Đánh giá đa dạng di truyền loài chò nâu (dipterocarpus retusus) tại tỉnh thái nguyên bằng chỉ thị adn mã vạch

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP -  - KHÓA ḶN TỚT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN LỒI CHÒ NÂU (Dipterocarpus retusus) TẠI TỈNH THÁI NGUYÊN BẰNG CHỈ THỊ ADN MÃ VẠCH Giáo viên hướng dẫn: TS Hà Bích Hồng TS Đỗ Văn Trường Sinh viên thực hiện :Lương Thị Thu Trang MSV: : 1954041217 Khóa học : 2019 - 2023 Hà Nội, 2023 LỜI CẢM ƠN Người ta thường nói: Thành cơng khơng phải cá nhân tạo nên, kết cịn gắn liền với giúp đỡ hỗ trợ người xung quanh.  Trong suốt năm đại học mình, tơi ln nhận quan tâm, giúp đỡ, khích lệ, động viên từ q thầy cơ, gia đình bạn bè Lời đầu tiên, tơi muốn gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô Bộ môn Công nghệ Gen Di truyền phân tử, giảng viên, chuyên viên phòng ban chức Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp – Trường Đại Học Lâm Nghiệp nhiệt huyết công tác giảng dạy để truyền đạt đến sinh viên kiến thức quý báu hỗ trợ giúp đỡ tơi q trình hồn thành khóa luận tốt nghiệp Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới giáo TS Hà Bích Hồng TS Đỗ Văn Trường– người hướng dẫn trực tiếp tận tâm dạy suốt trình thực khóa luận tốt nghiệp Nhờ có mà luận văn tốt nghiệp tơi hồn thiện cách tốt Cảm ơn cô nhiều! Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè ln ủng hộ kích lệ tơi suốt trình học tập nghiên cứu trường.  Kinh phí thực hiện đề tài được hỗ trợ bởi đề tài cấp Nhà nước “Đánh giá đa dạng di truyền lồi Chị nâu (Dipterocarpus retusus) tỉnh thái nguyên thị ADN mã vạch” Do hạn chế mặt thời gian kinh nghiệm thân nên khơng thể tránh khỏi thiếu sót tồn định Kính mong nhận lời nhận xét, ý kiến đóng góp q thầy, giáo để khóa ḷn của tơi hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà nội, ngày 10 tháng năm 2023 Sinh viên thực Lương Thị Thu Trang MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN Mục lục Danh mục từ viết tắt Danh mục bảng biểu Danh mục hình ảnh Đặt vấn đề 10 Chương tổng quan tài liệu nghiên cứu 11 1.1.Tổng quan đối tượng nghiên cứu 11 1.1.1 Nguồn gốc phân bố Chò nâu 11 1.1.2.Hiện trạng phân bố Chò nâu tỉnh Thái Nguyên 11 1.1.3 Đặc điểm hình thái chung Chò Nâu 13 1.1.4.Đặc điểm sinh học sinh thái Chò nâu .13 1.1.5.Giá trị kinh tế Chò nâu 14 1.2 Tổng quan ADN mã vạch (ADN barcode) 15 1.2.1 Giới thiệu ADN mã vạch (DNA barcode) 15 1.2.2 Ứng dụng lợi ích mã vạch ADN .16 1.2.3 Một số locus sử dụng làm thị mã vạch ADN thực vật 17 1.3 Tình hình nghiên cứu bảo tồn Thế giới Việt Nam 19 1.3.1 Tình hình nghiên cứu bảo tồn Thế giới 19 1.3.2 Tình hình nghiên cứu bảo tồn nước 20 1.3.3 Giá trị nguồn gen tình trạng bảo tồn 21 1.4 Một số nghiên cứu adN mã vạch chi dầu 22 Chương NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU .26 2.1.1 Mục tiêu chung 26 2.1.2 Mục tiêu cụ thể 26 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .26 2.3 Vật liệu, hóa chất, thiết bị sử dụng nghiên cứu 26 2.3.1 Vật liệu nghiên cứu 26 2.3.2 Hóa chất…… 27 2.4 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu 27 2.5 Phương pháp nghiên cứu 27 2.5.1 Phương pháp thu nhận và bảo quản mẫu 27 2.5.2 Phương pháp phân lập đoạn trình tự ADN mã vạch 28 2.5.2 Phương pháp điện di gel agarose .29 2.5.3 Phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu 29 2.5.4 Tinh sản phẩm PCR 31 2.5.5 Phương pháp xác định trình tự nucleotide của các trình tự ADN mã vạch 31 2.5.6 Phương pháp phân tích số liệu 31 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Kết tách chiết ADN tổng số 32 3.2 Kết nhân CÁC ĐOẠN TRÌNH TỰ ADN MÃ VẠCH kỹ thuật PCR .33 3.2.1 Kết nhân đoạn trình tự matK 33 3.2.2 Kết nhân đoạn trình tự trnH-psbA .34 3.2.3 Kết nhân đoạn trình tự ITS2 35 3.3 Kết giải trình tự nucleotide đoạn ADN mã vạch mẫu Chò nâu 36 3.3.1 Kết so sánh trình tự nucleotide đoạn gen matK nhân 09 mẫu Chò nâu tỉnh Thái Nguyên 36 3.3.1 Kết so sánh trình tự nucleotide đoạn gen trnH-psbA của loài Chò nâu tỉnh Thái Nguyên 40 3.3.1 Kết so sánh trình tự nucleotide đoạn gen ITS2 của loài Chò Nâu tỉnh Thái Nguyên .43 3.4.2 Tháo luận đánh giá hiệu quả giám định loài và nghiên cứu đa dạng di truyền của ba trình tự ADN mã vạch 47 Chương KẾT LUẬN, THẢO LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 4.1.KẾT LUẬN 49 4.2.KIẾN NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 50 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 51 WEBSITE 53 Phụ lục .54 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Các chữ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt ATP Adenosin triphosphat Adenosin triphosphat bp Base pair Cặp base cpDNA Chloroplast DNA gen lục lạp Cytb Cytochrome b Cytochrome b DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate Deoxyribonucleotid triphosphate EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid axit ethylenediamine tetraacetic F-Primer Foward-Primer Mồi xuôi R-Primer Reverse primer Mồi ngược NCBI National Center for Biotechnology Information Trung tâm Quốc gia Thông tin Công nghệ sinh học PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase RFLP Restriction fragment length polymorphism Phân tích đa hình trình tự DNA RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic rRNA Ribosomal RNA ARN ribosome kb Kilobase (1000 base) 1000 cặp base TAE Tris-Acetate-EDTA Tris-Acetate-EDTA tRNA Transfer RNA ARN vận chuyển V/p v/p Vòng / phút DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1: Các mẫu Chò nâu thu thập tỉnh Thái Nguyên .26 Bảng 2.2: Trình tự thơng tin cặp mồi 30 Bảng 3.1: kết đo nồng độ ADN phương pháp quang phổ kế 32 Bảng 3.2 : Một số lồi ngân hàng gen có trình tự gen matK tương đồng với trình tự đoạn gen matK mẫu Chò nâu CN1 tỉnh Thái Nguyên 37 Bảng 3.3 : Một số lồi ngân hàng gen có trình tự gen trnH-psbA tương đồng với trình tự đoạn gen trnH-psbA mẫu Chò nâu CN1 tỉnh Thái Nguyên .41 Bảng 3.4 : Một số lồi ngân hàng gen có trình tự gen ITS2 tương đồng với trình tự đoạn gen ITS2 mẫu Chò nâu CN1 tỉnh Thái Nguyên .45 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1: Cây Chị nâu 13 Hình 3.1 : Kết tách chiết ADN tổng số tách chiết từ mẫu Chị Nâu 33 Hình 3.2: Kết nhân trình tự đoạn gen matK 09 mẫu Chị nâu 33 Hình 3.3: Kết nhân trình tự đoạn gen trnH-psbA 09 mẫu Chị nâu 34 Hình 3.4: Kết nhân trình tự đoạn gen ITS 09 mẫu Chị nâu 35 Hình 3.5:Trình tự nucleotide đoạn gen matK mẫu Chò nâu tỉnh Thái Nguyên .37 Hình 3.6: Kết so sánh trình tự nucleotide đoạn matK của loài Chị nâu loài ngân hàng gen q́c tế .39 Hình 3.7: Cây quan hệ di truyền loài Chò Nâu tại tỉnh Thái Nguyên với các loài tương đồng ngân hàng gen quốc