương tính với PCR bước đầu giúp đầu kiểm tra xem gen chuyển vào hay không Tuy nhiên, PCR dương tính chưa thể khẳng định xem gen có hoạt động tồn qua nhiều hệ hay không [21] Chin ́ h vì vâ ̣y đã có nhiều cách giải thích tồn DNA mẫu phân tích, đó là: (i) Vi khuẩn A tumefaciens mang gen tồn khối mô hay gian bào mẫu phân tích Hiện tượng xuất nhiều đối tượng Nếu mẫu phân tích thực vật qua nhân giống hữu tính, tức qua hệ T1, T2 dạng hạt, thì khả hoàn toàn bi ̣ loại trừ; (ii) Gen chuyển tồn tự tế bào chất, biến qua sinh sản hữu tính; (iii) Gen chuyển không hoạt động, tức không biểu thành protein có chức sinh học [21] Xuấ t phát từ những khả trên, để khẳ ng đinh ̣ gen chuyể n tồ n ta ̣i, di truyền và biể u ở các thế ̣ cầ n phải tiế p tu ̣c phân tić h có mă ̣t của cấu trúc GmDREB2 ở các hệ T1, T2 , đánh giá mức đô ̣ biể u và ổ n đinh ̣ tính kháng virus ở thế ̣ đó Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN 41 http://www.lrc.tnu.edu.vn KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kế t luâ ̣n 1.1 Giống thuốc K326 nuôi cấy in vitro tạo đủ nguyên liệu, có chất lượng tốt phục vụ thí nghiệm biến nạp vector pBI121- GmDREB2 1.2 Cấ u trúc pBI121- GmDREB2 chuyển thành công vào mô lá thuố c lá giố ng K326 thông qua lây nhiễm A tumefaciens 1.3 Phân tích dòng thuố c lá chuyể n gen đã xác đinh ̣ đươ ̣c 11/17 dòng thuố c chuyể n gen ở thế hệ T0 dương tính với phản ứng PCR Đề nghi ̣ Tiếp tục theo dõi, phân tích và đánh giá khả chịu hạn của các dòng thuố c chuyể n gen các ̣ sau Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN 42 http://www.lrc.tnu.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, tr30-32 Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi lúa, Nxb Đại học Quốc gia, Hà Nội Nguyễn Liên Chi, Nguyễn Hữu Hồ, Nguyễn Văn Uyển (1989), "Chyển gen kháng kanamycine vào mô thuốc (N.tabacum) mô cà úc vi khuẩn A.tumefacines", Tạp chí Di truyền 1/1989 Nguyễn Hữu Cường, Nguyễn Thị Kim Anh, Đinh Thị Phòng, Lê Thị Muội, Lê Trần Bình(2003), Mối tương quan hàm lượng proline tính chống chịu lúa , Tạp chí Công nghệ sinh học 1(1), tr 85-95 Trần Kim Đồng, Nguyễn Quang Phổ, Lê Thị Hoa (1991), Giáo trình sinh lý trồng, Nxb Giáo dục Nguyễn Thu Hiền (2014), Nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein bề mặt virus H5N1 vào đậu tương phục vụ sản xuất vaccine thực vật", Luận án tiến sĩ sinh học- Đại học Thái Nguyên Nguyễn Huy Hoàng, Vũ Thị Như Trang (2012), Thiết kế vector mang gen HA1 virus H5N1 sử dụng chuyển gen thông qua vi khuẩn A.rhizogene Tạp chí khoa học công nghệ, Đại học Thái Nguyên, Tập 89, tr 147- 151 Nguyễn Thị Thúy Hường (2011), Phân lập tạo đột biến điểm gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn thực nghiệm chuyển vào đậu tương Việt Nam, Luận án tiến sĩ sinh học- Đại học Thái Nguyên Khuất Hữu Khanh (2006), Kỹ thuật gen nguyên lý ứng dụng Nxb Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr 56 - 57 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN 43 http://www.lrc.tnu.edu.vn 10 Ngô Thị Liêm, Chu Hoàng Mậu (2006), Đặc điểm phản ứng giống lạc điều kiện hạn sinh lý, Tạp chí Nông nghiệp phát triển nông thôn, (84), tr 82 - 87 11 Trần Thị Phương Liên (1999), Nghiên cứu đặc tính hóa sinh sinh học phân tử số giống đậu tương có khả chịu nóng, chịu hạn Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, tr 18 - 36 12 Trần Thị Phương Liên (2010), Protein tính chống chịu thực vật, NXB Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Hà Nội 13 Trần Thị Phương Liên, Nông Văn Hải (2005), Protein dự trữ protease hạt trồng, Tạp chí Công nghệ sinh học, 3(4), tr 37 - 45 14 Trần Thị Phương Liên, Lê Thị Muội (2004), Nghiên cứu thành phần đường tan chọn giống đậu tương Báo cáo khoa học - Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống, Nxb Khoa học kỹ thuật, tr 473, 475 15 Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Vân Anh (2005), Khảo sát chất lượng hạt khả chịu hạn số giống lúa cạn địa phương vùng núi phía Bắc , Tạp chí Nông nghiệp phát triển nông thôn, (17) tr 19 - 23 16 Nguyễn Thị Thu Ngà (2014), Nghiên cứu phân lập chuyển gen NAC2 liên quan đến tính chịu hạn lạc (Arachis hypogaea L), Luận án tiến sĩ sinh học, Đại học Thái Nguyên 17 Đinh Thị Phòng (2001), Nghiên cứu khả chịu hạn chọn dòng chịu hạn lúa công nghệ tế bào thực vật, Luận án tiến sĩ sinh học, Viện công nghệ sinh học, Hà Nội 18 Lò Thanh Sơn (2015), Nghiên cứu đặc điểm chuyển gen GmEXP1 liên quan đến phát triển rễ đậu tương, Luận án tiến sĩ sinh học, Đại học Thái Nguyên 19 Nguyễn Thị Tâm (2004), Nghiên cứu khả chịu nóng chọn dòng chịu nóng lúa công nghệ tế bào thực vật, Luận án tiến sĩ sinh học - Viện công nghệ sinh học, Hà Nội Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN 44 http://www.lrc.tnu.edu.vn 20 Nguyễn Quang Thạch (chủ biên), Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2005), Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp, Nxb Nông nghiệp - Hà Nội 21 Nguyễn Đức Thành (2003), Chuyển gen thực vật, Nxb Khoa học kỹ thuật, tr 28 - 29 22 Bùi Thị Thu Thủy, Nguyễn Thị Tâm, Nguyễn Mạnh Quỳnh (2006), Ảnh hưởng hạn sinh lý đến số tiêu hóa sinh hạt nảy mầm số giống lúa, Tạp chí Nông nghiệp phát triển nông thôn, 12(2), tr 29 - 33 23 Vũ Thị Thu Thủy (2011), Tạo dòng chịu hạn phân lập gen cystatin liên quan đến tính chịu hạn lạc (Arachis hypogaea L.), Luận án tiến sĩ sinh học- Đại học Thái Nguyên 24 Phan Hữu Tôn (2004), Giáo trình Công nghệ sinh học chọn tạo giống trồng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội 25 Phạm Thị Vân, Nguyễn Minh Hùng, Hà Viết Cường, Lê Văn Sơn, Lê Trần Bình, Chu Hoàng Hà (2009), Tạo thuốc kháng virus TMV kĩ thuật RNAi, Hội thảo Quốc gia Bệnh hại Thực vật Việt Nam, 25 -26/7 Viện Nghiên cứu Bông phát triển NN, Nha Hồ - Ninh Thuận, tr 32-40 26 Phạm Thị Vân, Nguyễn Văn Bắc, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình (2008), Tạo thuốc kháng bệnh virus khảm dưa chuột kỹ thuật RNAi, Tạp chí Công nghệ sinh học 6(4A), 679- 687 27 Vũ Văn Vụ (1999), Sinh lý thực vật ứng dụng, Nxb Đại học quốc gia Hà Nội (148 trang) 28 Vũ Văn Vụ , Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn (1997), Sinh lý học thực vật, Nxb Giáo dục, Hà Nội, tr 125- 224 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN 45 http://www.lrc.tnu.edu.vn Tiếng Anh 29 Abe H., Shinozaki Y., Urao T., Hosokawa D., Shinozaki K (2008), "Role of Arabidopsis MYC and MYB Homologs in Drought- and Abscisic Acid- Regulated Gene Expression", The Plant cell, 9(10), pp 1859-1868 30 Akasaka Y., Hiroyuki.,Masashiro M (2000), Improved plant regeneration from cultured leaf segments in peanut ( Arachis hypogaea L.) by limited exposure to thidiazuron , Plant Sci, 156, pp: 169-175 31 Banerjee A.K., Part S., Hannapel D.J (2006), Eficinent