Nghiên cứu phân loại và đánh giá đa dạng di truyền quần thể sâm (panax sp ) phân bố tự nhiên tại lâm đồng (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM _ _ LÊ NGỌC TRIỆU NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI VÀ ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ SÂM (Panax sp.) PHÂN BỐ TỰ NHIÊN TẠI LÂM ĐỒNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62.42.02.01 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NƠNG NGHIỆP Đà Lạt, 2017 ĐÀ LẠT, 2016 Cơng trình đƣợc hồn thành tại: Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: Thầy hƣớng dẫn 1: PGS TS Nguyễn Văn Kết Thầy hƣớng dẫn 2: GS TSKH Trần Duy Quý Phản biện 1: ……………………………………………… …………………………………………………………… Phản biện 2: ……………………………………………… …………………………………………………………… Phản biện 3: ……………………………………………… …………………………………………………………… Luận án đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng chấm luận án cấp nhà nƣớc họp tại: Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi ngày tháng năm 2017 Có thể tìm hiểu luận án thƣ viện: Thư viện Quốc gia Thư viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Chi sâm (Panax L thuộc họ iaceae chi th c v t m thuốc quan trọng v kinh điển Đông dược y học đại Kết từ nghiên cứu nước gần th nh phần o i v phân oại chi Panax Việt Nam có o i: P vietnamensis Ha v Grushv., P bipinnatifidus Seem., P stipuleanatus Tsai & Feng v thứ P vietnamensis var fuscidiscus K.Komatsu, S.Zhu & S.Q.Cai l taxon có phân bố t nhiên Lo i Phạm Ho ng Hộ ghi nh n n m 1970 miền Nam Việt Nam Panax schingseng Nees var japonicum Mak Trong cơng trình xuất sau đó, tác giả n y n ghi nh n s tồn taxon n y Tuy v y, t i iệu gần th nh phần o i chi Panax Việt Nam, taxon n y khơng nhắc đến Trong q trình điều tra khảo sát khu hệ th c v t vùng núi Lang Bian, phát quần thể sâm nh thuộc chi Panax mọc t nhiên có s khác biệt cấu trúc c quan dinh dư ng v sinh sản so với taxon thuộc chi Panax khác Do tái phát v thiếu iệu khoa học iên quan đến taxon n y, trước mắt cần phải có nghiên cứu chuyên sâu phân tử v s th nh phần saponin để xác định rõ vị trí phân oại hệ thống phát sinh chi Panax v bước đầu tìm hiểu khả n ng m thuốc taxon n y(được đặt tên sâm Lang Bian Bên cạnh đó, cần nghiên cứu tính đa dạng v biến động di truyền m c sở cho việc bảo tồn v phát triển Từ đó, đề t i “Nghiên cứu phân loại đánh giá đa dạng di truyền quần thể sâm (Panax sp.) phân bố tự nhiên Lâm Đồng” tiến h nh Mục tiêu đề tài Đề t i tiến h nh hướng tới mục tiêu m sáng t vị trí phân oại v quan hệ phát sinh chủng loại sâm Lang Bian taxon chi khác; tính đa dạng v biến động di truyền quần thể sâm Lang Bian, loại sâm n y có chứa saponin số taxon thuộc chi Panax hay khơng Ý nghĩa khoa học thực tiễn Kết đề t i c sở khoa học để công bố, bổ sung v o Danh ục th c v t, Sách đ Việt Nam taxon đặc hữu Góp phần m rõ th nh phần o i chi Panax Việt Nam Kết đánh giá đa dạng v biến động di truyền quần thể th c v t cho phép nh n thức rõ h n tình trạng quần thể hay tổng thể taxon Panax phân bố t nhiên Lâm Đồng, tạo c sở cho việc đề xuất phư ng án bảo tồn v phát triển tư ng Bên cạnh đó, iệu s th nh phần saponin c sở ban đầu cho việc xem xét giá trị m thuốc taxon n y Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu đề tài 4.1 Đối tƣợng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu thân taxon sâm Lang Bian, taxon Panax khác phân bố Việt Nam v giới nghiên cứu phân oại; t p hợp cá thể thuộc hai quần thể taxon n y nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể v thân rễ v rễ củ taxon thuộc chi Panax có phân bố Việt Nam nghiên cứu phân tích s th nh phần saponin 4.2 Phạm vi nghiên cứu Phạm vi chun mơn: Với hai nội dung đề t i nghiên cứu vị trí phân oại v đa dạng di truyền quần thể, s phân tích hoạt chất sâm Lang Bian, phạm vi nghiên cứu chuyên môn u n án : (1 Xác định vị trí phân oại d a phư ng pháp phân oại th c v t kinh điển d a hình thái giải phẫu; (2 Xác định vị trí phân oại v quan hệ phát sinh chủng oại d a iệu trình t DN bảo thủ nhân v ạp thể; (3 Đánh giá đa dạng di truyền quần thể d a DN fingerprint nảy sinh kỹ thu t sinh học phân tử; v (4 S phân tích hoạt chất sâm Lang Bian d a phư ng pháp phân tích hóa học kinh điển Địa điểm nghiên cứu: Điều tra, phân oại v thu th p mẫu th c địa tiến h nh vùng có phân bố taxon thuộc chi Panax Việt Nam Nghiên cứu phân oại, quan hệ phát sinh d a sinh học phân tử đa dạng v biến động di truyền quần thể th c phòng thí nghiệm sinh học phân tử Trường Đại học Đ Lạt Nghiên cứu hình thái giải phẫu, phân oại th c v t truyền thống v s th nh phần saponin th c Bảo t ng th c v t Trường Đại học Đ Lạt (DLU , Bảo t ng th c v t (VTN) v Phòng thí nghiệm hóa hợp chất thiên nhiên - Viện Nghiên cứu khoa học Tây nguyên Việc so sánh mẫu v t tiến h nh số bảo t ng, phòng ưu trữ tiêu th c v t v ngo i nước Thời gian nghiên cứu: tiến h nh từ n m 2012 đến n m 2016 Những đóng góp luận