tế dựa trình tự matK 40 Hình 3.8: Trình tự nucleotide đoạn gen trnH-psbA mẫu Chò nâu tỉnh Thái Nguyên 41 Hình 3.9: Kết so sánh trình tự nucleotide đoạn trnH-psbA của loài Chò nâu loài ngân hàng gen quốc tế .42 Hình 3.10: Cây quan hệ di truyền loài Chò nâu tại tỉnh Thái Nguyên với các loài tương đồng ngân hàng gen quốc tế dựa trình tự trnH-psbA .43 Hình 3.11: So sánh trình tự nucleotide đoạn gen ITS2 09 mẫu Chò nâu tỉnh Thái Nguyên 44 Hình 3.2:Cây quan hệ di truyền mẫu Chò nâu tỉnh Thái Nguyên 45 Hình 3.13:Kết so sánh trình tự nucleotide đoạn ITS2 của loài Chị nâu loài tương đồng ngân hàng gen quốc tế 46 Hình 3.14: Cây quan hệ di truyền loài Chị nâu tại tỉnh Thái Ngun với các lồi có tương đồng ngân hàng gen quốc tế dựa trình tự ITS2 47 ĐẶT VẤN ĐỀ Chị nâu có tên khoa học Dipterocarpus retusus, cịn gọi Trái dầu, Sao xoay Chò nâu gỗ lớn có giá trị kinh tế cao so với lồi gỗ họ Dầu khác Cây Chị nâu mang lại giá trị sử dụng cao, gần tất phận như: thân, gốc, cành, lá, giác gỗ đều được sử dụng Hiện nay, khai thác mức làm nhiều loài thực vật đứng trước nguy tuyệt chủng Theo sách đỏ Việt Nam năm 2007 có 464 lồi lồi thực vật có nguy tuyệt chủng tăng 100 lồi so với năm 1996 Những lồi có giá trị kinh tế cao nên bị khai thác mức Trước tình hình đó, Chính phủ Việt Nam có giải pháp nhằm bảo vệ rừng, bảo vệ giá trị đa dạng sinh học Một giải pháp quan trọng việc thành lập hệ thống khu rừng đặc dụng phạm vi tồn quốc Trong Chị nâu (Dipterocarpus retusus) loại gỗ lớn cho giá trị kinh tế cao, khai thác lấy gỗ, dùng xây dựng đóng tàu,… Ngồi ra, vỏ Chò nâu sử dụng thuốc cổ truyền đồng bào dân tộc Kơ-Tu điều trị lợi tiểu kích thích tim dùng pha nước uống hàng ngày Xuất phát từ vấn đề thực tế với mong muốn đóng góp vào phát triển cơng tác bảo tồn tính đa dạng sinh học, bảo tồn quần thể, loài, nguồn gen chức chúng, phục vụ cho phát triển bền vững, bảo vệ mơi trường, ứng phó với biến đổi khí hậu, tăng cường lực nghiên cứu khoa học bảo tồn đa dạng sinh học nâng cao nhận thức bảo tồn nguồn gen cho người dân lồi Chị nâu Việt Nam nói chung và tỉnh Thái Nguyên nói riêng, thực đề tài: “Đánh giá đa dạng di truyền loài Chò nâu (Dipterocarpus retusus) tỉnh thái nguyên thị ADN mã vạch” 10 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1.TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 1.1.1 Nguồn gốc phân bố Chò nâu Cây Chị nâu có tên khoa học Dipterocarpus retusus; thuộc họ Dầu (Dipterocarpaceae) chi Dầu (Dipterocarpus) Tên khác : Trái dầu, Sao xoay Họ Dầu (Dipterocarpaceae) họ 17 chi khoảng 580-680 loài thân gỗ chủ yếu mọc vùng đất thấp, rừng thường xanh ẩm ướt rừng núi Lồi Chị nâu có nguồn gốc từ Châu Á, tìm thấy Ấn Độ, khắp Đông Dương tỉnh Xizang Vân Nam Trung Quốc. Lồi tìm thấy đảo Indonesia. Phân bố độ cao từ 300 m đến 1.500m so với mặt nước biển có phạm vi xuất ước tính (EOO) vượt q triệu km2 Lồi Chị nâu có phạm vi phân bố tự nhiên rộng phạm vi phân bố số lượng cá thể phân tán (Báo cáo thống kê phát triển rừng Cộng hòa Ấn Độ (Singh et al., 2014)) Nằm vùng phân bố tự nhiên số lượng cá thể Chò nâu Vân Nam lại (Xiwen et al. 2007).  