prodution of transgenic potato ( S.tuberosum L.ssp.andigena) plants via Agrobacterium tumefacines - mediated transformation, Plant Science, 170, pp.732 - 738 32 Bray E.A (1993), Molecular responses to water deficit, Plant Physital, 103: 1035 - 1040 33 Cao Xin-You, You-Zhi M., (2008), Isolation and identification of a GmGβ1 Interacting Protein with GmDREB5 Protein in Soybean (Glycine max), Acta agronomica sinica, 34 (10): 1688-1695 34 Cortés A.J., This D, Chararro C., Madrinan S, Blair MW (2012), Nucleotide ediversity patterns at the drought - related DREB2 encoding genes in wild and cultivated common bean ( Phaseolus vulgaric L.), Thear Appl Genet, 125(5): 1069- 85 35 Charlson D.V., Korth K.L., Purcell L.C., (2009), Allantoate amidohydrolase transcript expression is independent of drought tolerance in soybean, J Exp Bot., 60: 847-851 36 Chen M., Wang Q.Y., Xu Z.S., Li L.C., Ye X.G., Xia L.Q, Ma Y.Z., (2007), GmDREB2, a soybean DRE – binding transcription factor, conferred droungt and high – salt tolerance in transgenic plants, Biochem Biophys Res Commun, 353(2): 299 – 305 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN 46 http://www.lrc.tnu.edu.vn 37 Chen Y., Chen P., and de los Reyes B.G (2004), Analysis of the expression of DREB1 gene orthogogs in cultivated and wild specises of soybean, NCBI, GenBank, Accession AY802779 38 Clarson D.V., Hu X., Okimoto B., Purcell L.C., (2009), Glycine max cultivar Jackson drought responsive element binding, NCBI, accession FJ965342 39 Diaz-Martin J., Almoguera C., Prieto-Dapena P., Espinosa J.M., Jordano J., (2005), Functional interaction between two transcription factors involved in the developmental regulation of a small Heat stress Protein promoter, Plant Physiol, 139(3): 1483-1494 40 Dramé K.N., Clavel D., Repellin A., Passaquet C., Zuily - Fodil Y (2007), Water deficicit induces variation in expression of stress - responsive genes in two peanut ( Arachis hypogaea L.) cultivars with diffierent to lerance to drough, Plant Physiol Biochem 45 (3-4): 236 - 243 41 Dubouzet J.G., Sakuma Y., Ito Y., Kasuga M., Dubouzet E.G., Miura S., Seki M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K., (2003), OsDREB genes in rice, Oryza sativa L., encode transcription activators that function in drought-, high-salt- and cold-responsive gene expression, Plant J., 33(4):751-63 42 Ernst H.A (2004), "Structure of the conserved domain of ANAC, a member of the NAC family of transcription factors", EMBO Rep., 5, pp 43 FAO/WHO (1990) Expert consultation on protein quality evaluation Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome 44 Fujita Y., Fujita M., Satoh R., Maruyama K., Mohammad M., Seki M., Shinozaki K., Shinozaki K (2005), " AREB1 Is a Transcription Activator of Novel ABRE-Dependent ABA Signaling That Enhances Drought Stress Tolerance in Arabidopsis", The Plant Cell, 17, pp 34703488 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN 47 http://www.lrc.tnu.edu.vn 45 Goyal K., Walton L.J., Tunnacliffe A (2005), LEA proteins prevent pritein aggregation due to water strees, Biochem Journal 388(1): 151 - 157 46 Guerrini G.I, Trihueiro R.M., Leite R.M., Wilcken C.F., Velini E.D., Mori E.S., Furtado E.L., Marino C.L., Maia I.G (2005), Eucalyptus EST involved in the production of 9-cis epoxycarotenoid dioxygenase, a regulatory enzyme of abscisic acid production, Genet Mol Biol, 28 (3): 640-643 47 Hanif M.