Đánh giá đa dạng di truyền nấm lim (ganoderma lucidum (leyss ex fr ) karst) thông qua hình thái và chỉ thị phân tử

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP - KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên khóa luận: ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN NẤM LIM (Ganoderma lucidum (Leyss Ex Fr.) Karst) THƠNG QUA HÌNH THÁI VÀ CHỈ THỊ PHÂN TỬ Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Thị Hồng Gấm Sinh viên thực hiện: Nguyễn Đức Nam Mã sinh viên: 1953070118 Lớp: K64 - CNSH Hà Nội, năm 2023 LỜI CẢM ƠN Trong thời gian học tập làm việc Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Trường Đại học Lâm nghiệp mang đến cho hào hứng hành trang giúp chuẩn bị tốt cho công việc tương lai Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện tạo điều kiện cho thực phần đề tài khóa luận Viện Tơi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện cho thực phần đề tài khóa luận Viện Đặc biệt, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Nguyễn Thị Hồng Gấm và TS Đỗ Tiến Phát tạo điều kiện tốt, sát trực tiếp hướng dẫn tơi suốt q trình đê tơi có thê thực hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo thuộc Bộ môn Công nghệ tế bào thầy cô Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện trình thực đề tài Tôi xin cảm ơn hỗ trợ từ đề tài “Nghiên cứu Phục tráng phát triển nguồn gen nấm Lim (Ganoderma lucidum (Leyss Ex Fr.) Karst.) tạo sản phẩm OCOP” thuộc Chương trình nghiên cứu phục tráng phát triên giống trồng, vật nuôi thủy đặc sản địa phương TS Nguyễn Thị Hồng Gấm làm chủ trì hỗ trợ nguyên, vật liệu dụng cụ cần thiết đê thực đề tài khóa luận Tuy cố găng đê hồn thiện khóa luận này, song kiến thức kinh nghiệm thân hạn chế, khóa luận tốt nghiệp khơng tránh khoi sai sót Kinh mong q Thầy Cơ đóng góp ý kiến đánh giá, đê khóa luận tơi hồn thiện Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2023 Sinh viên thực Nguyễn Đức Nam i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Đặc điêm nấm Lim xanh 1.1.1 Đặc điêm sinh học 1.1.2 Đặc điêm hình thái 1.2 Thành phần dược chất tác dụng dược lý nấm Lim xanh 1.3 Đánh giá đa dạng di truyền thị phân tử ISSR 1.4 Đặc điêm địa lý khu vực thu nhận mẫu nấm Lim tự nhiên 1.4.1 Đặc điêm địa lý huyện Ba Chẽ - tỉnh Quảng Ninh 1.4.2 Đặc điêm địa lý huyện Hoành Bồ - tỉnh Quảng Ninh 11 1.4.3 Đặc điêm địa lý thành phố Uông Bi - tỉnh Quảng Ninh 14 1.4.4 Đặc điêm địa lý huyện Nam Giang - tỉnh Quảng Nam 15 CHƯƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 17 2.2 Nội dung nghiên cứu 17 2.3 Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu 17 2.3.2 Địa điêm nghiên cứu 17 2.3.3 Phương pháp bố tri thi nghiệm 17 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 3.1 Kết đánh giá đa dạng di truyền xuất xứ (dong) nấm Lim thông qua hình thái thê 22 ii 3.2 Kết đánh