Ở Việt Nam, Chò nâu mọc tỉnh Sơn la, Yên Bái, Hà Giang, Tuyên Quang, Bắc Kạn, Thái Nguyên, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Hà Tây, Hồ Bình, Tp Hà Nội, Quảng Bình, Đà Nẵng, Quảng Nam Tập trung tỉnh Bắc Kạn, Thái Nguyên 1.1.2.Hiện trạng phân bố Chò nâu tỉnh Thái Nguyên Theo công bố diện tích rừng đến 31 tháng 12 năm 2020, diện tích rừng tỉnh Thái Nguyên có 187.545 ha, có 76.481 rừng tự nhiên Hệ thống rừng tự nhiên phong phú, đa dạng, phân bố núi thấp, núi cao, núi đất, núi đá phục vụ du lịch sinh thái nghỉ dưỡng, nghiên cứu khoa học khu bảo tồn thiên nhiên Thần Sa-Phượng Hoàng, rừng đặc dụng ATK, rừng phòng hộ Hồ Núi Cốc…nhưng lồi Chị nâu trở nên khan có nguy biến hoạt động người Hiện trạng lồi Chị nâu Thái Ngun cịn lại ít, phân bố rải rác vườn rừng, rừng tự nhiên thứ sinh huyện Võ Nhai (Nghinh Tường, Sảng Mộc, Vũ Chấn ), Đồng Hỷ (Văn Lăng, Văn Hán, Cây Thị, Trại Cau), Định Hóa (Phú Đình, Bảo Linh, Bảo Cường, Điềm Mặc, Phượng Tiến), Phú Lương (Vô Chanh, Tức Chanh, Hợp Thành, Ôn Lương) Đại Từ (Quân Chu, Bản Ngoại, Bình Thuân, Ký Phú, Lục Ba, Phú Lạc…) Tuy nhiên, địa điểm khảo sát bắt gặp cá thể Chò nâu đơn lẻ sống chung với loài khác 11 Dipterocarpus Vị trí nucleotide sai khác của trình tự trnH-psbA của loài Chò nâu tại Thái Nguyên và 07 loài GenBank được minh họa cụ thể hình 3.9 Hình 3.9: Kết so sánh trình tự nucleotide đoạn trnH-psbA của loài Chị nâu loài ngân hàng gen quốc tế Cây quan hệ di truyền loài Chò nâu tại tỉnh Thái Ngun với 07 lồi có độ tương đồng cao nhất 01 loài đối chứng ngân hàng gen quốc tế được xây dựng dựa phần mềm Mega 11 (Hình 3.10) Qua quan hệ di truyền ta nhận thấy mẫu CN1 có quan hệ di truyền gần nhất với loài Chò nâu Dipterocarpus retusus (MW074183.1) và có quan hệ họ hàng gần với loài Dipterocarpus gracilis (MZ160991.1), Dipterocarpus alatus (NC_058777.1), Hopea hainanensis (MN533970.1), Dipterocarpus turbinatus (NC_046842.1), Dipterocarpus hasselti (NC_065503.1) Sử dụng 01 loài xa làm đối chứng Shorea pauciflora (AB4452542.1) cho ta thấy rõ mới quan hệ di trùn giữa mẫu Chị nâu nghiên cứu với loài thuộc chi Dầu (Dipterocarpus), thể hiện ở khoảng cách di truyền rất lớn lồi nằm riêng nhánh khác Kết quả này được thể hiện với độ tin cậy 100% (chỉ số bootstrap 100%) 42 Hình 3.10: Cây quan hệ di truyền loài Chò nâu tại tỉnh Thái Nguyên với các loài tương đồng ngân hàng gen quốc tế dựa trình tự trnH-psbA Qua kết so sánh phân tích đoạn trình tự trnH-psbA ở các mẫu Chị nâu tại Thái Ngun, nhận thấy trình tự trnH-psbA khơng thích hợp cho việc đánh giá đa dạng di truyền cùng loài bởi vì sự bảo thủ về trình tự nucleotide là rất cao, trình tự ADN mã vạch này định danh loài Chò nâu với hiệu quả cao 3.3.1 Kết so sánh trình tự nucleotide đoạn gen ITS2 của loài Chị Nâu tỉnh Thái Ngun Trình tự ITS2 mẫu Chò nâu Thái Nguyên sau nhân và giải trình tự nucleotide thành công với kích thước 378bp, sau xử lý trình tự bằng phần mềm BioEdit, xác định được đoạn trình tự ITS2 có kích thước 362bp để phân tích Trình tự có kích thước 362bp tất cả 09 mẫu Chò nâu được so sánh với sử dụng công cụ ClustalW Multiple alignment phần mềm BioEdit Những mẫu Chị nâu Thái Ngun có độ tương đồng cao về trình tự ITS2, một số vị trí nucleotide sai khác giữa mẫu Chò nâu được thể hiện hình 3.11 43 Hình 3.11: So sánh trình tự nucleotide đoạn gen ITS2 09 mẫu Chị nâu tỉnh Thái Ngun Qua hình 3.11 cho thấy sự sai khác di truyền về trình tự ITS2 ở các cá thể mẫu Chò nâu tỉnh Thái Nguyên, khác với trình tự matK và trnH-psbA đã phân tích ở Tiến