(2004), Chracterization of small GTPase Cdc42 from the ectomycorrhizal fungus Suillus bovinus and Agrobacterium tumefaciensmediated transformation of fungi, University of Helsinki 48 Hong Y., Zhing S., Wang X., (2008), Dual functions of phospholipase Dα1 in plant response to drought, Mol Plant 1, 262- 269 49 Ishida T., Aida M., Takada M., (2000), In-volvement of CUP-SHAPED COTYLEDON genes om gy-noecium and ovule development in Aradopsis thaliana, Plant Cell Physiol, 41: 60-67 50 Javad K.A., Sasan M., Hassan M., (2009), Isolation and Characterization of Partial DREB Gene from four Iranian, Triticum aestivum Cultivars World Journal of Agricultural Sciences, 5(5): 561-566 51 Khalafalla, M.M., S.M.Rahman, H.A.El - Shemy, Y.Nakamoto, K.Wakasa and M.Ishimoto (2005) Optimization of praticle bombardment conditions by monitoring of transient sGFP(S65T) expression in transformed soybean Breed Sci 55: pp 257 - 263 52 Li X.P., Tian A.G., Luo G.Z., Gong Z.Z., Zhang J.S., Chen S.Y., (2005), Soybean DRE-binding transcription factors that are responsive to abiotic stresses, Theor Appl Genet, 110(8): 1355-1362 53 Liu W (2010), Clone of resvertrol synthesis gene from peanut, Accession: FM955403, FM955401, FM955398 54 Liu L.Q., Zhu K., Yang Y.F., Wu J., Yu D.Y., Chen F.D., (2007), Molecular cloning, expressional profiling and trans-activation property Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN 48 http://www.lrc.tnu.edu.vn studies of a DREB2-like gene from Chrysanthemum (Dendranthema vestitum), Chrysanthemum vestitum DREB2-like protein (DREB2A) mRNA, complete cds, NCBI, Accession EF633987 55 Liu M., Wang N., Ma Y.Z., Cheng X.G., Glycine max dehydration responsive element-binding protein 3(DREB3) mRNA, complete cds, ACCESSION DQ055133 56 Liu Q., Sakuma Y., Abe H., Kasuga M., Miura S., Yamaguchi- Shinozai K., Shinozaki K., (1998), Two transcription factors, DREB1 and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain, separate two cellular singnal transduction pathways in drought and low temperature responsive gene expression, respectively, in Arabidopsis, Plant Cell, 10: 1391-1406 57 Liu W., Feng F., (2008), Cloning and functional analysis of DREB transcription factors in Nictotiana tabacum, Nicotiana tabacum DREB4 mRNA, complete cds, NCBI, Accession EU727158 58 Long S DNA Rebagliati M (2002), Sensitive two - color whole - mount in situ hybridizations using digoxygenin - DNA dinitrophenol - labeled RNA probes Bio Techniques 32: pp 494 - 500 59 Lopez S.J., Kumar R.R., Pius P.K., Muraleedharan N (2004), Agrobacterium tumefaciens - mediated genetic transformation in Tea ( Camellia sinensis [L] O Kuntze) Plant molecular biology reporter 22: pp 201a- 201j 60 Mattews P.R., Wang M.B., Waterhouse P.M., Thornton S., Fieg S.J., Gubler F., Jacobsen J.V (2001), Marker gene elimination from transgenic barley, using co- transformation with adjacent twin T- DNAs on stDNAard Agrobacterium transformation vector Mol Breed 7: pp 195- 202 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN 49 http://www.lrc.tnu.edu.vn 61 Maughan, P.J., R.Philip, M-J Cho, J.M Widholm and L.O Vodkin (1999) Biolistic transformation expression, and inheritance of bovene ß-casein in soybean ( Glycine max In Vitro Cell Biol Plant 35: pp.344 - 349 62 