giá đa dạng di truyền xuất xứ (dong) nấm Lim thông qua thị ISSR 28 3.2.1 Kết tách chiết DNA 11 mẫu nấm Lim Xanh 28 3.2.2 Kết thực phản ứng PCR-ISSR 29 3.2.3 Kết phân tich đa hình mồi ISSR với 11 mẫu nấm Lim Xanh 33 3.2.4 Quan hệ di truyền 11 xuất xứ (dong) nấm Lim Xanh 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 Kết luận 37 Kiến nghị 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TT Chữ viết tắt Viết đầy đủ ADN Acid Deoxyribonucleic (Axit deoxyribonucleit) bp Base pair (Cặp bazơ) cs Cộng EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid Genbank Ngân hàng gen quốc tế NCBI National Center for Biotechnology Information (Trung tâm thông tin công nghệ sinh học quốc gia Hoa Kỳ) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp nhờ polymerase) ISSR Interal Simple Sequence Repeats (đoạn lặp lại nằm giưa đoạn trình tự đơn giản) (Là kỹ thuật phân tich dựa việc nhân đoạn ADN nằm giưa vùng lặp đơn giản) UV Ánh sáng tử ngoại iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Mã mẫu thu nhận xuất xứ (dong) nấm Lim tự nhiên 18 Bảng 2.2 Các tiêu hình thái thê nấm Lim tự nhiên 18 Bảng 2.3 Thành phần đệm chiết sử dụng cho tách chiết DNA 19 Bảng 2.4 Các mồi ISSR sử dụng phản ứng 20 Bảng 3.1 Các xuất xứ (dong) nấm Lim tự nhiên thu nhận 22 Bảng 3.2 Đặc điêm hình thái thê xuất xứ (dong) nấm lim tự nhiên thu nhận 23 Bảng 3.3 Kết đo độ tinh nồng độ DNA tổng số 11 mẫu nấm Lim Xanh 28 Bảng 3.4 Kết đánh giá 11 xuất xứ (dong) nấm Lim với thị KA5 30 Bảng 3.5 Kết đánh giá 11 xuất xứ (dong) nấm Lim với thị LC-46 31 Bảng 3.6 Kết đánh giá 11 xuất xứ (dong) nấm Lim với thị BA3 32 Bảng 3.7 Ty lệ băng đa hình thu mồi ISSR với 11 xuất xứ (dong) nấm Lim Xanh 33 Bảng 3.8 Hệ số tương đồng 11 xuất xứ (dong) nấm Lim với hệ số tương đồng Jaccards 34 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Quả thê Nấm Lim mọc tự nhiên Hình 2.1 Chế độ nhiệt thời gian chạy phản ứng PCR-ISSR 21 Hình 3.1 Hình ảnh thê xuất xứ (dong) nấm Lim tự nhiên thu nhận 27 Hình 3.2 Kết PCR 11 xuất xứ (dong) nấm Lim với mồi KA5 29 Hình 3.3 Kết PCR 11 xuất xứ (dong) nấm Lim với mồi LC-46 31 Hình 3.4 Kết PCR 11 xuất xứ (dong) nấm Lim với mồi BA3 32 Hình 3.5 Cây phân loại di truyền 11 xuất xứ (dong) nấm Lim dựa hệ số tương đồng Jaccards 35 vi ĐẶT VẤN ĐỀ Ngành sản xuất nấm không nguồn cung cấp thực phẩm giàu protein bổ dưỡng, có thê đóng góp vào việc sản xuất sản phẩm thuốc hiệu (Chang & Wasser, 2012; Wasser, 2010, 2014) Nấm trồng trở nên phổ biến toàn giới Năm 2012, tổng sản lượng nấm ăn nấm dược liệu giới ước tinh đạt 31 triệu tấn, trị giá 20 ty đô la Mỹ (Chang & Wasser, 2012) Năm 2013, sản lượng nấm ăn trồng giới tăng lên 34 triệu (Royse, Baars, & Tan, 2017) Ngành sản xuất nấm khơng có tác động bất lợi pháp lý, đạo đức an tồn, hình thức công nghệ chuyên đổi sinh học không mang lại lợi ich