hành so sánh trình tự nucleotide đoạn gen ITS2 của 09 mẫu cho thấy sự sai khác tại vị trí nucleotide cụ thể sau (Hình 3.11):  Vị trí 137, 141, 280 mẫu CN1, CN2, CN3 khác so với mẫu CN4, CN5, CN6, CN7, CN8, CN9  Vị trí 130, 190, 200, 205, 226, 272 mẫu CN9 khác so với mẫu CN1, CN2, CN3, CN4, CN5, CN6, CN7, CN8 44 Hình 3.22:Cây quan hệ di truyền mẫu Chò nâu tỉnh Thái Nguyên Từ kết bước đầu kết luận mẫu Chò nâu tại tỉnh Thái Nguyên có đa dạng di truyền đoạn gen ITS2 09 mẫu Chò nâu tại tỉnh Thái Nguyên được chia thành nhóm: một nhóm gồm trình tự của mẫu CN1, CN2, CN3 giống 100%; một nhóm gồm trình tự của mẫu CN4, CN5, CN6, CN7, CN8 giống 100%, và một nhóm chỉ gồm mẫu CN9 Các vị trí sai khác về trình tự nucleotide có ý nghĩa mặt tiến hóa giúp cho cá thể mẫu Chị nâu tỉnh Thái Nguyên thích nghi với điều kiện sinh thái khác Chúng sử dụng mẫu CN1- đại diện cho nhóm gờm các mẫu CN1, CN2, CN3 mẫu CN4 – đại diện cho nhóm gờm các mẫu CN4, CN5, CN6, CN7, CN8, và mẫu CN9 làm đối tượng so sánh với các trình tự tương đồng ngân hàng gen quốc tế Kết quả xác định được 06 trình tự có tương đồng cao GenBank 01 loài khác chi sử dụng làm đối chứng (Shorea pauciflora) (Bảng 3.4) 45 Bảng 3.4 : Một số lồi ngân hàng gen có trình tự gen ITS2 tương đồng với trình tự đoạn gen ITS2 mẫu Chò nâu CN1 tỉnh Thái Nguyên STT Tên loài thương đồng Mã số GenBank Tỷ lệ tương đồng (%) Dipterocarpus retusus MW074183.1 99,61% Dipterocarpus retusus MK193032.1 98.90% Dipterocarpus gracilis MZ160991.1 98,59% Dipterocarpus turbinatus NC_046842.1 97,88% Dipterocarpus ridius MZ782405.1 97,25% Dipterocarpus zeylanicus MZ782413.1 97,25% Shorea pauciflora AB452542.1 93,43% Qua bảng 3.4 cho thấy mẫu Chị nâu CN1 có tỷ lệ tường đồng cao (99,61%) với lồi Dipterocarpus retusus Có thể khẳng định đoạn trình tự ITS2 có khả giám định lồi Chị nâu tỉnh Thái Ngun Ngồi ra, lồi khác Dipterocarpus gracilis, Dipterocarpus turbinatus, Dipterocarpus haselti , Dipterocarpus ridius, Dipterocarpus zeylanicus có tỷ lệ tương đồng cao với mẫu CN1 Thái Nguyên với tỷ lệ tương đồng từ 97,0% đến 98,0%, 97,0% Sự sai khác về trình tự nucleotide nhóm mẫu Chò nâu tại tỉnh Thái Ngun với 07 lồi có mức độ tương đồng cao 01 loài làm đối chứng ngân hàng gen quốc tế xây dựng hình 3.12 46 Hình 3.13:Kết so sánh trình tự nucleotide đoạn ITS2 của loài Chò nâu loài tương đồng ngân hàng gen quốc tế Sử dụng phần mềm Mega11, chúng xây dựng quan hệ di truyền 03 mẫu Chò nâu (đại diện cho nhóm Chò nâu tại tỉnh Thái Nguyên) với 07 lồi có độ tương đồng cao nhất 01 loài đối chứng ngân hàng gen quốc tế Qua quan hệ di truyền ta nhận thấy mẫu CN1 là loài Chò Nâu Dipterocarpus retusus (MW074183.1) và có quan hệ họ hàng gần với loài Dipterocarpus retusus (MK193032.1), Dipterocarpus retusus (MK193031.1),Dipterocarpus gracilis (MZ160991.1, Dipterocarpus turbinatus (NC_046842.1), Dipterocarpus ridius (MZ782405.1), Dipterocarpus zeylanicus (MZ782413.1) Sử dụng 01 loài xa làm đối chứng Shorea pauciflora (AB452542.1) cho ta thấy rõ mối quan hệ di truyền giữa mẫu Chị nâu nghiên cứu với lồi thuộc chi Dầu (Dipterocarpus), 47 thể hiện ở khoảng cách di truyền rất lớn lồi nằm riêng nhánh khác Kết quả này được thể hiện với độ tin cậy 100% (chỉ số bootstrap 100%) Hình 3.14: Cây quan hệ di truyền loài Chò nâu tại tỉnh Thái Nguyên với các lồi có