Murashige T and Skoog F (1962), Arivised medium for rapid growth and bioassays with tobaceo tissiee- culture, Physiology Planta, 15: 473 - 497 63 Nakashima K., Shinwari ZK., Skuma Y., Seki M, Miura S, Shinoraki K., Yamaguchi - Shinozaki K., (2000), Organization and expression of two Arabidopsis DREB2 genes encoding DRE- binding proteins involved in dehydration and high - salinity - responsive gene expression, Biological Resources Division, Japan International Research Center for Agricultural Sciences, Tsukaba, Ibaraki 64 Perlak, F.J., Stone, T.B., Muskopf, Y.N., Petersen, L.J.,Parker, G.B., McPherson, S.A., Wyman, J., Love, S., Reed, G., Biever, D and Fischhoff, D.A (1993) Genetically improved potatoes: protection from damage by Colorado potato beetles Plant Molecular Biology 22:313321 65 Nguyễn V.T.T., Chu H.M., Phạm M.D., Hoàng M.V., (2011), Glycine max dreb1 gene for drought responsive element binding protein 1, cultivar Cucvang-YenSon, NCBI, Accession HE647689 66 Qin F., Kakimoto M., Sakuma Y., Maruyama K., Osakabe Y., Tran L.S., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K., (2007), Regulation and functional analysis of ZmDREB2A in response to drought and heat stresses in Zea mays L., Plant J 67 Sakuma Y., Maruyama K., Osakabe Y., Qin F., Seki M., Shinozaki K., Yamaguchi S.K (2006), Funotion analysis of an Arabidopsis trancription factor, DREB2a, involved in drought responsive gene expession, The Plant Cell 18: 1292-1309 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN 50 http://www.lrc.tnu.edu.vn 68 Sambrook J., Fritsch E F., Maniatis T., (2011), Molecular cloning, A Laboraory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory press 69 Tsui-Hung P., Guihua S., Hon-Ming L., (2008), Salt Tolerance in Soybean, Journal of Intrgrative Plant Biology, 50(10): 1196-1212 70 Sato, S., C Newell, K.Kolacz, L Tredo, J Finer and M Hinchee (1993) Stable transformation via particle bombardment in two different soybean regeneration systems Plant Cell Rep 12:pp 408 - 413 71 Seo P.J., Xiang F., Qiao M., Park J.Y., Lee Y.N., Kim S.G., Lee Y H., Park W.J., Park C.M (2009), The MYB96 transcription factor mediates abscisic acid signaling during droughr stress respone in Arabidopsis", Plant Physiol, 151, 275 - 289 72 Swathi A.T., Jami S.K., Datla R.S (2006), Genetic transformation of peanut (Arachis hypogaea L.) using cotyledonary node as explant and a promoterless gus: npt I fusion gene based vector , J.Biosci., 31, pp.235-246 73 Tran L.S.P., Nakashima K., Sakuma Y., Simpson S D., Fujita Y., Maruyama K., Fujita M., Seki M., Shinozaki (2004), "Iso lation and functional analysis of Arabidopsis stress-inducible NAC transcription factors that bind to a droughtresponsive cis-element in the early responsive to dehydration stress promoter", The Plant Cell, 16, pp 2481-2498 74 Topping JF (1998), Tobacco transformation Methods of Molecuar Biology, 81: 36 75 Wang X (2005) , Regulatory functions of phospholipase D and phosphatidic acid in plant growth, development, and stress responses, Plant Physiol 139(2): 566- 573 76 Wang,N., Liu,M., Cheng,X and Ma,Y (2005), Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, China Academy of Agricultural Science, 12 Zhongguancun South Street, Haidian, Beijing 100081, China 77 Wang P.R., Deng X.J., Gao X.L., Chen J., Wan J., Jiang H., Xu