kinh tế xã hội, dinh dưỡng sức khoe thuận lợi mà tăng khả việc làm có tác động tich cực đến mơi trường (Mshigeni & Chang, 2013) Hiện nay, việc nghiên cứu ứng dụng cơng nghệ sinh học nói chung cơng nghệ sinh học nơng nghiệp nói riêng vấn đề nhiều nước giới quan tâm Đã có nhiều loại nấm dược liệu, có nấm Lim nghiên cứu Nấm Lim tên khoa học Ganoderma lucidum (Leyss Ex Fr.) Karst, loại nấm thuộc chi nấm linh chi Nấm Lim có khả phân giải cellulose gỗ Lim thành chất dinh dưỡng phân bố rừng nguyên sinh khu vực nhiệt đới có lượng mưa nhiều, độ ẩm cao Ở Việt Nam, nấm Lim tìm thấy nhiều Quảng Nam hậu thổ nhưỡng phù hợp cho gỗ Lim phát triên Hiện tìm thấy khu vực rừng Trường Sơn, phia nam Lào Tây Nguyên Nấm Lim loại nấm mọc tự nhiên gốc lim bị khai thác Tuy nhiên, nấm Lim có nguồn gốc từ vùng đất Tiên Phước, Quảng Nam (hay gọi ngăn gọn nấm Lim Quảng Nam) thu hút nhiều quan tâm Nguyên nhân hậu thổ nhưỡng nơi không phù hợp cho loại dược liệu phát triên mà cho nấm Lim có nhiều dược chất quý nấm loài mọc khu vực địa lý khác Nấm Lim có vị tri quan trọng nhu cầu thuốc thảo dược, gọi tên "thần dược", "siêu thần dược", "nấm thần kỳ"… Theo nghiên cứu cho thấy nấm Lim có tác dụng dùng đê hỗ trợ, phong ngừa điều trị bệnh ung thư, xơ gan, gan nhiễm mỡ, bệnh gout, mỡ, điều hoa huyết áp, viêm khớp, tiêu đường, giải độc, giảm q trình lão hóa, tăng cường hệ miễn dịch, nâng cao thê trạng… Do nấm Lim có nhiều cơng dụng có giá trị kinh tế nên có số cơng trình nghiên cứu nấm Lim giới Việt Nam Việt Nam nước có hậu nhiệt đới gió mùa ẩm nên thuận lợi cho việc sinh trưởng phát triên loại nấm đặc biệt loại nấm thuộc họ nấm Lim Đê chọn lọc tạo giống nấm Lim chất lượng tốt, suất cao việc thu nhận, đánh giá mức độ đa dạng di truyền dong nấm Lim tự nhiên cần thiết Việc giúp thấy dong nấm Lim phân bố khu vực sinh thái khác có khác hay khơng? Chúng kiêu gen hay khác kiêu gen? Từ chọn thê nấm Lim tự nhiên làm giống gốc phù hợp Do vậy, thực đề tài: “Đánh giá đa dạng di truyền nấm Lim (Ganoderma lucidum (Leyss Ex Fr.) Karst) thơng qua hình thái thị phân tử” PHẦN TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Đặc điểm nấm Lim xanh 1.1.1 Đặc điểm sinh học Tên khoa học: Ganoderma lucidum (Leyss Ex Fr.) Karst Tên đồng nghĩa: Polyporum lucidus W Curt Tên khác: vạn niên nhung, tiên thảo, nấm trường thọ Thuộc chi: Ganoderma (nấm Linh chi) Thuộc họ: Ganodermataceae (họ nấm Lim) Bộ nấm lỗ: Anphyllophorales Lớp phụ: Hymenomycetidae Lớp: Hymenomycetes Ngành phụ: Basidiomycotiana Ngành nấm thật: Eumycota Giới nấm: Fungi Nấm Lim loại nấm phá gỗ (có khả phân giải trực tiếp cellulose thành chất dinh dưỡng) phân bố vùng có tán lớn, thuộc khu vực nhiệt đới có lượng mưa nhiều, độ ẩm không tương đối cao, it ánh sáng Loại nấm mọc Lim chết mục nát tìm thấy cánh rừng rậm nguyên sinh chưa chịu tác động người [8] Tùy