án Chứng minh s tồn th c tế taxon thuộc chi Panax, họ Araliaceae vùng núi Lang Bian, Lâm Đồng, s mở rộng phân bố chi Panax giới phía Nam Tạo c sở khoa học để công bố, bổ sung v o Danh ục th c v t, danh ục thuốc v Sách đ Việt Nam taxon đặc hữu Góp phần m rõ th nh phần o i chi Panax Việt Nam Xây d ng c sở iệu trình t DNA bảo thủ cho chủng oại sâm mới, đ ng ký ngân h ng gene giới để khẳng định chủ quyền Quốc gia nguồn t i nguyên n y Xây d ng c sở khoa học cho việc hình th nh chiến ược bảo tồn nguồn t i nguyên th c v t đặc hữu, quý thông qua kết đánh giá điều tra phân bố, nghiên cứu đa dạng v biến động di truyền quần thể Cấu trúc luận án: Phần u n án trình b y 144 trang, 35 bảng số iệu v 36 hình Khơng kể phần mở đầu trang, phần ại chia m phần: Chư ng I: Tổng quan t i iệu nghiên cứu 39 trang, Chư ng II: V t iệu, Nội dung v Phư ng pháp nghiên cứu: 17 trang, Chư ng III: Kết nghiên cứu v thảo u n: 71 trang, Phần Kết u n v Kiến nghị: trang Ngo i có phụ ục Lu n án sử dụng 141 t i iệu tham khảo, 22 t i iệu Tiếng Việt, 119 t i iệu tiếng nh Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vai trò loại nhân sâm đời sống Các nghiên cứu sâm trên giới cho thấy taxon Panax, họ iaceae o i th c v t m thuốc có giá trị kinh tế cao v thường đặt tình trạng quý hiếm, cần bảo tồn 1.2.Tổng quan phƣơng pháp nghiên cứu phân loại, khảo sát quan hệ phát sinh chủng loại taxon đánh giá đa dạng di truyền quần thể thực vật Các phư ng pháp nghiên cứu phân oại, quan hệ phát sinh chủng oại, đánh giá đa dạng di truyền quần thể d a đặc điểm hình thái v iệu phân tử c sở khoa học chúng hình th nh, ng y c ng phát triển v ứng dụng rộng rãi Đây c sở cho việc tiến h nh nghiên cứu n y 1.3 V trí hệ thống học phân loại chi Panax, họ Araliaceae Các kết nghiên cứu phân oại v hệ thống học chi Panax giới Theo đó, việc sử dụng hình thái thân rễ v rễ củ trước sau đến đặc điểm hình thái khác để phân biệt taxon phù hợp Th nh phần o i chi Panax theo tác giả khác khác đặc điểm hình thái taxon chi n y đa dạng, dẫn đến quan điểm hệ thống phát sinh tác giả không đồng Theo thời gian, ng y c ng có nhiều phát taxon phát Theo t i iệu gần nay, Việt Nam có o i v thứ có phân bố Việt Nam: P vietnamensis, P bipinnatifidus, P stipuleanatus, P vietnamensis var fuscidiscus ghi nh n thức Mặc dù Phạm Ho ng Hộ ghi nh n từ n m 1970 tên khoa học P schingseng var japonicum v hiệu chỉnh th nh P japonica cơng bố sau tác giả (1991, 1999, 2003 taxon Lâm Đồng không nhắc đến cho P vietnamensis m thiếu c sở giám định mẫu nghiên cứu sau (Nguyễn T p, 2005; Nguyễn Tiến Bân, 1996&2007; Phan Kế Long v cộng s , 2013 1.4 Quan hệ phát sinh chủng loại chi Panax L dựa hệ thống học mức độ phân t Để xây nghiên cứu mối quan hệ phát sinh taxon th c v t nói chung v chi Panax nói riêng, nh nghiên cứu trước sử dụng sử dụng trình t vùng bảo thủ cách riêng rẽ hay phối hợp v biện u n cho kết đặc điểm hình thái v phân bố taxon Hai hướng nghiên cứu bao gồm: nghiên cứu không d a v o giải trình t DN m d a v o đặc điểm DN fingerprint, nghiên cứu d a giải trình t vùng DN bảo thủ Trung gian hai hướng nghiên cứu sử dụng DN fingerprint từ vùng DN bảo thủ Việc sử dụng vùng DNA bảo thủ để hỗ trợ cho phân oại nghiên cứu o i thuộc chi Panax khác tác giả Các vùng trình t 18S rRN ; ITS1-5,8S rRNA -ITS2 v phần gene matK t thích hợp nghiên cứu n y c sở khoa học việc ứng dụng trình t n y chứng minh 1.5 Các nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền quần thể chi Panax Nhiều kỹ thu t sinh học phân tử có kỹ thu t ISSR sử dụng để m xuất thị đa hình đủ để đánh giá đa dạng di truyền hai mức độ: v quần thể o i thuộc chi Panax Việc khảo sát đa dạng di truyền quần thể nghiên cứu trình b y xoay quanh tiêu chí: mức độ tư ng đồng di truyền cá thể t p hợp mẫu, tỷ ệ band đa hình (PPB , mức độ dị hợp hay số đa dạng gene (He , số biệt hóa gene v khoảng cách di truyền t p hợp mẫu (GST v D v số di cư (Nm) 1.6 Nghiên cứu thành phần hoạt chất chi Panax Các nghiên cứu mặt hóa học chi Panax tiến h nh v ngo i nước th nh phần hoạt chất nhóm dược iệu quý n y taxon riêng rẽ Có thể xem c sở để tham khảo, định hướng v ứng dụng phư ng pháp cho nghiên cứu so sánh th nh phần saponin đối tượng nghiên cứu v taxon khác thuộc chi Panax 1.7 Nhận xét chung Kết từ nghiên cứu đối tượng chi Panax có trước v iệu iên quan từ Genbank nguồn tham khảo v so sánh tốt nghiên cứu phân oại v quan hệ phát sinh, đánh giá đa dạng v biến động di truyền quần thể v nghiên cứu th nh phần hoạt chất (các saponin taxon Panax Những điều nêu góp phần định hướng cho nghiên cứu n y mặt học thu t Chƣơng VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1.Vật liệu cho nghiên cứu v trí phân loại quan hệ phát sinh chủng loại sâm Lang Bian taxon Panax khác: mẫu thuộc taxon Panax Việt Nam v mẫu o i Polyscias fruticosa (L.) Harm để nghiên cứu giải phẫu hình thái v m tiêu khô: mẫu v t cần thu bao gồm: thân