tương đồng ngân hàng gen quốc tế dựa trình tự ITS2 3.4.2 Tháo luận đánh giá hiệu quả giám định loài và nghiên cứu đa dạng di truyền của ba trình tự ADN mã vạch Gen matK của loài Chò nâu nghiên cứu này được giải trình tự với kích thước 760 bp và tương đồng 100% ở tất cả 09 mẫu tại Thái Nguyên Điều này cho thấy ở các vùng sinh thái khác thì trình tự gen matK vẫn không bị biến đổi Gen matK là một gen chức năng, tổng hợp enzyme maturase K, vậy thường không có các đột biến thêm hay bớt nucleotide xảy gen, nên kích thước cũng trình tự nucleotide của gen này tương đối ổn định Trình tự matK của loài Chị nâu tại Thái Ngun tương đờng 100% với mợt loài Chị nâu (Dipterocarpus retusus) GenBank, đờng thời cũng tương đờng 99% với lồi Dipterocarpus gracilis GenBank, đó có thể thấy khả phân biệt loài này chi Dipterocarpus dựa trình tự matK hiệu quả 48 Trình tự trnH-psbA là trình tự không mã hóa và biến đổi nhiều nên việc kết hợp với một trình tự mã hóa và bảo thủ matK hay rbcL sẽ làm giảm bớt những sai sót (Kress và Erickson, 2007) Tuy nhiên, nghiên cứu này, trình tự trnHpsbA của tất cả 09 mẫu Chò nâu nghiên cứu đều tương đồng 100% Kết quả này cho thấy trình tự trnH-psbA là rất bảo thủ loài Chị nâu Kết quả này tương đờng với nghiên cứu của tác giả Hà Bích Hồng và cộng sự (2022) loài Đinh mật Điều này có thể thấy đối với những loài gỗ có tuổi đời cao và tồn tại đặc hữu ở những vùng sinh thái nhất định thì sự biến đổi về trình tự nucleotide cũng ít xảy Trình tự ITS2 cũng là một trình tự không mã hóa và có thể có sự biến đổi về một vài vị trí nucleotide cùng mợt loài Đới với loài Chị nâu thì trình tự ITS2 cũng giống 98% giữa 09 mẫu nghiên cứu Sự đa dạng nucleotide được thể hiện tại vị trí và tất cả các vị trí sai khác này đều có ý nghĩa tiến hóa Với vị trí sai khác đó, mẫu Chò nâu được chia thành dạng haplotype khác nhau, haplotype bao gồm mẫu CN1, CN2, CN3; haplotype bao gồm mẫu là CN4, CN5, CN6, CN7, CN8; và haplotype chỉ gồm mẫu CN9 Đây chỉ là kết quả bước đầu nghiên cứu đa dạng di truyền dựa trình tự ITS2, cần tiếp tục nghiên cứu với một số trình tự khác có kích thước lớn để có được kết luận chính xác về sự đa dạng di truyền của loài Chò nâu tại tỉnh Thái Nguyên Hu và cộng sự (2019) cũng kết luận ITS2 là trình tự có hiệu quả nhận dạng loài cao nhất họ Dipterocarpaceae sử dụng chỉ thị rbcL, matK, trnL-trnF ITS2 và sử dụng kết hợp ITS2 với matK là thích hợp với các loài thuộc họ dầu Dipterocarpaceae 49 CHƯƠNG KẾT LUẬN, THẢO LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1.KẾT LUẬN Phân lập và giải trình tự nucleotide thành công 03 đoạn trình tự ADN mã vạch là matK, trnH-psbA, và ITS2 ở 09 mẫu Chò Nâu tại tỉnh Thái Nguyên với kích thước mỗi đoạn tương ứng là 730 bp, 280 bp, và 360 bp; Giám định được loài Chò nâu có xuất xứ tại Thái Nguyên có tên khoa học là Dipterocarpus retusus sử dụng các trình tự ADN mã vạch matK, trnH-psbA, ITS2; Bước đầu đánh giá được đa dạng di truyền của các mẫu Chò nâu tại Thái Nguyên dựa trình tự ITS2 09 mẫu Chò nâu tại Thái Nguyên bao gồm dạng haplotype tương ứng với 07 vị trí sai khác nucleotide Trình tự matK và trnH-psbA không thể hiện bất kỳ sự sai khác nucleotide nào giữa mẫu Chò nâu nghiên cứu 4.2.KIẾN NGHỊ Công bớ các trình tự ADN mã vạch của loài Chị nâu tại Thái Nguyên lên ngân hàng gen Quốc tế