nơi, điều kiện cụ thê nấm Lim có màu săc, kich thước, thành phần hóa học giá trị dược liệu khác Ở Việt Nam, loại nấm tìm thấy cánh rừng khu vực Tây Nguyên, phia Nam dãy Trường Sơn giáp biên giới Lào, khu vực rừng Yên Tử Quảng Ninh Băc Giang Đặc biệt Quảng Nam nơi có nhiều nấm Lim hậu thổ nhưỡng phù hợp cho Lim phát triên 1.1.2 Đặc điểm hình thái Nấm Lim loại nấm hóa gỗ, thê nấm gồm phần: cuống nấm mũ nấm YB1 D18 Hình 3.1 Hình ảnh thể xuất xứ (dòng) nấm Lim tự nhiên thu nhận đươc 27 Như vậy, có thê thấy đa dạng hình thái thê nấm xuất xứ (dong) nấm Lim tự nhiên thu nhận Bước đầu cho thấy có đa dạng di truyền xuất xứ (dong) nấm Lim thơng qua hình thái thê Do địa bàn thu nhận thê nấm Lim tự nhiên có đặc điêm địa lý điều kiện sinh thái tương đối khác biệt Điều tạo sai khác điều kiện sinh sống tự nhiên dong nấm, có thê góp phần tạo tinh đa dạng di truyền dong nấm tự nhiên Đê thấy rõ đa dạng di truyền xuất xứ (dong) nấm Lim thu nhận được, tiếp tục đánh giá thông qua thị ISSR 3.2 Kết đánh giá đa dạng di truyền xuất xứ (dịng) nấm Lim thơng qua thị ISSR 3.2.1 Kết tách chiết DNA 11 mẫu nấm Lim Xanh Thực tách chiết DNA thông theo phương pháp Doyle and Doyle (1987) Kết tách chiết DNA 11 mẫu nấm Lim cho nồng độ DNA cao, độ tinh tốt (Bảng 3.3) Các mẫu DNA sau tách chiết tinh đủ điều kiện đê thực phản ứng ISSR Bảng 3.3 Kết đo độ tinh nồng độ DNA tổng số 11 mẫu nấm Lim Xanh Tên STT mẫu Nồng độ OD260/OD280 Tên DNA STT mẫu Nồng độ OD260/OD280 (µg/µL) DNA (µg/µL) YB1 1,90 194.9 BL8 1,90 445.7 D18 1,94 248.4 DR9 1,84 758.8 BL4 1,88 692.8 DR15 2,01 333.8 LX2 1,95 312.0 10 UB5 1,93 496.1 BL6 1,82 829.9 11 UB1 1.97 455.5 DR11 1,86 554.6 Từ kết đo quang phổ hấp phụ DNA cho thấy DNA tổng số tách chiết có độ tinh nguyên vẹn cao nằm khoảng từ 1,82 đến 28 2,01 Ngoài ra, nồng độ DNA đạt tiêu chuẩn cho phản ứng PCR với nồng độ khoảng từ 194.9 đến 829.9 ng/µL Kết hồn tồn đáp ứng cho phản ứng PCR-ISSR Từ kết trên, DNA pha loãng đến nồng độ 100 ng/µL đê sử dụng cho phản ứng PCR-ISSR 3.2.2 Kết thực phản ứng PCR-ISSR Nồng độ DNA ảnh hưởng lớn đến đa hình mẫu, sau tách chiết DNA tổng số, tiến hành đo hàm lượng DNA pha loãng đến nồng độ thich hợp đê thực phản ứng ISSR Phản ứng PCR thực với thành phần chu trình nhiệt nêu phần phương pháp với mồi ISSR kết sau: 3.2.2.1 Chạy phản ứng ISSR vơi thị KA5 Đê nghiên cứu quan hệ di truyền giưa dong thông, sử dụng thị ISSR bảng 2.4 Sau hoàn thành phản ứng PCR sản phẩm điện di gel agarose 1,5% đê phân tich đa hình DNA mẫu nghiên cứu Các băng DNA thu được phân tich dựa có mặt hay văng mặt chúng mẫu nghiên cứu Nếu xuất phân đoạn DNA ký hiệu 1, khơng có ký hiệu Nhưng băng DNA vị tri mà có mẫu khơng có mẫu khác gọi băng DNA đa hình Dựa vào mức độ đa hình băng có thê đánh giá mức độ khác giống giưa mẫu nghiên cứu Hình 3.2 Kết PCR 11 xuất xứ (dòng) nấm Lim với