rễ, thân củ, lá, hoa, (to n để m tiêu khô v ưu giữ Viện Nghiên cứu Khoa học Tây nguyên 03/05 mẫu tiêu sâm Lang Bian với mẫu thuộc o i Panax định tên có phân bố Việt v chuẩn ngoại (outgroup o i Polyscias fruticosa sử dụng so sánh, đánh giá quan hệ phát sinh chủng oại Trình t DN bảo thủ mẫu thu th p công bố Genbank (NCBI) Các trình t vùng DN bảo thủ tư ng ứng số taxon Panax công bố Genbank sử dụng m chuẩn nội (cùng taxon với taxon thu mẫu Việt Nam v để so sánh kết v phân tích quan hệ phát sinh (P quinquefolius, P japonicus, P pseudoginseng) 2.1.2 Vật liệu cho nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể sâm Lang Bian: mẫu từ t p hợp cá thể phát thuộc quần thể sâm Lang Bian, trừ cá thể giữ nguyên vẹn để m tiêu 2.1.3 Vật liệu để nghiên cứu sơ thành phần saponin sâm Lang Bian: thân rễ, rễ củ taxon thuộc chi Panax phân bố Việt Nam 2.2 Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu vị trí phân oại, quan hệ phát sinh chủng oại sâm Lang Bian v số taxon Panax khác d a trình t DNA bảo thủ v đặc điểm hình thái - Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền quần thể sâm Lang Bian - Nghiên cứu phân tích, so sánh s th nh phần saponin sâm Lang Bian v số taxon chi khác 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1.Điều tra, thu thập mẫu: tiến h nh theo phư ng pháp nghiên cứu th c v t K ein v K ein (1970), v Nguyễn Nghĩa Thìn (2007 2.3.2 Nghiên cứu hình thái nhằm bổ sung liệu cho xác đ nh v trí phân loại sâm Lang Bian: theo phư ng pháp K ein v K ein (1970 v Nguyễn Nghĩa Thìn (2007), bao gồm bước triển khai th c địa v nghiên cứu phòng thí nghiệm Các đặc điểm hình thái sâm Lang Bian taxon Panax khác so sánh với v với mô tả gốc với tiêu ưu giữ bảo t ng th c v t Việt Nam v giới 2.3.3 Tách chiết DNA kiểm tra chất lƣợng, hàm lƣợng DNA: Mẫu cá thể tiến h nh tách chiết DN theo quy trình CT B I cải tiến Kiểm tra chất ượng v nồng độ DN theo phư ng pháp đo OD Weising v cộng s (2005) 2.3.4 Phân loại, phân tích quan hệ phát sinh chủng loại dựa trình tự bảo thủ 2.3.4.1 Phân lập khuếch đại vùng DNA bảo thủ Các trinh t DNA bảo thủ khuếch đại PCR với mồi đặc hiệu v điều kiện phản ứng cải biến từ phư ng pháp sử dụng nghiên cứu có trước, với phần gene matK: theo Zuo v cộng s (2011), với vùng ITS1 – 5,8S rRNA – ITS2: theo Ngan v cộng s (1999 v với Gene 18S rRNA: theo Komatsu v cộng s (2001) 2.3.4.2 Phân tích quan hệ phát sinh chủng loại dựa trình tự DNA bảo thủ cao Các trình t có thơng qua việc giải trình t với trình t tư ng ứng từ Genbank sử dụng để phân tích đặc điểm trình t v quan hệ phát sinh taxon khảo sát cách sử dụng phần mềm MEG 5.1 Các vùng DN thuộc gene nhân v gene ạp thể sử dụng riêng rẽ v sau phối hợp để phân tích quan hệ phát sinh taxon khảo sát Tính bất tư ng đồng có t p hợp trình t khảo sát phối hợp phân tích quan hệ phát sinh kiểm tra công cụ Incongruence Length Difference (ILD phần mềm PAUP* (Swofford, 2003) 2.3.5 Phân tích đa dạng biến động di truyền quần thể dựa DNA fingerprint nảy sinh kỹ thuật ISSR 2.3.5.1 S dụng kỹ thuật ISSR để hình thành DNA fingerprint Khuếch đại DNA: Phản ứng PCR th c với dung tích 20 µ chứa mM MgC 2, 0,25 mM oại dNTP, 1U Taq DN po ymerase (ThermoScientific , 0,2 µM mồi v khoảng 30 ng khn mẫu DN Quá trình khuếch đại DN tiến h nh máy uân nhiệt Peqstar 96X Universa Gradient (Germany với chư ng trình nhiệt sau: Bước biến tính 94 0C phút; 10 chu kỳ, chu kỳ có tiến trình nhiệt 94 0C 45 giây, nhiệt độ gắn mồi thích hợp +5 (Ta +5) 0C (Ta khoảng 50-570C tùy mồi) 45 giây, giảm dần 0,50C/chu kỳ, kéo d i mạch 720C phút 30 giây; 36 chu kỳ, chu kỳ có tiến trình nhiệt 94 0C 45 giây, nhiệt độ bắt mồi thích hợp (Ta) 45 giây, kéo d i mạch 720C phút 30 giây; Bước kéo d i mạch cuối 720C 15 phút Chọn lọc mồi: Khảo sát t p hợp 45 mồi sử dụng nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể o i chi với đối tượng nghiên cứu mẫu DN chọn ngẫu nhiên từ mẫu thu th p thử nghiệm khuếch đại với mồi để s ng ọc mồi với tiêu chí ghi nh n sản phẩm khuếch đại, có band đa hình Ghi nhận DNA fingerprint thị ISSR: Sản phẩm khuếch đại phân tách ge agarose 2%, sử dụng đệm TBE với điện 60 Vo t giờ, ge sau điện di nhuộm với ethidium bromide (0,5 µg/m , v chụp ảnh ánh sáng c c tím có bước sóng 254/312 nm hệ thống Micro Doc Ge Documentation (Mỹ) 2.3.5.2 Phân tích đa dạng biến động di truyền dựa DNA fingerprint thu nhận đƣợc Phần mềm Microsoft Office Exce 2007 sử dụng để tính tốn thơng số đa dạng v biến động di truyền Các thông số n y bao gồm: tỷ ệ phần tr m band đa hình (percentage of po ymorphic bands - PPB , mức độ dị hợp trơng đợi trung bình/chỉ số đa dạng gene (the average expected heterozygosity - He , số biệt hóa di truyền t p hợp mẫu (gene differentiation among sample sets –GST , khoảng cách di truyền t p hợp mẫu (the genetic distance among samp e sets - D v số dòng gene hay số ượng cá thể di cư trung bình (Nm) Cơng thức