làm sở dữ liệu phục vụ các nghiên cứu liên quan Tiếp tục phân tích thêm các mẫu Chò nâu tại các vùng địa lí khác và sử dụng thêm một số trình tự ADN mã vạch khác để khẳng định về sự đa dạng di truyền giữa các cá thể cùng một xuất xứ và giữa các xuất xứ với Từ đó có sở khoa học cho sự bảo tồn và phát triển nguồn gen Chò nâu 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bộ Khoa học Công nghệ (2007), sách Đỏ Việt Nam (phần thực vật), Nxb Khoa học tự nhiên & Cơng nghệ, Hà Nội Hồng Cảnh (2006), Trầm hương loại tạo trầm hương, lợi ích, thách thức triển vọng Hội trầm hương Việt Nam Nguyễn Tiến Bân (chủ biên) - Danh lục loài thực vật Việt Nam, Tập II, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội, 2003 Hà Văn Huân, Nguyễn Trung Thành, Hoàng Minh Trang (2016) Xác định số đoạn mã vạch ADN cho số loài Trà hoa vàng vườn Quốc gia Tam Đảo Đại học Quốc gia Hà Nội, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, trang 3-5 Lê Thanh Hương (2017) Ứng dụng mã vạch ADN hỗ trợ định loại loài số mẫu Sâm thuộc chi Nhân sâm (T66) Tạp chí cơng nghệ sinh học 15 Phạm Hồng Hộ - Cây cỏ Việt Nam, Quyển 1, Nhà xuất Trẻ, Tp Hồ Chí Minh, 1999 Hà Bích Hờng, Nguyễn Thế Hưởng, Vũ Phạm Thảo Vy, Vũ Văn Thông (2022) Xác định một số trình tự ADN mã vạch của loài Đinh mật (Fernandoa brilletii) tại tỉnh Thái Nguyên Tạp chí KH&CN Lâm nghiệp, 4: 30-39 Vũ Quang Nam, Vũ Đình Duy, Nguyễn Thị Thỉnh, Vũ Thị Thu Hiền, Lưu Thị Phương ( 2021) sử dụng DNA mã vạch vùng gen nhân (ITS-rDNA) định danh loài hoa trứng gà n tử (Magnolia sp.)tạp chí khoa học cơng nghệ lâm nghiệp sô ,trang 44 Nguyễn Đức Lượng (2002), Công nghệ gen NXB Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh 10.Đỗ Tất Lợi ( 2012) Những thuốc vị thuốc việt Nam NXB Y Học 11.Bùi Văn Thắng, Nguyễn Thị Hải Hà, Vũ Quang Nam, Nguyễn Thế Đại, Phan Văn Quỳnh, Nguyễn Ngọc Ánh (2017) Giám định số lồi Nưa Thanh Hóa dẫn liệu hình thái phân tử Tạp chí Khoa học Công nghệ Lâm nghiệp, số 3, trang 9-16 12.Hoàng Minh Trang, Hà Văn Huân, Phạm Thành Trang, Dương Thị Hoa, Vũ Thị Bích Thuận (2016) Xác định đoạn mã vạch DNA (DNA Barcode) cho loài Hải đường vàng (Camellia tienii Ninh): phục vụ giám định loài Tạp chí Nơng Nghiệp PTNT, số 7/2016, trang 240 - 246 51 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 13.Alvarez I W J F (2003) Ribosomal ITS sequences and plant phylogenic inference Molecular phylogentics and Evolution 29: 417-434 14.Carneiro de Melo Moura C., Brambach F., Jair Hernandez Bado K., Krutovsky K V., Kreft H., Tjitrosoedirdjo S S., Siregar I Z., and Gailing O (2019) Integrating DNA Barcoding and Traditional Taxonomy for the Identification of Dipterocarps in Remnant Lowland Forests of Sumatra. Plants 2019; 8(11):461 15.CBOL plant working group (2009) A DNA barcode for land plants, Proc Natl Acad Sci USA,106: 12794-12797 16.Chen S., Yao H., Han J., Liu C., Song J., Shi L., Zhu Y., Ma X., Gao T., Pang X., Luo K., Li Y., Li X., Jia X., Lin Y., and Leon C (2010) Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species PloS One (1): e8613 17.Duc M Nguyen, Hoang H Nguyen, Minh N Nghiem, Duy D Vu, Tam M Nguyen, Minh N Truong, Duc H M Tran, Minh Q Bui, Khanh H Nguyen, Hong P L Nguyen, and Huong T T Nguyen (2022) DNA Barcoding for Dipterocarpus Species in Vietnam Based on Chloroplast