mồi KA5 29 Trên hình 3.2 ta có thê thấy đánh giá đa dạng 11 giống nấm Lim với thị KA5 18 băng vị tri khoảng 300 đến 1600 bp bảng sau: Bảng 3.4 Kết đánh giá 11 xuất xứ (dòng) nấm Lim với thị KA5 Băng STT DNA YB1 D18 BL4 LX2 BL6 DR11 BL8 DR9 DR15 UB5 UB1 300 0 0 0 0 0 350 0 0 0 0 370 0 0 0 0 400 0 0 0 0 0 450 0 0 0 1 470 1 0 1 480 0 0 0 0 0 500 0 0 0 0 530 0 0 0 0 10 550 1 1 1 0 11 600 0 0 0 0 0 12 750 0 0 0 0 0 13 800 0 0 0 0 0 14 970 1 0 0 1 15 1100 0 0 0 0 0 16 1200 0 0 0 0 17 1350 0 0 0 18 1600 1 0 1 1 Kết thê Bảng 3.3 cho thấy 18 băng DNA thu băng đa hình với số phân đoạn đa hình thu 41 3.2.2.2 Chạy phản ứng ISSR vơi mồi LC-46 30 Hình 3.3 Kết PCR 11 xuất xứ (dòng) nấm Lim với mồi LC-46 Băng STT DNA YB1 D18 BL4 LX2 BL6 DR11 BL8 DR9 DR15 UB5 UB1 250 1 0 0 0 270 0 0 0 1 290 0 0 0 0 320 0 0 0 0 350 0 0 0 0 370 0 0 0 0 1 400 1 0 0 0 0 450 0 0 0 0 470 0 1 0 0 10 490 0 0 0 0 0 11 500 0 0 0 0 12 530 0 1 1 1 0 13 600 0 1 0 1 14 650 0 0 1 15 700 1 0 0 0 0 16 750 0 0 0 0 17 770 0 0 0 0 18 820 0 0 0 1 19 1000 0 0 0 0 20 1100 0 0 0 0 31 Bảng 3.5 Kết đánh giá 11 xuất xứ (dòng) nấm Lim với thị LC-46 Kết thê bảng 3.5 cho thấy tổng số 20 băng DNA thu băng đa hình với tất 50 phân đoạn thu phân đoạn đa hình 3.2.2.3 Chạy phản ứng ISSR vơi mồi BA3 Hình 3.4 Kết PCR 11 xuất xứ (dòng) nấm Lim với mồi BA3 Bảng 3.6 Kết đánh giá 11 xuất xứ (dòng) nấm Lim với thị BA3 Băng STT DNA YB1 D18 BL4 LX2 BL6 DR11 BL8 DR9 DR15 UB5 UB1 300 1 1 1 1 400 0 0 0 0 0 500 1 1 1 1 1 550 1 1 0 600 1 0 1 0 0 700 1 1 0 1 750 0 0 0 0 0 800 0 0 0 0 900 0 0 0 0 10 950 0 0 0 0 11 970 0 0 0 0 32 12 1000 0 1 0 0 0 13 1200 0 0 0 0 14 1300 0 0 0 0 15 1350 0 0 0 0 16 1400 0 0 0 1 17 1500 0 0 0 0 0 18 1600 1 0 1 1 19 2300 0 0 0 0 0 Kết thê bảng 3.6 cho thấy 18 tổng số 19 băng DNA thu băng đa hình với số phân đoạn đa hình 55 tổng số 66 phân đoạn thu 3.2.3 Kết phân tích đa hình mồi ISSR với 11 mẫu nấm Lim Xanh Kết phân tich 11 xuất xứ (dong) nấm Lim với thị ISSR thu tổng số 120 phân đoạn DNA, 118 phân đoạn đa hình chiếm 98,42 % Kich thước phân đoạn nằm khoảng 250 đến 2300 bp Bảng 3.7 Ty lệ băng đa hình thu mồi ISSR với 11 xuất xứ (dòng) nấm Lim Xanh STT Tên mồi Kích thước (bp) Số băng Số băng Ty lệ băng DNA quan DNA đa DNA đa sát hình hình (%) F826 300-1500 11 11 100 BA3 300-2300 19 18 95 KA5 300-1600 18 18 100 LC-46 250-1100 20 20 100 LC-48 250-1150 16 16 100 LC-49 250-1400 18 17 94 LC-69 300-1500 18 18 100 Tổng 120 118 Trung bình 17,14 16,85 33 98,42 3.2.4 Quan hệ di truyền 11 xuất xứ (dòng) nấm Lim Xanh 3.2.4.1 Hệ số tương đồng di truyền 11 xuất xứ (dòng) nấm Lim Xanh Hệ số tương đồng Jaccards sử dụng đê đánh giá mối quan hệ di truyền 11 xuất xứ (dong) nấm Lim Kết mối quan hệ di truyền 11 xuất xứ (dong) nấm Lim trình bày bảng 3.8 Kết cho thấy hệ số tương đồng đạt từ 0.137 đến 0.423 cho thấy xuất xứ (dong) nấm Lim đa dạng di truyền Bảng 3.8 Hệ số tương đồng 11 xuất xứ (dòng) nấm Lim với hệ số tương đồng Jaccards YB1 D18 BL4 LX2 BL6 DR11 YB1 1.000 D18 0.290 1.000 BL4 0.219 0.236 1.000 LX2 0.206 0.200 0.228 1.000 BL6 0.138 0.191 0.174 0.137 1.000 BL8 DR9 DR15 UB5 UB1 DR11 0.233 0.164 0.240 0.218 0.111 1.000 BL8 0.254 0.255 0.264 0.365 0.170 0.255 1.000 DR9 0.288 0.250 0.304 0.351 0.109 0.296 0.321 1.000 DR15 0.281 0.263 0.273 0.423 0.137 0.288 0.392 0.375 1.000 UB5 0.215 0.278 0.196 0.340 0.222 0.255 0.283 0.276 0.315 1.000 UB1 0.254 0.208 0.148 0.269 0.250 0.229 0.313 0.278 0.347 0.370 1.000 3.2.4.2 Cây phát sinh chủng loại Cây phát sinh chủng loại hình thành dựa hệ số tương đồng Jaccards với phương pháp phân nhóm UPGMA Kết thu nhóm chinh bao gồm nhóm I gồm xuất xứ (dong) nấm YB1 D18; nhóm II gồm xuất xứ (dong) nấm LX2, DR15, BL8, DR9, UB5, UB1, DR11, BL4; nhóm III gồm chủng BL6 Ngồi ra, nhóm chinh II gồm phân nhóm phụ bao gồm phân nhóm IIa (LX2, DR15, BL8, DR9, UB5, UB1) phân nhóm IIb (DR11, BL4) (Hình 3.5) 34 Hình 3.5 Cây phân loại di truyền 11 xuất xứ (dòng) nấm Lim dựa hệ số tương đồng Jaccards Kết nghiên cứu Vũ Thị Thu Hiền cộng cho thấy sử dụng thị ISSR cho tinh đa hình hiệu so với thị RAPD Cụ thê, ty lệ phần trăm phân đoạn đa hình phân tich với thị ISSR 63,73% với thị RAPD 56,34% Tổng số phân đoạn DNA phân tich với thị ISSR 102, cao so với thị RAPD 71 phân đo ạn Sử dụng 50 thị ISSR RAPD (25 ISSR 25 RAPD) cho th có 18/25 mồi biêu tinh đa hình > 50% (chỉ thị ISSR), 5/18 mồi cho tinh đa hình 100% Trong sử dụng thị RAPD có 16/25 mồi cho tinh đa hình > 50% khơng có mồi cho tinh đa hình 100% Nguyễn Lộc Hiền cộng cơng bố: dựa dấu phân tử ISSR quần thê Nghệ khảo sát có cấu trúc nhóm tương đối rõ rệt có thê chia thành nhóm riêng biệt Nhóm I: gồm 15 cá thê (BD1, BD5, BD8, BD28, BD29, BD39, BD2, BD16, BD27, BD10, BD26, BD22, BD38, BD6, BD35) giống với hệ số tương đồng từ 0,75-1,00 Nhóm II: gồm cá thê (BD11, BD24, BD21, BD36, BD37) với hệ số tương đồng từ 0,65-0,86 Nhóm III: gồm cá thê (BD7, BD14, BD33) với hệ số tương đồng từ 0,89-0,93 Nhóm IV: riêng cá thê BD20 35 Hoàng Đăng Hiếu cộng sử dụng 10 mồi ISSR đê đánh giá mức độ đa dạng 39 mẫu ba kich thu Quảng Ninh Kết cho thấy, 10 mồi nghiên cứu có mồi có thê sử dụng đê đánh giá đa dạng quần thê ba kich, 46 phân đoạn DNA thu có 45 phân đoạn đa hình Cây phân loại xây dựng phần mềm NTSYS PC 2.1 dựa hệ số tương đồng Jaccard, thuật toán UPGMA cho thấy, 39 mẫu ba kich nghiên cứu chia thành nhóm lớn với hệ số tương đồng di truyền dao động khoảng 0,31 đến 0,88 Hệ số sai khác di truyền quần thê Nei Gst = 0,3281 hệ số trao đổi gen quần thê (gene flow) Nm= 1,0240 Điều có thê khẳng định quần thê ba kich tự nhiên nghiên cứu có đa dạng lớn mức độ phân tử Như vậy, thị ISSR sử dụng cho đánh giá đa dạng 11 mẫu nấm Lim có tinh đa hình cao