tính tốn thơng số theo phư ng pháp de Vicente v cộng s ( 2003 Phần mềm chuyên dụng NTSYSpc 2.1 (Rohlf, 2004) sử dụng để tính tốn hệ số tư ng đồng di truyền cặp mẫu khảo sát v xây d ng s đồ dạng quan hệ di truyền mẫu, sử dụng phư ng pháp p nhóm UPGM 2.3.6 Sơ phân tích, so sánh thành phần saponin Đối tượng để so sánh s th nh phần hóa học với sâm Lang Bian (ký hiệu : PVL taxon có quan hệ gần với gồm Panax vietnamensis (PV v P vietnamensis var fuscidiscus (PVF v hai biến thể dạng o i P stipuleanatus [ chét nguyên (PS v chét xẻ (PSDL)] Các hoạt chất phân tích chất sau: G-Rb1, G-Rg1, G-Rd, G-Re, N-R1, M-R2 Phân tích định tính sắc ký ớp m ng theo phư ng pháp Ho ng Hải nh v cộng s (2011 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 V trí phân loại, quan hệ phát sinh chủng loại sâm Lang Bian số loài Panax khác dựa đặc điểm hình thái trình tự DNA bảo thủ 3.1.1 V trí phân loại sâm Lang Bian dựa đặc điểm hình thái Đặc điểm hình thái taxon sâm Lang Bian Cây có dạng thân thảo, âu n m, cao 50-90 cm Thân rễ dạng đốt, thường bò ngang, đường kính 1-2,5cm, đốt xếp gần với khoảng cách đốt từ 2-5cm, mặt bên ngo i có m u nâu v ng Rễ củ gắn v o phần thân rễ, dạng phồng ớn, có hình chóp hay gần dạng hình nón, kích thước 3-5 × 2-4cm Thân khí sinh thẳng, mảnh, nhẵn với phần õi xốp, mang kép chân vịt với 3, kép mọc vòng đỉnh Hình 3.9 Cây quan hệ phát sinh dựa phần gene matK taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp ML s dụng chuẩn ngoại Cây quan hệ chủng oại NJ tư ng ứng có hình thể tư ng t Qua quan hệ phát sinh, nh n thấy sâm Lang Bian, Panax vietnamensis, Panax vietnamensis var fuscidiscus v chuẩn nội P bipinnatifidus p nhóm với nhau, v y chuẩn nội P bipinnatifidus có hình thái v thân rễ ho n to n khác với taxon ại Do v y đề xuất Panax sp th nh thứ P vietnamensis hợp ý h n P bipinnatifidus S khác biệt trình t gene matK Panax sp v P vietnamensis v P vietnamensis var fuscidiscus thể vị trí 221, 388, 469, 535, 558, 566, 593, 594 v 602 Như v y, trình t phần vùng gene matK dùng để nh n dạng s khác biệt nhóm taxon gồm sâm Lang Bian v taxon so sánh, s sai biệt hai taxon: P vietnamensis var fuscidiscus v P japonicus var bipinnatifidus Mặt khác, taxon P bipinnatifidus thu th p Việt Nam có sai khác ớn so với chuẩn nội Taxon Polycias fruticosa thể vai trò chuẩn ngoại xem xét tổng thể ớn h n gồm nhiều taxon khác họ 3.1.2.2 Quan hệ phát sinh chủng loại sâm Lang Bian taxon chi dựa vùng trình tự ITS1 – 5,8S rRNA – ITS2 Sau c n trình t , xác p vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 tư ng ứng với tất trình t đại diện cho taxon chọn để khảo sát, tiến h nh r sốt, so sánh, trình t ITS1 – 5,8S rRNA – ITS2 d i 595 đến 608 nuc eotide có được, taxon Panax khảo sát khác 74 vị trí: 14, 29, 42, 43, 54, 60, 82, 83, 101, 103, 104, 109, 112, 115, 116, 117, 128, 139, 151, 162, 175, 176, 179, 182, 178, 189, 201, 203, 217, 274, 281, 340, 11 350, 364, 384, 400, 404, 406, 407, 414, 416, 417, 418, 425, 429, 444, 462, 465, 466, 467, 470, 476, 481, 489, 493, 496, 498, 509, 526, 532, 546, 548, 554, 562, 564, 582, 583, 587, 589, 590, 592, 596, 598, 600 Điều cho thấy độ d i v th nh phần nuc eotide vùng ITS1– 5,8SrRNA–ITS2 biến động mạnh t p hợp taxon khảo sát, thể tiềm n ng ớn việc phân biệt taxon chi Panax Sâm Lang Bian có số ượng nuc eotide thuộc vùng ITS1 ITS1–5,8SrRNA–ITS2 giống với P vietnamensis v P vietnamensis var fuscidiscus c sở cho thấy ba taxon n y có quan hệ gần với Sâm Lang Bian có khác biệt từ 0,41 – 2,93% so với taxon khác chi Các trình t vùng ITS1 – 5,8S rRNA – ITS2 P stipuleanatus, P bipinnatifidus thu th p Việt Nam v chuẩn nội P stipuleanatus tư ng đồng ho n to n chúng khác với trình t chuẩn nội P bipinnatifidus mức 2,56% Với trình t có được, tiến h nh phân tích mối quan hệ phát sinh chủng oại, thu nh n quan hệ phát sinh thể hình 3.12 Hình 3.12 Cây quan hệ phát sinh dựa vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Maximum likelihood Cây quan hệ phát sinh NJ tư ng ứng có hình thể tư ng t Có thể nh n thấy sâm Lang Bian, P vietnamensis v P vietnamensis var fuscidiscus p nhóm chặt chẽ với nhau, cho thấy việc đề xuất sâm Lang Bian th nh thứ P vietnamensis hợp ý Kết r soát cho thấy sâm Lang Bian khác với P vietnamensis v P vietnamensis var fuscidiscus vị trí: 217, 384, 465, 532, 554, 562, 589, 590 v 598 Như v y, trình t vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 dùng để nh n dạng sai khác sâm Lang Bian với taxon so sánh, nhiên không 12 thể s sai biệt hai taxon P stipuleanatus v P bipinnatifidus thu th p nghiên cứu n y 3.1.2.3 Quan hệ phát sinh chủng loại sâm Lang Bian taxon chi khác dựa trình tự vùng gene 18S rRNA Sau c n trình t , xác p vùng tư ng ứng với tất taxon, vùng gene 18S rRN taxon có độ d i 1808 đến 1809 nuc eotide, sâm Lang Bian khác với taxon so sánh vị trí 233, 499, 712, 714, 729 S sai khác n y chứng t tính bảo thủ cao mức độ vùng gene 18S rRN chi Panax Kết n y tư ng đồng với nghiên cứu trước Khoảng cách di truyền sâm Lang Bian, P vietnamensis, P quinquefolius v P vietnamensis var fuscidiscus từ nguồn t thu th p hay từ Genbank không Các taxon P stipuleanatus, P bipinnatifidus thu th p nghiên cứu n y v chuẩn nội P stipuleanatus có trình t vùng gene 18S rRN tư ng đồng ho n to n, khác với chuẩn nội P japonicus var bipinnatifidus (Genbank Điều n y ại ần cho thấy mẫu cho P bipinnatifidus thu th p nghiên cứu n y có s tư ng đồng với taxon P stipuleanatus Sử dụng trình t có để tiến h nh phân tích mối quan hệ phát sinh chủng oại, thu quan hệ phát sinh thể hình 3.16 Hình 3.16 Cây quan hệ chủng loại dựa vùng gene 18S rRNA taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Maximum likelihood Cây quan hệ phát sinh Neiborgh joining tư ng ứng có hình thể tư ng t 13 Sâm Lang Bian, P vietnamensis, P vietnamensis var fuscidiscus v P quinquefolius p nhóm với s tư ng đồng ho n to n trình t Nếu d a trình t vùng gene 18S rRN khơng thể phân biệt taxon khác chi, ại đóng vai trò quan trọng việc thể s p nhóm với taxon 3.1.2.4 Khảo sát quan hệ phát sinh dựa vào việc phối hợp vùng trình tự 18S rRNA, ITS1-5,8S rRNA-ITS2 phần gene matK Trong nghiên cứu n y, việc sử dụng trình t vùng bảo thủ riêng rẽ n o có nhược điểm: với trình t phần gene matK: chuẩn ngoại thể vai trò xét tổng thể ớn h n, phân biệt hai taxon P vietnamensis var fuscidiscus v P japonicus var bipinnatifidus s tư ng đồng trình t ; với trình t ITS1-5,8S rRNA-ITS2: chưa phân tách P bipinnatifidus từ nhóm taxon P stipuleanatus; v với trình t gene 18S rRN : khơng thể phân tách sâu taxon khảo sát S p nhóm taxon Panax d a các vùng riêng rẽ có s khơng đồng taxon P japonicus, P japonicus var bipinnatifidus v P quinquefolius Nếu sử dụng riêng rẽ vùng khơng phản ánh mức đầy đủ mối quan hệ phát sinh có iệu từ ba vùng DN barcode So tis (1999 v Qiu (1999 việc phân tích quan hệ phát sinh d a việc phối hợp trình t có gene khác có ý nghĩa h n việc xây d ng quan hệ phát sinh chủng oại d a v o gene riêng rẽ Trong nghiên cứu n y, ba trình t khảo sát riêng nói phối hợp để nghiên cứu quan hệ phát sinh chủng oại Kết kiểm tra tính bất tư ng đồng có t p hợp trình t khảo sát phối hợp phân tích quan hệ phát sinh chủng oại kiểm tra công cụ Incongruence Length Difference (ILD phần mềm P UP* cho thấy phối hợp trình t theo phư ng pháp khác nhau, giá trị P ớn h n 5%, cho thấy tính bất tư ng đồng phối hợp trình t không (Jonh v cộng s , 1996 Số nuc eotide trình t phối hợp dao động từ 3.222 đến 3.235 Sâm Lang Bian, P vietnamensis v P vietnamensis var fuscidiscus có chung số nuc eotide ớn nhất, cho thấy chúng gần mặt di truyền Khoảng cách di truyền sâm Lang Bian so với taxon khảo sát khác từ 0,0016 đến 0,0161 Từ khoảng cách di truyền thu nh n được, nh n thấy rằng: 14 - Trình t P vietnamensis v P stipuleanatus từ Ganbank tư ng đồng với taxon tư ng ứng Việt Nam Các taxon khảo sát phân biệt ngoại trừ trường hợp P bipinnatifidus thu th p nghiên cứu n y phân biệt với P stipuleanatus - Sâm Lang Bian có khoảng cách di truyền so với P vietnamensis 0,16% v so với P.vietnamensis var fuscidiscus 0,28%, khoảng cách di truyền P vietnamensis so với P.vietnamensis var fuscidiscus 0,19% cho thấy dù sâm Lang Bian gần với P vietnamensis khác biệt với P.vietnamensis var fuscidiscus Đây c sở để xếp sâm Lang Bian th nh thứ P vietnamensis Tiến h nh phân tích mối quan hệ phát sinh chủng oại d a trình t có sau oại b bớt chuẩn nội tư ng đồng, kết thu quan hệ phát sinh hình 3.18 Hình 3.18 Cây quan hệ phát sinh dựa phối hợp vùng gene 18S rRNA, vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 phần gene matK taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Maximum likelihood Cây quan hệ phát sinh d a trình t phối hợp tư ng ứng d a phư ng pháp Neiborgh joining có hình thể tư ng t Có thể nh n thấy s p nhóm chặt chẽ ba taxon sâm Lang Bian, P vietnamensis v P vietnamensis var fuscidiscus Giá trị bootstrap nút phân nhánh đối tượng nghiên cứu với taxon ại nhóm đạt 99 Như v y d a v o trình t phối hợp ba vùng bảo thủ cho thấy việc xác định taxon nghiên cứu th nh thứ P vietnamensis hợp ý Điểm chưa hợp ý kết s giống hệt trình t taxon P bipinnatifidus thu th p, giải trình t nghiên cứu n y với taxon P stipuleanatus ại khác xa với taxon P japonicus var bipinnatifidus (có tên đồng nghĩa P bipinnatifidus m ẽ phải có quan hệ gần Vấn đề n y tìm hiểu v ý giải sau: 15 + Lo i P bipinnatifidus Việt Nam xác định chủ yếu d a hình thái xẻ thùy, vốn có s khác biệt rõ r ng so với taxon P stipuleanatus với khu phân bố L o Cai v Lai Châu, Việt Nam Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu trước đây, số taxon chi Panax ghi nh n có đặc điểm chét xẻ v chét nguyên (Wen v Zimmer, 1996; Guo v cộng s , 2010) Khuynh hướng phân oại d a hình thái thân rễ v rễ củ trước, tiếp đến đặc điểm