Gene Region matK Journal of Modern Agriculture and Biotechnology https://www.doi.org/10.53964/jmab.2022012 18.Heckenhauer J., Abu Salim K., Chase M W., Dexter K G., Pennington R T., Tan S., et al (2017) Plant DNA barcodes and assessment of phylogenetic community structure of a tropical mixed dipterocarp forest in Brunei Darussalam (Borneo) PLoS ONE 12(10): e0185861 https://doi org/10.1371/journal.pone.0185861 19.Hu J., Liu Z., Ci X., Li J (2019) Use of DNA Barcoding in Identifying Tropical Trees from Dipterocarpaceae Chinese Bulletin of Botany, 54(3): 350-359 20.Kress W J and Erickson D L (2007) A Two-Locus Global DNA Barcode for Land Plants: The Coding ITS Gene Complements the Non-Coding trnHpsbA Spacer Region PLoS ONE 2(6): e508 52 21.Liu Z F , Ci X Q, Li L , Li H W , Conran J G anh Li J (2016) DNA barcoding evaluation and imlication for phylogenetic relationships in Lauraceae from China . Forests 12(10): 1466 https://doi.org/10.3390/f12111466 22.Larranaga N and Hormaza J L (2015) DNA barcoding of perennial fruit tree species of agronomic interest in the genus Annona (Annonaceae) Frontiers in Plant Science . Forests 12(10): 1466 https://doi.org/10.3390/f12111466 23.Osathanunkul M and Madesis P (2021) The Identification of Several Dipterocarpaceae and Fagaceae Trees by Barcode DNA Coupled with HighResolution Melting Analysis. Forests 12(11): 1466 https://doi.org/10.3390/f12111466 24.Scharaschklin T and Doyle J.A (2005) Phylogeny DNA historical biogeography of Anaxagorea (Annonaceae) using morphology DNN noncoding chloroplast sequence data. Systematic Botany 30: 712–735 25.Trang N T., Duc N M., Sinh N V., and Triest L (2015) Application of DNA barcoding markers to the identification of Hopea species. Genetics and Molecular Research 14 (3): 9181-9190 26.Vijayan K and Tsou C H (2010) DNA barcoding in plants: taxonomy in a new perspective Current science, 99: 1530 – 1540 27.Von Crautlein M K H, et al (2011) DNA barcoding: a tool for improved taxon identification and detection of species diversity Biodiversity and conservation 20: 373-389 28.Wen J and Zimmer E A (1996) Phylogeny and biogeography of Panax L (the ginseng genus, Araliaceae): inferences from ITS sequences of nuclear ribosomal DNA Mol Phylogenet Evol (2): 167-177 29.Wang W., Wu Y., Yan Y., Ermakova M., and Kerstetter R (2010) DNA barcoding of the Lemnaceae, a family of aquatic monocots. BMC Plant Biology (10): 205 30.Yong H L., Jinlan R., Shilin C., Jingyuan S., Kun L., Dong L., and Hui Y (2010) Authentication of Taxillus chinensis using DNA barcoding technique Journal of Medicinal Plants Research, 4(24): 2706-2709 31.Yao H., Song J., Liu C., Luo K., and Han J (2010) Use of ITS2 region as theuniversal DNA barcode for plants DNA animals PLoS ONE, 5: 13102 53 WEBSITE 31.http://iasvn.org/homepage/Ma-vach-DNA-(DNA-BARCODE)-va-huong-nghiencuu-ung-dung-o-Viet-Nam-5898.html 32.https://nongnghiep.vn/cho-nau-phuc-vu-tham-canh-rung-go-lon-d181108.html 33 https://en.wikipedia.org/wiki/DNA_barcoding 34.https://trungtamduoclieu.vn/thuc-vat-rung/cho-nau-c322.html 35 https://duoclieuvietnam.com.vn 54 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Trình tự nucleotide đoạn gen matK cá thể Thái Nguyên 55 Phụ lục 2: Trình tự nucleotide đoạn gen trnH-psbA cá thể Thái Nguyên 56