Hệ số tương đồng dựa thị ISSR cho giá trị thấp chứng to xuất xứ (dong) nấm có tinh đa dạng di truyền Cây phân loại di truyền lập thành cơng với nhóm chinh 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã thu nhận 11 xuất xứ (dong) nấm Lim tự nhiên 03 huyện/thành phố tỉnh Quảng Ninh 01 huyện tỉnh Quảng Nam Đã đánh giá mức độ đa dạng di truyền 11 xuất xứ (dong) nấm Lim tự nhiên thơng qua hình thái thê nấm Đã đánh giá mức độ đa dạng di truyền 11 xuất xứ (dong) nấm Lim tự nhiên thông qua thị ISSR Các thị ISSR sử dụng cho đánh giá đa dạng 11 mẫu nấm Lim có tinh đa hình cao Hệ số tương đồng dựa thị ISSR cho giá trị thấp chứng to xuất xứ (dong) nấm có tinh đa dạng di truyền Cây phân loại di truyền lập thành cơng với nhóm chinh, bao gồm: nhóm I gồm xuất xứ (dong) nấm YB1 D18; nhóm II gồm xuất xứ (dong) nấm LX2, DR15, BL8, DR9, UB5, UB1, DR11, BL4; nhóm III gồm chủng BL6 Ngồi ra, nhóm chinh II gồm phân nhóm phụ bao gồm phân nhóm IIa (LX2, DR15, BL8, DR9, UB5, UB1) phân nhóm IIb (DR11, BL4) Kiến nghị Thu nhận thêm nhiều thê nấm Lim tự nhiên vùng sinh thái khác Việt Nam đê tiếp tục đánh giá mức độ đa dạng di truyền lồi nấm thơng qua hình thái thị phân tử ISSR 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Văn Bá, Cao Ngọc Điệp, Nguyễn Văn Thành (2005) Giáo trình nấm học NXB Đại học Cần Thơ Nguyễn Thượng Dong, Nấm Linh chi Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, năm 2007 Nguyễn Lân Dũng, Công nghệ nuôi trồng nấm - Tập 1,2 NXB Nông nghiệp, Hà Nội Vũ Đình Duy (2019) Sử dụng trình tự nucleotide vùng gen nhân (ITS-rRNA) đê xác định loài lan thuộc chi lan Hồng thảo (Dendrobium) Tạp chí Khoa học Cơng nghệ nhiệt đơi, số 18: 3-12 Vũ Thị Thu Hiền, Đinh Thị Phong, Trần Thị Việt Thanh (2011) So sánh hiệu hai thị ISSR RAPD nghiên cứu đa dạng di truyền loài Cọ khẹt (Dalbergia assamica) Hội nghị khoa học toàn quốc sinh thái tài nguyên sinh vật lần thứ Nguyễn Lộc Hiền, Tô Thị Nhựt, Huỳnh Kỳ Huỳnh Thanh Tùng (2013) Sự đa dạng di truyền quần thê nghệ (Curcuma sp.) tỉnh Bình Dương Tạp chi Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 29 (2013): 4451 Hoàng Đăng Hiếu, Chu Thị Thu Hà, Phạm Bich Ngọc, Lâm Đại Nhân, Nguyễn Thị Thúy Hường, Chu Hoàng Hà (2016) Sử dụng thị ISSR việc đánh giá đa dạng di truyền quần thê Ba kich Quảng Ninh Tạp chi Sinh học 2016, 38(1): 89-95 Trịnh Tam Kiệt (2001) Danh mục loài thực vật Việt Nam, tập 1, phần Nấm, Nhà xuất Nông nghiệp - Hà Nội Trịnh Tam Kiệt (1981) Nấm lớn Việt Nam NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 10 Nguyễn Đức Thành (2014) Các kỹ thuật thị DNA 38 nghiên cứu chọn lọc thực vật Tạp chi Công nghệ sinh học 36(3): 265-294 11 Phạm Quang Thu (1994) Nghiên cứu số đặc điêm sinh học nấm lim (Ganoderma lucidum Leyss.ex.Fr.Karst) vùng Đông Băc Việt Nam, Viện Khoa học Lâm nghiệp 12 Vũ Thị Huyền Trang, Trần