khác Hara (1970 đề nghị chưa sử dụng với taxon cho P bipinnatifidus Việt Nam + Đặc điểm hình thái mẫu cho P bipinnatifidus thu Lai Châu, Việt Nam tiêu ưu giữ Viện Dược Liệu có nhiều điểm giống với P stipuleanatus m khơng có đặc điểm nh n dạng o i P bipinnatifidus hình thái thân rễ: kéo d i v phồng ên đoạn Qua kết nghiên cứu d a đặc điểm hình thái v sinh học phân tử, taxon cho o i P bipinatifidus Việt Nam th c chất thuộc o i P stipuleanatus Khi đó, quan hệ phát sinh xây d ng ại không sử dụng chuẩn nội cho chúng thể hình sau: Hình 3.21 Cây quan hệ phát loại thức dựa phối hợp vùng gene 18S rRNA, vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 phần gene matK taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Maximum likelihood Cây quan hệ phát sinh d a trên trình t phối hợp tư ng ứng d a phư ng pháp Neiborgh joining có hình thể tư ng t Như v y, d a kết nghiên cứu phân oại v quan hệ phát sinh chủng oại mức độ phân tử kết hợp thêm iệu hình thái, cho phép khẳng định sâm Lang Bian thứ o i Panax vietnamensis Ha et Grushv var vietnamensis với tên khoa học P 16 vietnamensis var langbianensis N.V Duy, V.T Tran & L.N Trieu v tên Việt đề xuất Sâm Lang Bian 3.2 Đánh giá đa dạng di truyền quần thể sâm Lang Bian 3.2.1 Kết thu thập, chuẩn b mẫu chọn lọc mồi phục vụ cho đánh giá đa dạng di truyền quần thể Mẫu thu từ hai quần thể phát thông qua trình điều tra cách 25-30 km theo đường chim bay nằm hai huyện Đam Rông v Lạc Dư ng, tỉnh Lâm Đồng Tên quần thể theo ký t viết tắt địa danh n i phân bố: quần thể Lạc Dư ng ký hiệu LD (64 mẫu , quần thể Đam Rông ký hiệu DR (51 mẫu Sau thử nghiệm, 20 số 45 mồi ISSR cho kết đáp ứng hai tiêu chí tạo band v band mang tính đa hình mẫu ngẫu nhiên thuộc taxon nghiên cứu Hình 3.25 Kết điện di sản phẩm PCR với mồi ISSR UBC873 quần thể LD Hình 3.27 Kết điện di sản phẩm PCR với mồi ISSR HB12 quần thể DR Tỷ ệ band đa hình mồi khác quy mô khảo sát theo chiều hướng giảm dần từ tổng thể nghiên cứu đến quần thể v đến nhóm quần thể Tỷ ệ band đa hình t p hợp mẫu quy mơ có s sai khác, hệ q trình biệt hóa di truyền 3.2.2 Kết đánh giá đa dạng di truyền quần thể LD 17 Mức độ đa dạng gene hay tính dị hợp trơng đợi HeLD = 0,228 v tỷ ệ band đa hình PPBLD = 81,5 % ghi nh n cho quần thể LD Tư ng đồng di truyền tổng thể mẫu khảo sát thuộc quần thể LD cao mẫu L47y v mẫu L51y với mức tư ng đồng 89,49%; thấp mẫu L19o v mẫu L56o với mức tư ng đồng 65,65%; trung bình mẫu tư ng đồng mức 77,80% Tính đa dạng di truyền hai nhóm tuổi thể qua số đa dạng gene v tỷ ệ band đa hình HeLD O = 0,233; PPBLD O = 77,1% v HeLD Y = 0,214; PPBLD Y = 72,4% ần ượt với nhóm tuổi ớn v nhóm tuổi nh Kết mức độ đa dạng gene n y cho thấy tính đa dạng di truyền nhóm tuổi ớn có cao h n so với nhóm tuổi nh , nghĩa có s suy giảm di truyền định cá thể ớn v nh tuổi Mức độ tư ng đồng di truyền cá thể nhóm tuổi ớn dải từ 68,46% đến 86,92%, trung bình 76,6% Ở nhóm cá thể nh tuổi, mức độ tư ng đồng di truyền cá thể dải từ 69,16% đến 89,49%, trung bình 79,1% Điều cho thấy nhóm cá thể nh tuổi có mức độ tư ng đồng di truyền với cao h n không nhiều so với nhóm cá thể ớn tuổi Những số n y phần n o cho thấy s suy giảm đa dạng di truyền trình n y D a mức tư ng đồng di truyền cặp mẫu, s đồ dạng quan hệ di truyền mẫu quần thể LD xây d ng v d a s đồ n y, cá thể thuộc hai nhóm cấp tuổi ( ớn v (nh khơng p nhóm riêng m xếp xen kẽ nhau, điều thể đặc điểm sinh sản hữu tính Tuy nhiên s xen kẽ khơng m có nhóm v i cá thể nhóm tuổi xếp gần cho thấy có s biệt hóa nh hai nhóm tuổi Chỉ số biệt hóa di truyền hai nhóm tuổi thuộc quần thể LD mức GSTLD = 0,0205 Theo hệ thống học đánh giá biệt hóa di truyền (de Vicente, 2003) s biệt hóa di truyền hai nhóm cá thể tuổi ớn v nh quần thể n y đạt mức thấp S biệt hóa di truyền mức thấp dẫn đến khoảng cách di truyền hai nhóm tuổi quần thể DLD O-Y = 0,0061, khoảng cách n y bé so với tính dị hợp trơng đợi to n quần thể LD đạt đến HeLD = 0,228 3.2.3 Kết đánh giá đa dạng di truyền quần thể DR 18 Quần thể DR có mức độ đa dạng di truyền tư ng đối cao thể qua số đa dạng gene hay tính dị hợp trơng đợi HeDR = 0,213 v tỷ ệ band đa hình PPBDR = 79,4%, số đa dạng n y thấp h n quần thể LD (HeLD = 0,228 v PPBLD = 81,5%) Tư ng đồng di truyền tổng thể mẫu khảo sát thuộc quần thể DR cao 87,62%, thấp 60,51%, trung bình 77,65% Tính đa dạng di truyền hai nhóm tuổi thể qua số đa dạng gene v tỷ ệ band đa hình HeDR O = 0,204; PPBDR O = 75,2 % v HeDR Y = 0,209; PPBDR Y = 72,7% ần ượt với nhóm tuổi ớn v nhóm tuổi nh Các số n y thấp h n so với nhóm tuổi quần thể LD (HeLD O = 0,233; PPBDL O = 77,1% v HeLD Y = 0,214; PPBDL Y = 72,4%) Mức độ tư ng đồng di truyền cá thể nhóm tuổi ớn dải từ 63,08% đến 86, 21%, trung bình 78,49% Chỉ số tư ng ứng cá thể nhóm tuổi nh dải từ 67,52 % đến 87,62%, trung bình 77,74% Qua cho thấy xét góc độ phân tử, mức độ tư ng đồng cá thể khơng khác hai nhóm