Z.J., (2006), Progress in the study on DREB transcription factor, Yi Chuan, 28(3): 369-740 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN 51 http://www.lrc.tnu.edu.vn 78 Xiaoshuang Li, Daoyuan Zhang, Haiyan Li, Yucheng Wang, Yuanming Zhang and Andrew J Wood (2014), EsDREB2B a novel truncated DREB2-type transcription factor in the desert legume Eremosparton songoricum, enhances tolerance to multiple abiotic stress in yeast and transgenic tobaco, BMC Plant Bilogy, 1471-2229 79 Zyprian E and Kudo C.I (1990), Agobacterium - mediated plant transformation by novel mini - T- vectors in conjunction with a highcopy vir region helper plasmid Plant Mol Biol, 15, pp:245-256 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN 52 http://www.lrc.tnu.edu.vn PHỤLỤC Các môi trường MS ( Murashige Skoog, 1962) MS1 (1000ml) -> 20ml/l CaCl2.2H2O 440 Pha stock cho 50 lít môi trường ( 440 x 50 =22000mg) => 22g: pha 1000ml stock Sử dụng lấy 20ml stock cho lít môi trường MS2 (1000ml) -> 20ml/l KH2PO4 170 Pha stock cho 50 lít môi trường -> 8500mg => 8,5g: pha 1000ml Sử dụng lấy 20ml stock cho lít môi trường KNO3 1900 Pha stock cho 50 lít môi trường -> 95000mg => 95g: pha 1000ml Sử dụng lấy 20ml stock cho lít môi trường MgSO4.7H2O 370 Pha stock cho 50 lít môi trường -> 18500mg => 18,5g: pha 1000ml Sử dụng lấy 20ml stock cho lít môi trường NH4NO3 1650 Pha stock cho 50 lít môi trường -> 82500mg => 82,5g: pha 1000ml Sử dụng lấy 20ml stock cho lít môi trường MS3 (250ml) -> 5ml H3BO3 6,2 KI 0,83 MnSO4.4H2O 22,3 ZnSO4.7H2O 8,6 10 CoCl2.6H2O 0,025 11 CuSO4.5H2O 0,025 12 NaMoO4.2H2O 0,25 MS4 (250ml) -> 5ml/l 13 FeSO4.7H2O 27,8 14 37,3 Na2EDTA MS5 (250ml) -> 5ml/l 15 Glycine 16 Thiamin HCl 0,1 17 0,5 18 Pyridoxin HCl (vitamin B6) Nicotimic acid 19 Myo inositol 100 0,5 Pha 50 lít môi trường -> 310 mg => 0,31g: pha 250ml stock Sử dụng lấy 5ml /l môi trường Pha 50 lít môi trường -> 41,5 mg => 0,0415g: pha 250ml stock Sử dụng lấy 5ml /l môi trường Pha 50 lít môi trường -> 1115 mg => 1,115g: pha 250ml stock Sử dụng lấy 5ml /l môi trường Pha 50 lít môi trường -> 430 mg => 0,43g: pha 250ml stock Sử dụng lấy 5ml /l môi trường Pha 50 lít môi trường -> 1,25 mg => 0,00125g: pha 250ml stock Pha 50 lít môi trường -> 1,25 mg => 0,00125g: pha 250ml stock Pha 50 lít môi trường -> 12,5 mg => 0,0125g: pha 250ml stock Pha 50 lít môi trường -> 1390 mg => 1,39g / 250ml stock Pha 50 lít môi trường -> 1865 mg => 1,865g / 250ml stock Note: pha nước nóng tan hết cho FeSO4 vào đun cách thủy Pha 50 lít môi trường -> 100 mg => 0,1g / 250ml stock Pha 50 lít môi trường -> mg => 0,005g / 250ml stock Pha 50 lít môi trường -> 25 mg => 0,025g / 250ml stock Pha 50 lít môi trường -> 25 mg => 0,025g / 250ml stock Pha 50 lít môi trường -> 5000 mg => 5g / 250ml stock ... Nghiên cứu tạo dòng thuốc (Nicotiana tabacum L. ) mang gen GmDREB2 phận l p từ đậu tương Mục tiêu nghiên cứu Tạo dòng thuốc chuyển gen mang gen GmDREB2 phân l p từ đậu tương Nội dung nghiên cứu. .. cứu ( 1) Nghiên cứu tạo nguyên liệu biến nạp từ thuốc giống K326 ( 2) Nghiên cứu l y nhiễm A tumefaciens mang vector chuyển gen vào mảnh thuốc Tái sinh in vitro, chọn l c tạo dòng thuốc chuyển gen. .. thẩm thấu (iii) Các gen liên quan đến phát triển rễ Một số gen nghiên cứu nhiều năm gần l : LEA, P5CS, NCED, PLD [32],[40],[46] Gen LEA (Late Embryogenesis Abundant) nhóm gen liên quan tới nước