Anh Khoa, Vũ Quốc Luận, Lê Thị Lý, Phạm Công Hoạt, Trần Hồng Dũng (2019) Đặc điêm di truyền trình tự lồi lan Hài hồng Paphiapedilum delenatii đặc hưu Việt Nam Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Việt Nam 61(5) 5.2019: 60-64 Tài liệu tiếng Anh 13 Arif M, Zaidi NW, Haq QMR, Singh US (2008) Genetic variability within Fusarium solani as revealed by PCR- fingerprinting based on ISSR markers Indian Phytopath 61(3), 305-310 14 Bao, X.F., Wang, X.S., Dong, Q., Fang, J.N., Li, X.Y (2002) Structural features of immunologically active polysaccharides from Ganoderma lucidum Phytochemistry 59, 175-181 15 Cao, Q.Z., Lin, Z.B (2004) Antitumor and anti-angiogenic activity of Ganoderma lucidum polysaccharides peptide Acta Pharmacology Sinnica 25 (6), 833 - 838 16 Chen, H.S., Tsai, Y.F., Lin, S., Lin, C.C., Khoo, K.H., Lin, C.H., Wong, C.H (2004) Studies on the immuno-modulating and anti-tumor activities of Ganoderma lucidum (Reishi) polysaccharides Bioorganic & Medicinal Chemistry 12 (21), 5595 - 5601 17 Doyle JJ and Doyle JL (1987) A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue Phytochem Bull 19:11-15 18 Kammatsuse K, Kajiware N, Hayashi K (1985) Studies on Ganoderma lucidum: Letficacy against hypertension and side effects, Yakugaku Zasshi; 105:531 19 Lin, Z.B (2001) Modern Research of Ganoderma lucidum, 2nd ed 39 Beijing Medical University Press, Beijing, Chapter 20 Rohlf FJ (1989) NTSYS-pc: Numerical taxonomy and multivariate analysis system, version 2.00 Exeter Publication, New York 21 Rohlf FJ (2000) NTSYS-pc: Numerical taxonomy and multivariate analysis system, version 2.2 Exeter Software, Setauket, New York 22 Toledo AV, Franco MEE, Medina R, de Remes Lenicov AMM, Balatti PA (2018) Assessment of the genetic diversity of Argentinean isolates of Beauveria bassiana (Ascomycota: Hypocreales) using ISSR markers Journal of King Saud University - Science doi.org/10.1016/j.jksus.2018.02.006 23 Weir BS (1996) Genetic Data Analysis II: Methods for Discrete Population Genetic Data Sinauer Associates, Inc Sunderland, MA 376p Website http://namgiang.quangnam.gov.vn/Default.aspx?tabid=109&Gro up=9&NID=35&gioi-thieu-khai-quat-ve-huyen-nam-giang https://quangnam.gov.vn/webcenter/portal/ubnd/pages_tin- tuc/chi-tiet?dDocName=PORTAL072221 http://quangnam.dcs.vn/Default.aspx?tabid=109&Group=128&N ID=6504&gioi-thieu-tong-quan-ve-tinh-quang-nam https://www.quangninh.gov.vn/donvi/huyenbache/Trang/ChiTiet BVGioiThieu.aspx?bvid=181 https://www.quangninh.gov.vn/donvi/huyenbache/Trang/ChiTiet BVGioiThieu.aspx?bvid=178#:~:text=Th%E1%BB%9Di%20ti%E1%BA%B Ft%20huy%E1%BB%87n%20Ba%20Ch%E1%BA%BD,0C%20v%C3%A0o %20th%C3%A1ng%206 https://hoanhbo.quangninh.gov.vn/Trang/ChiTietBVGioiThieu.a spx?bvid=154 https://uongbi.gov.vn/dieu-kien-tu-nhien-xa-hoi-thanh-pho40 p13n4332.html 41