tuổi Điều n y cho thấy s ổn định mức độ đa dạng di truyền qua hệ D a mức tư ng đồng di truyền cặp mẫu, s đồ dạng quan hệ di truyền mẫu quần thể DR xây d ng ại v d a s đồ n y, cá thể thuộc hai nhóm cấp tuổi ớn v nh khơng p nhóm riêng m tạo nhóm nh xếp xen kẽ nhau, số ượng cá thể nhóm tuổi nhóm nh quần thể DR nhiều h n quần thể LD hay nói cách khác cá thể nhóm tuổi p nhóm với rõ h n Điều thể mức độ mức độ biệt hóa hai nhóm tuổi quần thể DR cao h n so với quần thể LD Th c v y, số biệt hóa di truyền hai nhóm tuổi thuộc quần thể DR mức GSTDR = 0,0304, cao h n gần 50% so với quần thể LD Kết tính tốn cho thấy khoảng cách di truyền hai nhóm tuổi ớn v nh quần thể DR đạt mức DDR O-Y = 0,01393, cao h n nhiều so với số tư ng ứng quần thể DL 3.2.4 Kết đánh giá đa dạng di truyền tổng thể taxon nghiên cứu Tổng thể nghiên cứu taxon sâm Lang Bian nghiên cứu n y bao gồm tất cá thể hai quần thể phát Mức độ đa dạng di truyền tổng thể mẫu nghiên cứu d a số dị hợp tử trông đợi đạt đến mức HeT = 0,284 v tỷ ệ band đa hình đạt đến mức PPBT = 97,2% Tư ng đồng di truyền tổng thể mẫu khảo sát cao 89,49%, thấp 52,80%, trung bình 69,37% So cặp mẫu từ hai 19 quần thể cho thấy mức độ tư ng đồng chúng trung bình 60,94%, cao 67,62% v thấp 52,80% S biệt hóa di truyền rõ r ng hai quần thể khảo sát: mức độ tư ng đồng cặp mẫu có nguồn gốc khác quần thể thấp h n hẵn cặp mẫu quần thể Các cặp mẫu tư ng đồng mức cao đến mức 89,49% cho thấy khả n ng thụ phấn chéo cao taxon Việc sử dụng 20 mồi ISSR nghiên cứu cho phép phân tách cá thể thuộc hai quần thể th nh hai nhóm ớn khác s đồ dạng quan hệ di truyền cá thể (hình 3.29) Có thể nh n thấy quan hệ di truyền cá thể tổng thể taxon nghiên cứu chia th nh hai nhánh rõ r ng, nhánh tư ng ứng với quần thể LD v nhánh tư ng ứng với quần thể DR Hình thể nhánh giống hệt với quan hệ phát sinh quần thể LD (* v hình thể nhánh giống hệt với quan hệ phát sinh quần thể DR (** Khoảng cách di truyền hai quần thể LD v DR d a tần số a e e 428 ocus khảo sát DLD-DR = 0,191 ần cho thấy s biệt hóa di truyền ớn hai quần thể Chỉ số biệt hóa di truyền hai quần thể nghiên cứu mức GSTTaxon = 0,221 Theo quan điểm hệ thống học ượng hóa tính biệt hóa di truyền số n y đạt mức cao, s biệt hóa di truyền ớn (de Vicente, 2003 v mức cao so với s biệt hóa quần thể th c v t t nhiên có đặc điểm tư ng t (Nybom v Bartish, 2000 S biệt hóa di truyền trường hợp quần thể taxon nghiên cứu cao so với o i t nhiên có đặc điểm sống cho dù chúng chưa chịu áp c thu hái có nguyên nhân sau: việc thay rừng nguyên sinh rừng Thông ba m thay đổi môi trường sống sâm Lang Bian; oại động v t vốn đóng vai trò phát tán hạt v hạt phấn khu v c nghiên cứu khơng có nhiều s s n bắt người dân v sử dụng thuốc trừ sâu; việc phá rừng, mở rộng khu dân cư v hoạt động canh tác nông nghiệp dẫn đến s ng n cách hai quần thể S chia cắt điều kiện sống hạn chế s trao đổi nguồn gene hai quần thể Kết nghiên cứu dòng di cư thể rõ điều n y số di cư trung bình Nm= 0,8793, xét tổng thể quan sát với số cá thể khảo sát N = 115 tỷ ệ di cư đạt 0,0076, tức xấp xỉ 8‰ cá thể di cư từ quần thể n y sang quần thể khác hệ 20 0.60 0.67 0.73 0.80 0.87 0.93 1.00 Coefficient * Nhánh D1o D3o D5o D8o D6o D7o D4o D9o D10o D11o D12o D13o D15o D23o D24o D20o D27y D33y D34y D35y D36y D17o L10o D29y D39y D40y D41y D42y D43y D16o D18o D25o D26o D32y D28y D30y D21o D48y D19o D38y D45y D47y D49y D50y D10o D14o D22o D51y D44y D46y D31y D37y D2o 0.60 0.67 0.73 0.80 0.87 0.93 1.00 Coefficient ** Nhánh 0.60 0.67 0.73 0.80 0.87 0.93 Các cá thể thuộc quần thể LD L10o Các cá thể thuộc quần thể DR L1o L10o L2o L3o L14y L8o L39o L15y L16y L17y L19y L20y L21y L11o L31o L46y L47y L51y L48y L49y L52y L50y L29o L32y L33y L27y L18y L36o L37o L38o L24o L30y L59o L60o L61o L62y L63y L64y L41o L42o L43o L44o L34o L35o L5o L7y L6y L4y L12y L13y L45o L53y L57o L58o L9y L22o L25o L40o L23o L26y L28y L55o L56o L54y D1o D3o D5o D8o D6o D7o D4o D9o D10o D11o D12o D13o D15o D23o D24o D20o D27y D33y D34y D35y D36y D17o D29y D39y D40y D41y D42y D43y D16o D18o D25o D26o D32y D28y D30y D21o D48y D19o D38y D45y D47y D49y D50y D14o D22o D51y D44y D46y D31y D37y D2o L1o L10o L2o L3o L14y L8o L39o L15y L16y L17y L19y L20y L21y L11o L31o L46y L47y L51y L52y L48y L49y L50y L29o L32y L33y L27y L18y L36o L37o L38o L24o L30y L59o L60o L61o L62y L63y L64y L41o L42o L43o L44o L34o L35o L5o L7y L6y L4y L12y L13y L45o L57o L53y L58o L9y L22o L25o L40o L23o L26y L28y L55o L56o L54y 1.00 Coefficient Hình 3.29: Sơ đồ dạng quan hệ di truyền cá thể tổng thể nghiên cứu 3.3 Kết nghiên cứu phân tích sơ thành phần saponin sâm Lang Bian số taxon chi khác 21 Kết phân tích s th nh phần saponin theo phư ng pháp sắc ký ớp m ng mẫu đại diện cho taxon thể qua sắc đồ sắc ký ớp m ng saponin: PS PSDL PVF PV PVL G-Rb1 G-Rg1 G-Rd G-Re N-R1 M-R2 Hình 3.31 Sắc đồ sắc ký lớp mỏng saponin taxon đƣợc khảo sát chất chuẩn Từ sắc đồ nói trên, th nh phần saponin đặc trưng taxon thể qua bảng sau: Bảng 3.27 Thành phần saponin theo chất chuẩn mẫu khảo sát Rf PVL PV PVF PS PSDL G-Rb1 0,32   × × × G-Rg1 0,67   × × × G-Rd 0,48   × × × G-Re 0,55   × × × N-R1 0,53 × × × × × M-R2 0,60   × × × Ghi chú: ×: có xuất vết, : không xuất vết D a hoạt chất so sánh, taxon sâm Lang Bian phân bố Lâm Đồng (PVL) có hoạt chất sau: G-Rb1, G-Re, N-R1, G-Rd, G-Rg1 v M-R2 PVL giống ho n to n với PV v PVF, khác với PS v PSDL s thiếu vắng G-Rb1, G-Re, G-Rd, G-Rg1 v M-R2 taxon n y Ngo i ra, thông qua sắc đồ sắc ký ớp m ng, không d a chất chuẩn xác định từ trước với phư ng pháp chiết tiến h nh nghiên cứu n y, nh n thất s sai khác định th nh phần sản phẩm chiết thơng qua hình thể vết sắc ký taxon so sánh Đặc điểm tạo vết sắc đồ sắc ký m ng taxon Panax phân bố t 22 nhiên Lâm Đồng có s khác biệt so với taxon khác Tuy nhiên, hai taxon PS v PSDL, hình thể vết sắc ký gần tư ng đồng ho n to n, điều n y ần ại bổ sung iệu mặt hóa học để nhìn nh n chúng thuộc o i KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Kết hợp kết nghiên cứu quan hệ phát sinh chủng oại d a iệu hình thái so sánh với trình t DNA bảo thủ cho phép khẳng định sâm Lang Bian thứ o i Panax vietnamensis Ha et Grushv var vietnamensis v đặt tên khoa học Panax vietnamensis Ha & Grushvitzky var langbianensis N.V Duy, V.T Tran & L.N Trieu, tên tiếng Việt đề xuất sâm Lang Bian Tổng thể taxon sâm Lang Bian gồm hai quần thể LD v DR phát trình điều tra, phân tách s đồ quan hệ phát sinh cá thể Chỉ số đa dạng gene v tỷ ệ band đa hình tổng thể taxon mức cao: HeT = 0,284 v PPBT = 97,2 %, mức độ tư ng đồng di truyền cá thể khoảng 52,80% đến 89,49%, trung bình 69,37% S biệt hóa gene hai quần thể LD v DR thuộc tổng thể đạt đến mức GSTTaxon = 0,221 v khoảng cách di truyền chúng ên đến DLDNm= DR = 0,191 Chỉ số di cư trung bình tổng thể taxon nghiên cứu 0,8793 Quần thể LD có HeLD = 0,228, PPBLD O = 77,1%, mức độ tư ng đồng di truyền cá thể trung bình 77,80% Nhóm tuổi ớn có mức độ đa dạng di truyền cao h n nhóm tuổi nh Chỉ số biệt hóa di truyền hai nhóm tuổi v khoảng cách di truyền chúng thấp Quần thể DR có HeDR = 0,213, PPBDR = 79,4%, mức độ tư ng đồng di truyền cá thể trung bình 77,65% Nhóm tuổi ớn có mức độ đa dạng di truyền tư ng đư ng nhóm tuổi nh Chỉ số biệt hóa hai nhóm tuổi v khoảng cách di truyền chúng cao h n so với quần thể LD 23 D a hoạt chất khảo sát, taxon Panax vietnamensis var langbianensis phân bố Lâm Đồng có hoạt chất sau: G-Rb1, G-Re, NR1, G-Rd, G-Rg1 v M-R2 Taxon P vietnamensis var langbianensis giống với P vietnamensis v P vietnamensis var fuscidiscus, khác với hai biến thể chét nguyên v chét xẻ thuộc taxon Panax stipuleanatus s thiếu vắng G-Rb1, G-Re, G-Rd, G-Rg1 v M-R2 hai taxon n y Kiến ngh Cần bổ sung taxon th c v t m loại dược liệu Panax vietnamensis var langbianensis v o danh lục th c v t, danh lục thuốc v Sách đ Việt Nam, hiệu chỉnh tên o i biến thể chét xẻ o i P stipuleanatus t i iệu n y c sở kết nghiên cứu phân oại v quan hệ phát sinh từ lu n án Cần nghiên cứu thêm để m rõ vị trí phân oại biến thể chét xẻ o i P stipuleanatus Việt Nam Cần hoạch định chiến ược khoanh vùng bảo vệ, bảo tồn, phát triển Sâm Lang Bian c sở kết nghiên cứu đa dạng v biến động di truyền quần thể u n án Cần nghiên cứu biện pháp nhân giống, gây trồng v nghiên cứu chuyên sâu th nh phần hoạt chất v tác dụng dược ý sâm Lang Bian để phát triển, khai thác v sử dụng nguồn t i nguyên hiệu theo hướng bền vững 24 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Trieu L.N., Mien N.T., Tien T.V., Ket N.V & Duy N.V (2016), “Genetic diversity of Panax stipuleanatus Tsai in North Vietnam detected by Inter simp e sequence repeat (ISSR markers”, Biotechnology & Biotechnological Equipment, 30(3): 506-:511 Duy N.V., Trieu L.N., Chinh N.D., Tien T.V (2016 , “ new variety of Panax (Araliaceae) from Lam Vien Plateau, Vietnam and its molecular evidence”, Phytotaxa 277(1): 047-058 Trieu L.N., Duy N.V., Quy T.D., Ket N.V., Tien T.V (2016 , “Genetic diversity of Panax vietnamensis var langbianensis populations in Lam Vien plateau - Vietnam detected by Inter simple sequence repeat (ISSR) markers”, Academia Journal of Biotechnology (Đã chấp nh n đ ng, chờ in ... cần nghiên cứu tính đa dạng v biến động di truyền m c sở cho việc bảo tồn v phát triển Từ đó, đề t i Nghiên cứu phân loại đánh giá đa dạng di truyền quần thể sâm (Panax sp. ) phân bố tự nhiên Lâm. .. pháp nghiên cứu phân loại, khảo sát quan hệ phát sinh chủng loại taxon đánh giá đa dạng di truyền quần thể thực vật Các phư ng pháp nghiên cứu phân oại, quan hệ phát sinh chủng oại, đánh giá đa dạng. .. thị đa hình đủ để đánh giá đa dạng di truyền hai mức độ: v quần thể o i thuộc chi Panax Việc khảo sát đa dạng di truyền quần thể nghiên cứu trình b y xoay quanh tiêu chí: mức độ tư ng đồng di truyền